專利名稱:一類新型的二氫黃酮醇類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于有機化學和藥物化學領域，具體而言，本發(fā)明涉及具有抗乙型肝炎病毒，抗氧化作用，保肝護肝，抗真菌感染和防治腫瘤的一類新型的5，6，7-三氧取代的二氫黃酮醇化合物及其制備方法和用途。
背景技術：
二氫黃酮醇廣泛存在于天然產物中，對于其活性的研究今年來逐漸趨向于活躍。近來的研究表明，二氫黃酮醇具有抗氧化，抗真菌和抗腫瘤等活性(Yeom，Seung-Hwan等，Saengyak Hakhoechi(2003)，34(4)，344-351；Piccinelli，AL等，Journalof Agricultural and Food Chemistry(2004)，52(19)，5863-5868)。近來對于其抗氧化活性進行的研究表明可提高小鼠紅細胞、肝臟和心肌SOD(超氧化物岐化酶)活性，降低血漿、肝臟和心臟的LPO(脂質過氧化合物)水平，降低腦水腫動物血、腦組織中LPO含量，提高動物血、腦組織中SOD，對小鼠過氧化損傷有較強的抗氧化作用。北美甘草Glycyrrhiza lepidota中提取得到的二氫黃酮醇glepidotin B對于白假絲酵母具有較好的抑菌活性(MIC50μg/ml)。還有研究表明二氫黃酮醇類化合物能增加SD大鼠GSHPx酶活性，減少MDA的含量，降低體內脂質過氧化水平，說明其對DMBA誘發(fā)大鼠乳腺腫瘤具有抑制作用。此外，二氫黃酮醇類化合物還被報道具有一定的抗病毒作用(Chu S.C.等，Journal of Natural Products(1992)，55(2)，179-83)。然而天然界存在的二氫黃酮醇類化合物并不太多，且難以得到。這一類天然存在的二氫黃酮醇類化合物一般以5，7-二氧取代者較為多見。而5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物未見報道。為了探討此類全新結構的二氫黃酮醇的活性規(guī)律，并為了發(fā)現(xiàn)活性更好的具有二氫黃酮醇骨架的化學藥物，需要有更多的結構與活性相結合的實例。
據(jù)此我們設計并制備出一類結構全新的5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物，并對其抑制人體乙肝病毒脫氧核糖核酸HBVDNA活性、降低乙肝病毒表面抗原HBsAg和乙肝e抗原HBeAg的活性、體外清除超氧化自由基、抑制自由基誘導的脂過氧化物生成的活性、對四氯化碳致大鼠肝細胞損傷體內模型以及體外模型、大鼠原代肝細胞損傷保護活性，以及抗真菌活性進行了測試。
本發(fā)明涉及一類全新結構的二氫黃酮醇類衍生物，它具有抑制乙肝病毒表面抗原、乙肝e抗原和乙肝病毒脫氧核糖核酸分泌及復制活性、清除超氧自由基活性、抑制自由基誘導的脂過氧化物生成的活性、對大鼠體內外化學致肝損傷具肝細胞保護活性，并具有抑制真菌生長活性，可以預期發(fā)展成為防治乙型病毒性肝炎藥物或保健品、保肝護肝藥物或保健品、治療真菌感染類藥物或保健品以及成為防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供了一種式(1)所示的5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物及其可藥用鹽或其溶劑化物 式(1)其中R1，R2和R3可以相同或者不同，分別選自氫或含1-8個碳的烷基；R4，R5，R6可以是取代在苯環(huán)(B環(huán))任意位置，R4，R5，R6可以相同或不同，分別選自氫、1-8個碳的烷基、鹵素、硝基，1-8個碳的烷氧基，或氨基，R4，R5和/或R6可以與苯環(huán)稠合形成取代或未取代的稠環(huán)化合物；R7一般為氫，也可以是可供藥用的金屬鹽基如鈉鹽、鎂鹽離子。式(1)中2，3位的立體構型分別是或同時是R或者S構型；式(1)化合物包括經柱層析、重結晶等方法純化后的光學活性化合物，也包括未經純化且具有同一平面結構的立體異構體的混合物。
本發(fā)明的另一目的是提供了制備式(1)化合物的方法；本發(fā)明的再一目的是提供了式(1)化合物用于制備防治乙型病毒性肝炎藥物、治療真菌感染類藥物、保肝護肝藥物以及成為防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物的用途；本發(fā)明的又一目的是提供了含有式(1)化合物的用于防治乙型病毒性肝炎藥物、治療真菌感染類藥物、保肝護肝藥物以及成為防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物。
本發(fā)明提供了一種具有式(1)所示的5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物及其可藥用鹽或其溶劑化物
式(1)其中R1，R2，R3和R7可以相同或者不同，分別選自氫或含1-8個碳的烷基；1-8個碳的烷氧?；蛘叻蓟；?；或是可以藥用的鹽基，如鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽，硫酸鈉鹽，硫酸鉀鹽，磺酸鈉鹽，磺酸鉀鹽等；R4，R5，R6可以是取代在苯環(huán)(B環(huán))任意位置，R4，R5，R6可以相同或不同，分別選自氫、1-8個碳的烷基、鹵素、硝基，1-8個碳的烷氧基，或氨基，R4，R5和/或R6可以與苯環(huán)稠合形成取代或未取代的稠環(huán)化合物；本發(fā)明優(yōu)選的式(1)化合物包括化合物1-a3，4′-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-b3-羥基-5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-c3-羥基-4′-甲基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-d3，4′-二羥基-5，6，7，3′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-e3，3′-二羥基-5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-f3-羥基-5，6，7，3′，4′-五甲氧基二氫黃酮；化合物1-g3-羥基-5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基二氫黃酮；化合物1-h4′-氯-3-羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-i3，3′，4′-三羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-j3′，4′-亞甲二氧基-3-羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-k5，7-二甲氧基-3，6，4′-三羥基二氫黃酮；化合物1-l3，6-二羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-m3，6-二羥基-4′-甲基-5，7，-二甲氧基二氫黃酮；化合物1-n3，6，4′-三羥基-5，7，3′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-o3，6，3′-三羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-p3，6-二羥基-5，7，3′，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-q3，6-二羥基-5，7，3′，4′，5′-五甲氧基二氫黃酮；化合物1-r4′-氯-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮；化合物1-s5，7-二甲氧基-3，6，3′，4′-四羥基二氫黃酮；化合物1-t3′，4′-亞甲二氧基-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮；化合物I-u2′，3-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；
化合物I-v3，4′-二羥基-5，6，7，3′，5′-五甲氧基二氫黃酮。
本發(fā)明的另一目的是提供了式(1)化合物的全合成方法，該方法的合成工藝路線特征是以化合物6-羥基-2，3，4-三烷氧基苯乙酮I-1為起始原料，在有機溶劑和堿水溶液中，以相轉移催化劑催化，用氯甲醚作保護劑，得到羥基保護的產物6-甲氧甲氧基-2，3，4-三烷氧基苯乙酮I-2，在氫氧化鉀甲醇溶液中，產物與取代的醛I-3縮合得到查爾酮，其環(huán)氧化產物I-4在酸性醇溶液中攪拌得到化合物1，具體流程如下所示
其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7的定義與式(1)化合物定義相同。堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，醇為甲醇，乙醇，丙醇，丁醇。酸為鹽酸，硫酸或醋酸。
原料化合物的制備本發(fā)明的另一特點是提供了制備式1化合物的中間體，這些化合物是新結構化合物，他們構成本發(fā)明的另一特征。該中間體化合物包括式I-2，式I-4和式I-5所包括的化合物。
下面的方法給出了代表性中間體化合物的具體制備例和實施例。實施例給出了代表性化合物的制備方法和部分譜學數(shù)據(jù)。這些實施例是為了說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行簡單的改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
中間體I-2(6-甲氧基甲基-2，3，4-三氧取代基苯乙酮)的制備 其中，R1，R2，R3的定義與式(1)化合物定義相同。
實施例1化合物I-2-1(6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基苯乙酮)的制備 1.5克6-羥基-2，3，4-三甲氧基苯乙酮溶解于20毫升二氯甲烷中，再加入溶有1.5克氫氧化鈉得20毫升水和0.4克四丁基溴化銨，攪拌降溫到0℃，緩慢加入1.5毫升重蒸過的氯甲醚，于室溫攪拌十二小時，靜置，分出有機層，水層用10毫升二氯甲烷提取三次后合并，用飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘余物經柱層析得淺黃色油狀物1.4克，收率80％。Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)0.21，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ2.56(s，3H，CH3)，3.78(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.15(s，2H，OCH2O)，6.35(s，1H，H-3)。
實施例2化合物I-2-2(2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基苯乙酮)的制備
1.76克3，6-二羥基-2，4-二甲氧基苯乙酮溶解于20毫升二氯甲烷中，再加入溶有1.5克氫氧化鈉得20毫升水和0.4克四丁基溴化銨，攪拌降溫到0℃，緩慢加入1.5毫升重蒸過的氯甲醚，于室溫攪拌十二小時，靜置，分出有機層，水層用10毫升二氯甲烷提取三次后合并，用飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘余物經柱層析得淺黃色油狀物1.63克，收率82％。Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)0.30，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ2.48(s，3H，CH3)，3.60(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，5.05(s，2H，OCH2O)，5.15(s，2H，OCH2O)，6.54(s，1H，H-5)。
中間體I-4(6-二甲氧甲氧基-2，3，4-三氧取代基查爾酮)的制備 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6的定義與式(1)化合物定義相同。
實施例3化合物I-4-1(6，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備 1.6克I-2-1溶解于溶有0.5克氫氧化鉀的60毫升甲醇中，再加入1.5克對甲氧甲氧基苯甲醛，于室溫攪拌8小時后減壓蒸去溶劑，殘余物中加入30毫升水，用20毫升乙酸乙酯提取三次，合并有機相后用飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經注層析得到淺黃色油狀物2.1克，收率84％。
Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.13；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.47(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.20(s，2H，OCH2O)，6.57(s，1H，H-5)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.27(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.48(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
根據(jù)與實施例3相同的方法，制備得到以下化合物
實施例4化合物I-4-2(6-甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.45(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.82(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，5.21(s，2H，OCH2O)，6.55(s，1H，H-5)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.01(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.25(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.45(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝389。
實施例5化合物I-4-3(4′-甲基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.16；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ2.30(s，3H，CH3)，3.42(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.81(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.21(s，2H，OCH2O)，6.55(s，1H，H-5)，6.85(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.99(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.05(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.25(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝373。
實施例6化合物I-4-4(6，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′-四甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.48(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.81(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.08(s，2H，OCH2O)，5.22(s，2H，OCH2O)，6.60(s，1H，H-5′)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.85(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.03(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H，H-6′)，7.05(d，J＝1.6Hz，1H，H-2′)，7.20(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝449。
實施例7化合物I-4-5(6，3′-二甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.10；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.52(s，3H，OCH3)，3.81(s，3H，OCH3)，3.82(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.02(s，2H，OCH2O)，5.20(s，2H，OCH2O)，6.61(s，1H，H-5)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.88(d，J＝16.0Hz 1H，H-α)，7.03(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-6′)，7.04(d，J＝2.0，1H，H-2)，7.24(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS(m/z)[M+1]+＝449。
實施例8化合物I-4-6(6-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′-五甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.44(s，3H，OCH3)，3.60(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.82(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.08(s，2H，OCH2O)，6.59(s，1H，H-5)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.87(d，J＝16.0Hz 1H，H-α)，7.01(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-6′)，7.08(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，7.28(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例9化合物I-4-7(6-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′，5′-六甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.13；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.42(s，3H，OCH3)，3.78(s，3H，OCH3)，3.81(s，3H，OCH3)，3.83(s，6H，OCH3)，3.86(s，6H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，5.15(s，2H，OCH2O)，6.62(s，1H，H-5)，6.73(s，2H，H-2′，6′)，6.85(d，J＝16.0Hz 1H，H-α)，7.28(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝449。
實施例10化合物I-4-8(4′-氯-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.16；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，6.55(s，1H，H-5)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.91(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.18(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝393。
實施例11化合物I-4-9(6，3′，4′-三甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.15；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.45(s，3H，OCH3)，3.47(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.21(s，2H，OCH2O)，5.22(s，2H，OCH2O)，6.63(s，1H，H-5)，6.87(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.03(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-6)，7.06(dd，J＝8.0，2.0，1H，H-2)，7.12(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，7.33(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS(m/z)[M+1]+＝479。
實施例12化合物I-4-10(3′，4′-亞甲二氧基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.55(s，3H，OCH3)，3.47(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，5.08(s，2H，OCH2O)，6.00(s，2H，OCH2O)，6.62(s，1H，H-5)，6.82(d，J＝8.0Hz，1H，H-5)，6.79(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.82(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.01(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，H-2)，7.04(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，7.30(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS(m/z)[M+1]+＝403。
實施例13化合物I-4-11(2，4-二甲氧基-3，6，4′-三甲氧甲氧基查爾酮)的制備 1.78克I-2-2溶解于溶有0.5克氫氧化鉀的60毫升甲醇中，再加入1.5克對甲氧甲氧基苯甲醛，于室溫攪拌8小時后減壓蒸去溶劑，殘余物中加入30毫升水，用20毫升乙酸乙酯提取三次，合并有機相后用飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經柱層析得到淺黃色油狀物2.0克，收率75％。Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.18；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.47(s，3H，OCH3)，3.60(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.08(s，4H，OCH2O)，5.20(s，2H，OCH2O)，6.59(s，1H，H-5′)，6.88(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.02(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.31(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.47(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝449。
根據(jù)與實施例13相同的方法，制備得到以下化合物實施例14化合物I-4-12(3，6-二甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.17；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.60(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.08(s，2H，OCH2O)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.11(s，2H，OCH2O)，6.59(s，1H，H-5′)，6.87(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.88(d，J＝8.0Hz，2H，H-3，5)，7.31(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.47(d，J＝8.0Hz，2H，H-2，6)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例15化合物I-4-13(4′-甲基-3，6-二甲氧甲氧基-2，4-二甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.19；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)2.34(s，3H，CH3)，δ3.40(s，3H，OCH3)，3.61(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，5.07(s，2H，OCH2O)，5.09(s，2H，OCH2O)，6.59(s，1H，H-5)，6.85(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.86(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.32(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.44(d，J＝8.0Hz，2H，H-2，6)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝403。
實施例16化合物I-4-14(3，6，4′-三甲氧甲氧基-2，4，3′-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.50(s，3H，OCH3)，3.60(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.11(s，2H，OCH2O)，5.26(s，2H，OCH2O)，6.60(s，1H，H-5)，6.88(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.06-7.15(m，3H，Ar-H)，7.29(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝479。
實施例17化合物I-4-15(3，6，3′-三甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基查爾酮)Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.52(s，3H，OCH3)，3.61(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.23(s，2H，OCH2O)，6.59(s，1H，H-5)，6.85(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.86(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，7.17(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，H-6)，7.28(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.36(d，J＝2Hz，1H，H-2)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝479。
實施例18化合物I-4-16(3，6-二甲氧甲氧基-2，4，3′，4′-四甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.61(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.89(3，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.25(s，2H，OCH2O)，6.60(s，1H，H-5)，6.85(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H，H-5′)，6.87(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.06(d，J＝1.6Hz，1H，H-2)，7.08(d，J＝8.0Hz，1H，H-6)，7.29(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝449。
實施例19化合物I-4-17(3，6-二甲氧甲氧基-2，4，3′，4′，5′-五甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.62(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.87(s，6H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.25(s，2H，OCH2O)，6.60(s，1H，H-5)，6.75(s，2H，H-2′，6′)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.25(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)；ESI-MS(m/z)[M+1]+＝479。
實施例20化合物I-4-18(4′-氯-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.41(s，3H，OCH3)，3.47(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.12(s，2H，OCH2O)，6.58(s，1H，H-5)，6.85(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，7.00(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.22(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，7.43(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝423。
實施例21化合物I-4-19(2，4-二甲氧基-3，6，3′，4′-四甲氧甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.13；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.48(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.11(s，2H，OCH2O)，5.23(s，2H，OCH2O)，5.25(s，2H，OCH2O)，6.62(s，1H，H-5)，6.85(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-5)，6.89(d，J＝16Hz，1H，H-α)，7.08(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，7.09(d，J＝8Hz，1H-6′)，7.30(d，J＝16Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝509。
實施例22化合物I-4-20(3′，4′-亞甲二氧基-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.40(s，3H，OCH3)，3.44(s，3H，OCH3)，3.46(s，3H，OCH3)，3.61(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.26(s，4H，OCH2O)，6.58(s，1H，H-5)，6.83(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-5′)，6.86(d，J＝16Hz，1H，H-α)，7.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，7.04(d，J＝8Hz，1H，H-6′)，7.30(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝433。
實施例23化合物I-4-21(6，2′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.30；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.42(s，3H，OCH3)，3.43(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.09(s，2H，OCH2O)，5.19(s，2H，OCH2O)，6.58(s，1H，H-5)，7.05(d，J＝16Hz，1H，H-α)，6.99-7.57(m，4H，Ar-H)，7.73(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例24化合物I-4-V(6，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′，5′-五甲氧基查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.43(s，3H，OCH3)，3.44(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.85(s，6H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，5.10(s，2H，OCH2O)，5.15(s，2H，OCH2O)，6.96(s，1H，H-5)，6.30(s，2H，H-2′，6′)，7.05(d，J＝16Hz，1H，H-α)，7.73(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝479。
中間體I-56-羥基-2，4-二甲氧基苯乙酮的制備 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6的定義與式(1)化合物定義相同。
實施例25化合物I-5-1(6，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備 1克I-4-1溶解于25毫升甲醇中，再加入1.5毫升2N氫氧化鈉溶液和1.5毫升30％過氧化氫，于室溫攪拌8小時，減壓蒸去溶劑，殘留物甲入10毫升水，用乙酸乙酯提取三次，合并有機相，飽和食鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾濃縮，得淺黃色油狀物，0.9克，收率87％，直接用于下一步反應。
Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.15，λMeOH max＝212，257nm，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝435。
根據(jù)與實施例25相同的方法，得到以下化合物實施例26化合物I-5-2(6-甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.15，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝405。
實施例27化合物I-5-3(4′-甲基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.16，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝389。
實施例28化合物I-5-4(4′，6-二甲氧甲氧基-3′，2，3，4-四甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝465。
實施例29化合物I-5-5(6，3′-二甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.10，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝465。
實施例30化合物I-5-6(6-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′-五甲氧環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝435。
實施例31化合物I-5-7(6-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′，5′-六甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.13，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝465。
實施例32化合物I-5-8(4′-氯-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.16，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝409。
實施例33化合物I-5-9(6，3′，4′-三甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.15，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝435。
實施例34化合物I-5-10(3′，4′-亞甲二氧基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.14，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例35化合物I-5-11(2，4-二甲氧基-3，6，4′-三甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.18，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝465。
實施例36化合物I-5-12(3，6-二甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.17，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝435。
實施例37化合物I-5-13(4′-甲基-3，6-二甲氧甲氧基-2，4-二甲氧環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.19，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例38化合物I-5-14(3，6，4′-三甲氧甲氧基-2，4，3′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝495。
實施例39化合物I-5-15(3，6，3′-三甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝495。
實施例40化合物I-5-16(3，6-二甲氧甲氧基-2，4，3′，4′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝465。
實施例41化合物I-5-17(3，6-三甲氧甲氧基-2，4，3′，4′，5′-五甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝495。
實施例42化合物I-5-18(4′-氯-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.14，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝439。
實施例43化合物I-5-19(2，4-二甲氧基-3，6，3′，4′-四甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.13，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝525。
實施例44化合物I-5-20(3′，4′-亞甲二氧基-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.17，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝419。
實施例45化合物I-5-21(6，2′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.30，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝435。
實施例46化合物I-5-22(6，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′，5′-五甲氧基環(huán)氧查爾酮)的制備Rf(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)＝0.12，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝495。
實施例47化合物1-a(3，4′-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮)的制備 1克化合物I-4-1溶解于10毫升甲醇和8毫升四氫呋喃中，攪拌，加入2毫升濃鹽酸，于50-55℃之間保溫20分鐘后減壓蒸去溶劑，加10毫升水，用乙酸乙酯提取，合并有機相，水洗，硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，殘余物經柱層析得淺黃色粉末0.47克，收率60％。Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.11；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.70(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，4.47(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.37(s，1H，H-8)，6.86(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.38(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝347。
根據(jù)實施例47的方法，制備得到以下化合物實施例48化合物1-b(3-羥基-5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.25；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.68(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，4.45(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.91(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.36(s，1H，H-8)，6.90(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.45(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝361。
實施例49化合物1-c(3-羥基-4′-甲基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.27；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ2.32(s，3H，CH3)，3.82(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，4.47(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.93(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.34(s，1H，H-8)，6.97(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.22(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝345。
實施例50化合物1-d(3，4′-二羥基5，6，7，3′-四甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.83(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，4.52(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.08(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.33(s，1H，H-8)，6.80(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.88(dd，J＝1.8，8.0Hz，1H，H-6′)，7.05(d，J＝1.8Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝377。
實施例51化合物1-e(3，3′-二羥基5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.84(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，4.50(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.05(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.30(s，1H，H-8)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.86(dd，J＝1.8，8.0Hz，1H，H-6′)，7.04(d，J＝1.8Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝377。
實施例52化合物1-f(3-羥基-5，6，7，3′，4′-五甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.84(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，4.55(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.06(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，6.88(d，J＝8.8Hz，1H，H-5′)，6.94(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H，H-6′)，7.04(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝391。
實施例53化合物1-g(3-羥基-5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.12；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.83(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.89(s，6H，OCH3)，3.92(s，3H，OCH3)，4.56(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.37(s，1H，H-8)，6.92(s，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝421。
實施例54化合物1-h(4′-氯-3-羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.16；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.84(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，4.41(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.89(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.32(s，1H，H-8)，6.87(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.18(d，J＝8.0Hz，1H，H-2′，6′)；ESI-MS(m/z)[M+1]＝365。
實施例55化合物1-I(3，3′，4′-三羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶4∶0.25)＝0.13；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.83(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，4.40(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，4.88(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.37(s，1H，H-8)，6.85(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.89(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，H-6′)，7.06(d，J＝2Hz，1H，H-2′)；ESI-MS(m/z)[M+1]＝363。
實施例56化合物1-j(3-羥基-5，6，7，3′，4′-五甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.20；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.86(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.92(s，3H，OCH3)，4.50(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，5.09(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.96(s，1H，OCH2O)，6.32(s，1H，H-8)，6.82(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.88(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，H-6′)，7.00(d，J＝2Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝391。
實施例57化合物1-k(5，7-二甲氧基-3，6，4′-三羥基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.86(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.92(s，3H，OCH3)，4.50(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.09(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，5.96(s，1H，OCH2O)，6.32(s，1H，H-8)，6.82(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.88(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H，H-6′)，7.00(d，J＝2Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝333。
實施例58化合物1-l(3，6-二羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.16；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.84(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，3.98(s，3H，OCH3)，4.50(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，5.00(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，6.98(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.48(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝347。
實施例59化合物1-m(3，6-二羥基-4′-甲基-5，7-二甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.19；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ2.35(s，3H，CH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.89(s，3H，OCH3)，4.53(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，5.02(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，6.89(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.18(d，J＝8.0Hz，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝331。
實施例60化合物1-n(3，6，4′-三羥基-5，7，3′-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶4∶0.25)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.86(s，3H，OCH3)，3.94(s，3H，OCH3)，3.98(s，3H，OCH3)，4.55(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.07(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.37(s，1H，H-8)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.89(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-6′)，7.05(d，J＝2.0Hz，2H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝363。
實施例61化合物1-o(3，6，3′-三羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶3∶0.25)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.85(s，3H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，3.97(s，3H，OCH3)，4.53(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，6.80(d，J＝8.0Hz，1H，H-5′)，6.85(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H，H-6′)，7.00(d，J，2.0Hz，2H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝363。
實施例62化合物1-p(3，6，-二羥基-5，7，3′，4′-四甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.14；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.80(s，3H，OCH3)，3.82(s，3H，OCH3)，3.94(s，3H，OCH3)，3.98(s，3H，OCH3)，4.57(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.09(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.39(s，1H，H-8)，6.92(d，J＝8.4Hz，1H，H-5′)，6.96(dd，J＝8.4，1.6Hz，1H，H-6′)，7.06(d，J＝1.6Hz，2H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝363。
實施例63化合物1-q(3，6，-二羥基-5，7，3′，4′，5′-五甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.13；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.80(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.92(s，6H，OCH3)，3.98(s，3H，OCH3)，4.56(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.01(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.41(s，1H，H-8)，6.55(s，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝377。
實施例64化合物1-r(4′-氯-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶1∶0.25)＝0.16；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.89(s，3H，OCH3)，3.93(s，3H，OCH3)，4.47(d，J＝12.0Hz，1H，H-3)，4.95(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H，H-3′，5′)，7.52(d，J＝8.0Hz，1H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝351。
實施例65化合物1-s(5，7-二甲氧基-3，6，3′，4′-四羥基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶4∶0.25)＝0.11；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.84(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)，3.92(s，3H，OCH3)，4.48(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，5.00(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.36(s，1H，H-8)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H，H-5′)，6.90(dd，J＝2.0，8.4Hz，H-6′)，6.96(d，J＝2.0Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝349。
實施例66化合物1-t(3′，4′-亞甲二氧基-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.21；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.92(s，3H，OCH3)，3.94(s，3H，OCH3)，4.56(d，J＝1.2Hz，1H，H-3)，5.26(d，J＝1.2Hz，1H，H-2)，5.96(s，2H，OCH2O)，6.35(s，1H，H-8)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H，H-5′)，6.91(dd，J＝1.2，8.4Hz，H-6′)，7.01(d，J＝1.2Hz，1H，H-2′)，ESI-MS(m/z)[M+1]＝361。
實施例67化合物I-u(3，2′-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶4∶0.25)＝0.11；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.75(s，3H，OCH3)，3.83(s，3H，OCH3)，3.85(s，3H，OCH3)，4.43(d，J＝2.0Hz，1H，H-3)，4.97(d，J＝2.0Hz，1H，H-2)，6.35(s，1H，H-8)，6.71-7.15(m，4H，Ar-H)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝347。
實施例68化合物I-v(3，4′-二羥基-5，6，7，3′，5′-五甲氧基二氫黃酮)的制備Rf(氯仿/乙酸乙酯/甲酸＝25∶2∶0.25)＝0.21；1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ3.86(s，3H，OCH3)，3.88(s，6H，OCH3)，3.90(s，6H，OCH3)，3.93(s，6H，OCH3)，4.53(d，J＝1.2Hz，1H，H-3)，5.20(d，J＝1.2Hz，1H，H-2)，6.33(s，1H，H-8)，6.91(s，2H，H-2′，6′)，ESI-MS(m/z)[M+1]+＝407。
式(1)化合物具有重要的生物活性。該類化合物(具體見藥理實施例)具有抑制人體乙肝病毒脫氧核糖核酸HBVDNA以及降低乙肝病毒表面抗原HBsAg和乙肝e抗原HBeAg的活性，從而可以預期作為治療病毒性乙型肝炎及相關病毒性疾病的藥物。此類二氫黃酮醇類化合物(具體見藥理實施例)顯示出具有體外清除超氧化自由基、抑制自由基誘導的脂過氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關的其他生理改變或疾病的藥物。本發(fā)明還對該類化合物對四氯化碳致大鼠原代肝細胞損傷體內模型以及體外模型進行了肝細胞損傷保護活性篩選。該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有保護肝細胞的作用。從而可以預期成為保肝、治療肝損傷疾病類藥物。此外，此類二氫黃酮醇類化合物及其中間體系列化合物還被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性的作用，因而可以預期作為治療真菌感染類疾病的藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結合，制備得到具有保護肝細胞急性和慢性損傷活性從而可以用于預防以及治療肝臟臟疾病的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結合，制備得到具有抑制乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原以及抑制乙肝病毒脫氧核糖核酸復制活性，從而可以用于預防以及治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的治療乙型病毒性肝炎藥物如阿昔絡韋、拉米呋啶、干擾素、阿德福韋酯、恩替卡偉等聯(lián)合使用，制備得到具有治療乙型病毒性肝炎的藥物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的肝臟保護及肝病治療藥物藥物如聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、水飛薊賓葡甲胺、齊墩果酸、二氯乙酸二異丙胺、原卟啉鈉(protoporphyrin disodium)、馬洛替酯(malotilate)、熊去氧膽酸等聯(lián)合使用，制備得到具有保護肝臟活性的組合物，可用于治療急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝及中毒性肝損傷疾病藥品。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結合，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化組合物，可用于治療一些病變過程中產生自由基的疾病，如炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化藥物組合物，用于治療上述疾病。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結合，制備得到具有抑制真菌生長活性，從而可以用于治療真菌感染類疾病的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗真菌感染藥物如兩性霉素(amphotericin B)、球紅霉素(globlrubermycin)、美帊曲星(mepartricin)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、益康唑(econazole)、噻康唑(tioconazole)、硫康唑(sulconazole)、布康唑(butoconazole)、聯(lián)苯芐唑(bifonazole)、芬替康唑(fenticonazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、阿莫羅芬(amorolfine)等藥物聯(lián)合使用，制備得到具有抗真菌活性藥物組合物，用于治療該類疾病。此類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明中所述劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑和軟膏劑以及各種緩釋、控釋劑型都可以根據(jù)現(xiàn)已公認的藥劑學常識常規(guī)制備而得，在這些公知知識和技術基礎上制備出的含有本發(fā)明權利要求
化合物的藥物或藥物組合物其他劑型都在本發(fā)明的保護范圍內。
為了更好地理解本發(fā)明的實質和本發(fā)明所述化合物在藥物開發(fā)上的應用前景，下面以藥理實施例形式分別用本發(fā)明中制備出的化合物對乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抑制活性、對乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制試驗、對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制試驗、對過氧化氫致大鼠原代肝細胞損傷保護活性、對大鼠急性四氯化碳肝損傷(動物體內肝損傷模型)保護活性、體外清除超氧化自由基、抑制自由基誘導的脂過氧化物生成的活性和體外抗真菌的藥理實驗結果，說明其在制藥領域中的新用途。藥理實施例給出了代表性化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的藥理實施例及所采用的藥效學模型是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進，以及在本發(fā)明實施例所涵蓋的病因基礎上的簡易擴充的其他適應癥都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
藥理實施例1化合物1-r對乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抑制活性1、材料與方法1.1儀器與試劑PE7700自動熒光PCR儀，美國Perkin Elmer公司生產；HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒由中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購自Gibco公司。
1.2體外細胞模型轉染乙肝病毒的2.2.15細胞株(HepG 2.2.15)由浙江大學中藥與天然藥物研究室培養(yǎng)提供，將HepG 2.2.15細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，置5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3藥物作用HepG 2.2.15細胞用0.06％胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，每孔200uL，兩天后換含藥培養(yǎng)液，藥物濃度分別為100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，每個濃度設6個平行孔，每三天換含藥培養(yǎng)基一次，吸取換出的培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照，以拉米呋啶作為陽性對照，測試時吸上清液用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，得到結果如表所示。余下細胞用MTT法測定藥物細胞毒性。試驗另設培養(yǎng)液空白對照組四孔。
2、MTT法檢測樣品對細胞的毒性；化合物1-r對細胞的細胞毒活性細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，800,000U/mL青霉素和1mg/mL的鏈霉素。細胞在37℃，含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞存活率的測定用改良MTT法，在孵育結束時每孔加入20μL MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](5mg/mL，用磷酸緩沖液PBS配制)，在37℃條件下繼續(xù)孵育4小時，然后每孔加入100μL終止液(10％十二烷基硫酸鈉SDS，用1∶1的異丁醇和2M鹽酸配制)以裂解細胞和溶解甲臢(formazan)結晶。微孔反應板在黑暗潮濕的條件下放置過夜。所形成的甲臢用酶標儀在570nm波長下比色，細胞存活率由樣品相對于對照的比值計算。
3、ELISA法(標準HBsAg診斷試劑盒)檢測樣品對HBsAg的抑制作用加入藥物孵育5，7，14天后的細胞培養(yǎng)上清液，吸出少許，用ELISA法測定，在450nm檢測OD值。測定HBsAg，結果以P/N值表示。以同樣條件用不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照。將6個平行孔的P/N比取平均值后，計算抑制率。
抑制率＝(對照孔P/N值-實驗孔P/N值)÷(對照孔P/N值-2.1)
4、陽性藥物對照拉米呋啶(3-TC)。
檢測結果實施例1中測試對HBsAg抑制率的試驗結果如表一所示。
表二.化合物1-r對HepG 2.2.15分泌的乙肝表面抗原的抑制率(％)以及第12天對細胞生長的抑制率(％)
試驗結果說明目前最具價值的判斷乙型肝炎病毒感染的標志有乙型表面抗原與抗體(HBsAg與抗-HBs)、乙型肝炎e抗原與抗體(HBeAg與抗-HBe)、乙型肝炎核心抗原與抗體(HBcAg與抗-HBc)等。其中HBsAg是判斷HBV感染的重要標志，抑制HBsAg并使HBsAg轉陰反應是治療乙型肝炎中的直接目的之一。化合物1-r第四天、第八天和第十二天在不同濃度時對乙肝表面抗原HBsAg均顯示出一定的抑制活性，且比陽性對照藥品拉米呋啶對乙肝表面抗原的抑制活性強。
結論化合物1-r屬于高活性的乙肝表面抗原HBsAg抑制劑。具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-r為例)屬于強效的HBsAg抑制劑。
藥理實施例2.化合物1-r對乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制試驗材料與方法按照藥理實施例1中描述的方法，我們用ELISA法(標準HBeAg診斷試劑盒)檢測了樣品對HBeAg的抑制作用。以化合物1-r為例說明。標準試劑盒檢測方法加入藥物孵育5，7，14天后的細胞培養(yǎng)上清液，吸出少許，用ELISA法測定，在450nm檢測OD值。測定HBeAg，結果以P/N值表示。以同樣條件用不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照。將6個平行孔的P/N比取平均值后，計算抑制率。陽性藥物對照拉米呋啶(3-TC)。
抑制率＝(對照孔P/N值-實驗孔P/N值)÷(對照孔P/N值-2.1)檢測結果藥理實施例2中測試對HBeAg抑制率的試驗結果見表二。
表二.化合物1-r對HepG 2.2.15分泌的乙肝e抗原的抑制率(％)以及第12天對細胞生長的抑制率(％)
試驗結果說明乙型肝炎e抗原與抗體(HBeAg與抗-HBe)是判斷乙型肝炎病毒感染重要標志，抑制HBeAg并使HBeAg轉陰反應是治療乙型肝炎中的直接目的之一。第四天、第八天和第十二天化合物1-r在高濃度時對乙肝e抗原HBeAg均顯示出較強的抑制活性，且高于陽性對照藥品拉米呋啶對乙肝e抗原的抑制活性。
結論化合物1-r屬于有一定活性的乙肝e抗原HBeAg抑制劑。具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-r為例)屬于強效的HBeAg抑制劑。
藥理實施例3.化合物1-r對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗1.1儀器與試劑PE7700自動熒光PCR儀，美國Perkin Elmer公司生產；HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒由中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購自Gibco公司。
1.2體外細胞模型HepG 2.2.15細胞株培養(yǎng)于浙江大學藥學院中藥與天然藥物研究室，將HepG 2.2.15細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，置5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3藥物作用HepG 2.2.15細胞用胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200uL，24小時后，換含藥培養(yǎng)液，藥物濃度分別為0.5mg/mL，0.05mg/mL，0.005mg/mL，每個濃度設6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，留取培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照，以拉米呋啶作為陽性對照，用同樣的方法測定其對HBV的抑制作用。
1.4HBV-DNA定量采用常規(guī)堿裂解法從培養(yǎng)上清中提取HBV-DNA，按試劑說明書操作，50uL反應體積中含30uL反應緩沖液，5uL MgCl2，5uL引物和探針，7uL樣品處理上清液和3uL Taq酶。各反應管放入PCR儀中，按下列條件擴增92℃2分鐘預變性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40個循環(huán)。反應結束后，由電腦自動分析計算出結果。
1.5試驗結果化合物1-r對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗結果如表三所示。
表三化合物1-r對HepG 2.2.15乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制率(％)以及第12天對細胞生長的抑制率(％)
結論第四天、第八天和第十二天化合物1-r對HBV-DNA均顯示出一定的抑制活性，但是比陽性對照藥品拉米呋啶對HBV-DNA的抑制活性要弱，屬于有一定活性的HBV-DNA抑制劑。說明該類具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-r為例)屬于有效的HBVDNA抑制劑。
藥理實施例四 化合物1-k對四氯化碳致大鼠原代肝細胞損傷體外模型的肝細胞損傷保護活性試驗。
在生理條件下，用“膠原酶(IV型)灌流液”灌流肝臟，借膠原酶消化肝細胞間質組織而達到分散肝細胞的目的。再進行分離純化而得到肝實質細胞，然后進行原代培養(yǎng)。在體外用化學物質(如CCl4、H2O2、TTA、GalN等)處理肝細胞，造成肝細胞損傷，以觀察試驗藥物對肝細胞損傷的保護作用。
1、四氯化碳(CCl4)致肝細胞損傷模型的建立原代培養(yǎng)的正常大鼠肝細胞經1640培養(yǎng)液(內含10％小牛血清，105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素和10mg/L胰島素)培養(yǎng)12小時并加入不同濃度的CCl4(1～16mmol/L)，以少量的DMSO助溶，DMSO的終濃度為0.1％(體積分數(shù))。作用不同時間(1～12小時)后，收集24孔板中培養(yǎng)液上清檢測AST，以及肝細胞的MDA含量和GSH-px活性。檢測肝細胞培養(yǎng)上清ALT水平，肝細胞MDA含量。
2.抗肝細胞損傷藥物活性檢測正常大鼠原代肝細胞培養(yǎng)12小時后，加入8mmol/L的CCl4作用6小時后，分別加入高、中、低3種不同濃度的化合物1-k試驗藥液，每一濃度設6個復孔，同時設溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，離心(1800r/min，10分鐘)收集上清。測定上清液中ALT和水平。棄肝細胞培養(yǎng)上清，收集肝細胞樣品，測定肝細胞的MDA含量。
表四藥物對大鼠CCl4損傷肝細胞ALT和MDA的影響
結論化合物1-k對四氯化碳致大鼠肝細胞損傷體外模型的肝細胞損傷保護活性，屬于有一定活性的保肝護肝化合物。說明該類具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-k為例)具有保肝護肝作用。
藥理實施例五 化合物1-k對小鼠急性四氯化碳肝損傷(動物體內肝損傷模型)保護活性的試驗四氯化碳進入體內后，在肝細胞內質網中經細胞色素P-450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基可與細胞內和細胞膜的大分子共價結合，使酶功能喪失，細胞膜脂質過氧化，胞漿Ca2+濃度升高，導致肝細胞損傷，胞漿內轉氨酶滲入血液。
ICR小鼠，全雄，48只。(購自浙江省藥品檢定所)。分為正常組、模型組、陽性組、低劑量化合物1-k試藥(L)組、中劑量化合物1-k試藥(M)組、高劑量化合物1-k試藥(H)組，每組8只。各組動物給藥情況如下(1)正常組生理鹽水(NS)；(2)模型組NS；(3)陽性組聯(lián)苯雙酯100mg/kg；(4)試藥(L)組50mg/kg；(5)試藥(M)組100mg/kg；(6)試藥(H)組200mg/kg；各組藥物均用NS溶解。分組后灌胃給藥(10ml/kg)，每天給藥一次，連續(xù)7天。末次給藥后1小時，除正常組外，均參加造模。用橄欖油配成1％的CCl4溶液，用前反復振蕩混勻。腹腔注射1％的CCl4溶液(10ml/kg)到毒。注射毒物后禁食過夜。末次給藥24小時后，摘眼球取血，分離血清，測AST和ALT。取一小塊肝組織，立即放入福爾馬林溶液中固定，用于制作病理切片。
血清谷草轉氨酶(AST/GOT)的檢測和血清谷丙轉氨酶(ALT/GPT)的檢測表五 化合物1-k對急性肝損傷小鼠血清AST/GOT和ALT/GPT的影響
組織病理學檢測1、病理切片制作方法取材每只動物取同一葉肝臟部位大致相同的一小塊肝組織(含包膜)，大小0.5cm×0.5cm×0.2cm，縱切或橫切，按照標準病理學切片程序進行固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、清洗、水化、HE染色、分化、返藍、脫水與透明、封片，編號后進行觀察。
2、肉眼觀察模型組小鼠體積和色澤無明顯改變。
3、顯微鏡下觀察模型組小鼠肝小葉中央?yún)^(qū)細胞變性壞死，數(shù)個肝細胞壞死灶融合呈板狀。試藥組和陽性組小鼠肝細胞損傷均有明顯改善。
結論(1)生化指標(AST和ALT)檢測結果均表明，四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型造模是成功的。(2)血清AST和ALT檢測結果表明試藥和陽性藥在試驗劑量下能明顯降低肝損傷小鼠血清AST/GOT和ALT/GPT水平；其中試藥(H)能顯著降低肝損傷小鼠血清AST/GOT水平；陽性藥和試藥(L)能顯著降低肝損傷小鼠血清ALT/GPT水平；但量效關系均不明顯。(3)病理組織學檢測表明，試藥化合物1-k和陽性藥能不同程度改善四氯化碳導致的小鼠肝細胞損傷。說明該類具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-k為例)具有體內保肝護肝作用。
藥理實施例六 化合物1-s體外清除超氧化自由基的活性試驗化合物1-s清除超氧陰離子自由基能力是用比色法檢測的。采用非酶系統(tǒng)吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(PMS-NADH)產生的超氧陰離子與還原性硝基四唑氮藍(NBT)反應產生甲臜，根據(jù)其在560nm處吸光度的變化來判斷化合物的自由基清除能力。3mL反應體系中含有16mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，體積)、78μM的NADH、50μM NBT、各種不同濃度的待測化合物，當加入10μM PMS時啟動反應。室溫反應5分鐘后用分光光度計在560nm波長下檢測，試驗結果見表六。
表六化合物1-s清除超氧化自由基活性
表內數(shù)字為4個獨立試驗之平均值±標準誤。
從表中可以看出，化合物1-s在體外實驗中顯示出清除超氧化陰離子自由基的能力。在這些化合物存在的情況下，由吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH產生的超氧化陰離子自由基可以被劑量依賴性地清除。還原性四唑氮藍的量可以由560nm吸光度的變化來表示，與對照組比較，化合物1-s有很強的清除超氧陰離子自由基之能力，故560nm吸光度迅速下降。說明該類具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-s為例)具有較強的清除超氧自由基的能力。
藥理實施例七 化合物1-s抑制自由基誘導之脂過氧化物生成活性試驗化合物1-s抑制自由基誘導之脂過氧化物生成使用大鼠肝勻漿脂質過氧化系統(tǒng)。鼠肝勻漿用雄性SD大鼠制備。在含F(xiàn)eSO4及0.1mM維生素C的1mL磷酸鉀緩沖液(10mM，pH 7.4)中分別加入適量肝勻漿和待測化合物，37℃保溫30分鐘后加入1mL三氯醋酸(20％)終止反應，隨后加入15ml硫代巴比妥酸(0.8％)，100℃水浴20分鐘，然后3,000rpm離心5分鐘去除蛋白沉淀，在532nm波長下測定上清吸光度。脂過氧化物合量由反應中生成的氰尿酰胺二醛(malondialdehyde)表示，槲皮素作為陽性對照。試驗結果見表七。
表七.化合物1-s對小鼠肝微粒體抗脂質過氧化活性
結論由表七可以看出，化合物1-s對由自由基引發(fā)的肝勻漿脂過氧化物的生成具有抑制活性，氰尿酰胺二醛之生成量大幅減少。且成劑量依賴型抑制模式，說明與對照組比較，化合物1-s具有較高的抗氧化能力。
藥理實施例八 化合物1-i體外抑制真菌生長的活性試驗一、檢測方法采用“微量稀釋法”，用RPMI-640-MOPS培養(yǎng)液將待測樣品進行一系列二倍稀釋后，再定量接種檢測菌，35℃孵育24小時后觀察檢測菌的生長情況。抑制檢測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為測定藥物對檢測菌的最低抑菌濃度(MIC)。
二、檢測菌白色念珠菌10231，浙江大學中藥與天然藥物研究室提供。陽性對照藥物氟康唑，購于杭州市第三人民醫(yī)院，配置成1000μg/ml溶液。菌液用RPMI-1640-MOPS培養(yǎng)液稀釋至10-6待用。待測樣品化合物1-j用20μl DMSO溶解后，用培養(yǎng)液稀釋成500μl。96孔細胞培養(yǎng)板取50μl稀釋好的菌液依次由低濃度加至高濃度的樣品孔和檢測菌生長對照孔中。每孔加入20μl氯霉素(100μg/ml)，混勻后35℃培養(yǎng)24小時后觀察菌液生長情況，肉眼未見菌落生長的最低樣品濃度為該樣品的MIC。
表八.化合物1-j抑菌活性測試結果
表九.氟康唑(陽性對照)抑菌活性測試結果
結果表明樣品化合物1-i對白色念珠菌10231具有抑制作用，MIC為375.0μg/ml。而陽性對照氟康唑顯示較強的抗菌活性，MIC小于1.46μg/ml。說明該類具有全新結構的二氫黃酮醇類化合物(化合物1-i為例)屬于抑制真菌生長作用。
權利要求
1.一種式(1)所示的5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物及其可藥用鹽或其溶劑化物 式(1)其中R1，R2和R3可以相同或者不同，分別選自氫或含1-8個碳的烷基；R4，R5，R6可以是取代在苯環(huán)(B環(huán))任意位置，R4，R5，R6可以相同或不同，分別選自氫、1-8個碳的烷基、鹵素、硝基，1-8個碳的烷氧基，或氨基，R4，R5和/或R6可以與苯環(huán)稠合形成取代或未取代的稠環(huán)化合物；R7一般為氫，也可以是可供藥用的金屬鹽基如鈉鹽、鎂鹽離子，式(1)中2，3位的立體構型分別是或同時是R或者S構型；式(1)化合物包括經柱層析、重結晶等方法純化后的光學活性化合物，也包括未經純化且具有同一平面結構的立體異構體的混合物。
2.根據(jù)權利要求
1的式(1)所示的5，6，7-三氧化取代的二氫黃酮醇類化合物及其可藥用鹽或其溶劑化物，它們是化合物1-a3，4′-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-b3-羥基-5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-c3-羥基-4′-甲基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-d3，4′-二羥基-5，6，7，3′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-e3，3′-二羥基-5，6，7，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-f3-羥基-5，6，7，3′，4′-五甲氧基二氫黃酮；化合物1-g3-羥基-5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基二氫黃酮；化合物1-h4′-氯-3-羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-i3，3′，4′-三羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-j3′，4′-亞甲二氧基-3-羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-k5，7-二甲氧基-3，6，4′-三羥基二氫黃酮；化合物1-l3，6-二羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-m3，6-二羥基-4′-甲基-5，7-二甲氧基二氫黃酮；化合物1-n3，6，4′-三羥基-5，7，3′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-o3，6，3′-三羥基-5，7，4′-三甲氧基二氫黃酮；化合物1-p3，6-二羥基-5，7，3′，4′-四甲氧基二氫黃酮；化合物1-q3，6-二羥基-5，7，3′，4′，5′-五甲氧基二氫黃酮；化合物1-r4′-氯-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮；化合物1-s5，7-二甲氧基-3，6，3′，4′-四羥基二氫黃酮；化合物1-t3′，4′-亞甲二氧基-3，6-二羥基-5，7-二甲氧基二氫黃酮；化合物I-u2′，3-二羥基-5，6，7-三甲氧基二氫黃酮；化合物I-v3，4′-二羥基-5，6，7，3′，5′-五甲氧基二氫黃酮。
3.權利要求
1中式(1)化合物的制備方法，包括將式(I-5)化合物酸化環(huán)合得到式(1)化合物 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6的定義如權利要求
1，反應式中的醇為單獨的甲醇，乙醇，丙醇，丁醇或其與四氫呋喃的混合溶劑；酸為鹽酸，硫酸或醋酸。
4.根據(jù)權利要求
3的制備方法，其中式(I-5)化合物由式(I-4)化合物在堿催化下，經過氧化氫氧化制備得到 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6的定義如權利要求
1，反應式中堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，醇為甲醇，乙醇，丙醇或丁醇。
5.根據(jù)權要求4的制備方法，其中式(I-4)化合物由式(I-2)和式(I-3)化合物制備得到 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6的定義如權利要求
1，反應式中堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，醇為甲醇，乙醇，丙醇或丁醇。
6.根據(jù)權利要求
5的制備方法，其中式(I-2)化合物由式(I-1)化合物制備得到 其中R1，R2，R3的定義如權利要求
1，堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，相轉移催化劑為四丁基鹵化銨，四丁基氫氧化銨，芐基三甲基鹵化銨等有機胺鹽，有機溶劑為二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯等。
7.根據(jù)權要求3和4的式I-5所示的環(huán)氧查爾酮類化合物，它們是 式I-5I-5-16，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-26-甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-34′-甲基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-46，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-56，3′-二甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-66-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′-五甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-76-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′，5′-六甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-84′-氯-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-96，3′，4′-三甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-103′，4′-亞甲二氧基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-112，4-二甲氧基-3，6，4′-三甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-123，6-二甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-134′-甲基-3，6-二甲氧甲氧基-2，4-二甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-143，6，4′-三甲氧甲氧基-2，4，3′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-153，6，3′-三甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-163，6-二甲氧甲氧基-2，4，4′，-四甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-173，6-三甲氧甲氧基-2，4，3′，4′，5′-五甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-184′-氯-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-192，4-二甲氧基-3，6，3′，4′-四甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮；I-5-203′，4′-亞甲二氧基-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮，I-5-216，2′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基環(huán)氧查爾酮，I-5-226，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′，5′-五甲氧基環(huán)氧查爾酮。
8.根據(jù)權利要求
4和權利要求
5的式I-4所示的查爾酮類化合物，它們是 式I-4I-4-16，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-26-甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基查爾酮；I-4-34′-甲基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-46，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′-四甲氧基查爾酮；I-4-56，3′-二甲氧甲氧基-2，3，4，4′-四甲氧基查爾酮；I-4-66-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′-五甲氧基查爾酮；I-4-76-甲氧甲氧基-2，3，4，3′，4′，5′-六甲氧基查爾酮；I-4-84′-氯-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-96，3′，4′-三甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-103′，4′-亞甲二氧基-6-甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-112，4-二甲氧基-3，6，4′-三甲氧甲氧基查爾酮；I-4-123，6-二甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基查爾酮；I-4-134′-甲基-3，6-二甲氧甲氧基-2，4-二甲氧基查爾酮；I-4-143，6，4′-三甲氧甲氧基-2，4，3′-三甲氧基查爾酮；I-4-153，6，3′-三甲氧甲氧基-2，4，4′-三甲氧基查爾酮；I-4-163，6-二甲氧甲氧基-2，4，3′，4′-四甲氧基查爾酮；I-4-173，6-三甲氧甲氧基-2，4，3′，4′，5′-五甲氧基查爾酮；I-4-184′-氯-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基查爾酮；I-4-192，4-二甲氧基-3，6，3′，4′-四甲氧甲氧基查爾酮；I-4-203′，4′-亞甲二氧基-2，4-二甲氧基-3，6-二甲氧甲氧基查爾酮；I-4-212′，6-二甲氧甲氧基-2，3，4-三甲氧基查爾酮；I-4-226，4′-二甲氧甲氧基-2，3，4，3′，5′-五甲氧基查爾酮。
9.根據(jù)權利要求
1和權利要求
2的化合物或者它們的混合物用于制備防治乙型病毒性肝炎、保肝護肝、治療真菌感染、防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物的用途。
10.一種用于防治乙型病毒性肝炎、保肝護肝、治療真菌感染、防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物，其中含有治療有效量的作為活性成分的根據(jù)權要求1和權利要求
2的化合物或者它們的混合物和藥用輔料。該組合物構成注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑劑型藥物。
專利摘要
本發(fā)明涉及具有抗乙型肝炎病毒，抗氧化，保肝護肝和抗真菌作用的式(1)所示的的一類新型5，6，7－三氧代二氫黃酮醇化合物及其備方法和用途。本發(fā)明的式(1)化合物可以用于制備防治乙型病毒性肝炎、保肝護肝、治療真菌感染、防治病變過程中產生自由基的疾病包括炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以使用多種制劑形式。
文檔編號A61P31/00GK1990482SQ200510132510
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月26日
發(fā)明者趙昱, 汪峰, 劉偉, 白驊 申請人:浙江海正天華新藥研發(fā)有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan