專利名稱:雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表達(dá)載體、所表達(dá)的重組蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種cDNA，尤其涉及一種人工改造的雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表達(dá)載體的構(gòu)建、所表達(dá)的重組VP2蛋白及該重組蛋白在制備抗雞傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病是能夠引起雞體免疫抑制的重要的病毒病，嚴(yán)重危害著世界的養(yǎng)雞業(yè)。傳統(tǒng)疫苗在防制該病的歷史中起到非常重要的作用，隨著該病近年來(lái)呈現(xiàn)的新的變化-血清型變異株，超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，使得對(duì)該病的防制越來(lái)越棘手，傳統(tǒng)疫苗的研制速度已經(jīng)有些難于跟上該病的變化?？焖俚拈_(kāi)發(fā)新型有效的能防制變異和超強(qiáng)毒株的新型疫苗的要求尤為迫切。蛋白亞單位基因工程疫苗是去除遺傳物質(zhì)但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危險(xiǎn)。該疫苗的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用將為防制當(dāng)前流行的雞傳染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可為防制禽類免疫抑制病提供有效的參考和經(jīng)驗(yàn)。
甲醇酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)，它不僅象原核生物一樣操作簡(jiǎn)便、酵母細(xì)胞容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快速、成本低廉、適于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，而且能對(duì)重組蛋白進(jìn)行正確的折疊和翻譯后加工修飾，如糖基化、甲基化以及β-折疊等。酵母表達(dá)系統(tǒng)是所有表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量最高的，可以達(dá)到克/升以上，有的表達(dá)量高達(dá)12克/升。酵母表達(dá)載體有分泌型和非分泌型，分泌型可以將所表達(dá)的蛋白分泌到液體培養(yǎng)基中去，且酵母本身分泌的蛋白非常少，雜蛋白非常少，易于純化。Pichiapastoris具有可利用甲醇作為碳源和能源等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是分泌表達(dá)或非分泌表達(dá)外源基因的一種優(yōu)秀工程菌。
Jagadish等用不同載體在酵母中表達(dá)了IBDV的大片段，結(jié)果表明，以非融合蛋白形式表達(dá)的多聚蛋白經(jīng)翻譯后或翻譯過(guò)程中的加工，可產(chǎn)生正確的VP3，但檢測(cè)不到VP2。但以融合蛋白形式表達(dá)的蛋白前體可產(chǎn)生穩(wěn)定的VP2和VP3，說(shuō)明在表達(dá)的多聚蛋白的N末端需要有部分酵母蛋白序列的保護(hù)，否則可能會(huì)被蛋白酶水解。Macreadie等用酵母表達(dá)了IBDV大片段。用轉(zhuǎn)化的酵母裂解液100-200μL(相當(dāng)于50μg VP2)與弗氏不完全佐劑乳化后注射SPF雞，可刺激產(chǎn)生很高的ELISA抗體和中和抗體。用1mL免疫雞的血清腹腔注射1日齡雛雞，第二天用100CID50的IBDV攻毒，三天后檢測(cè)法氏囊含毒量。結(jié)果表明，免疫雞血清可對(duì)雛雞提供很好的保護(hù)。Fahey等用酵母表達(dá)了IBDV VP2，制成油佐劑苗后免疫10周齡SPF雞。免疫2周后可檢測(cè)到抗體，然后持續(xù)上升，免疫后6周ELISA抗體滴度達(dá)高峰，中和抗體效價(jià)8周后達(dá)到高峰。
研究表明，用酵母表達(dá)的IBDV VP2免疫，其效果與傳統(tǒng)疫苗一樣。比起用SPF雞法氏囊或細(xì)胞培養(yǎng)物制備的傳統(tǒng)IBD疫苗，酵母菌的培養(yǎng)簡(jiǎn)單、方便，所需培養(yǎng)基價(jià)格也較低，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)粗提即可應(yīng)用。因此，用酵母表達(dá)生產(chǎn)的IBD亞單位苗將具有更好的應(yīng)用前景。
原有的IBDV VP2基因在酵母中的表達(dá)效率不高，需要對(duì)其進(jìn)行分子改造和修飾，以提高其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)效率，進(jìn)一步用所得到的重組VP2蛋白制成抗雞傳染性法氏囊病蛋白亞單位疫苗。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA進(jìn)行分子改造和修飾，提供一種適合在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)的雞傳染性法氏囊病病毒人工VP2 cDNA。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種適合在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)的雞傳染性法氏囊病病毒人工VP2cDNA，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明在不改變?cè)须u傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA所編碼的氨基酸序列的前提下，按照畢赤酵母密碼子的選擇偏向?qū)﹄u傳染性法氏囊病病毒VP2cDNA密碼子進(jìn)行優(yōu)化，規(guī)避了一些可能降低表達(dá)的序列，得到了一種新的適合在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)的雞傳染性法氏囊病病毒人工VP2 cDNA序列。
本發(fā)明所要解決第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體及含有該重組酵母表達(dá)載體的細(xì)胞系。
本發(fā)明所要解決第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組酵母表達(dá)載體，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的重組酵母表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將將SEQID NO.1所示的核苷酸序列插入到酵母表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使SEQ ID NO1所示的核苷酸序列可操作的與酵母細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將SEQ ID NO1所示的核苷酸序列插入到酵母表達(dá)載體pPICZαC的XholI和XbaI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOX1啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)載體。
本發(fā)明所構(gòu)建的重組酵母表達(dá)載體可通過(guò)常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可為畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸酵母細(xì)胞(Hansenula polymorpha)。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將重組酵母表達(dá)載體采用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化SMD1168畢赤酵母株(SMD1168 Pichia strain)。
本發(fā)明所要解決第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，該重組蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性。
本發(fā)明所要解決第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，該重組VP2蛋白主要由SEQID NO1所示的核苷酸序列所編碼。
本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白的方法。
本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種制備雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白的方法，包括以下步驟培養(yǎng)用本發(fā)明重組酵母表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)重組VP2蛋白的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組VP2蛋白。
上述制備重組VP2蛋白的方法中，優(yōu)選的，所述的酵母細(xì)胞是SMD1168畢赤酵母株(SMD1168 Pichia strain)。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種蛋白亞單位基因工程疫苗，該基因工程亞單位疫苗可有效的防治雞傳染性法氏囊病。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種抗雞傳染性法氏囊病的蛋白亞單位基因工程疫苗，該疫苗含有免疫上有效劑量的本發(fā)明的重組VP2蛋白。
本發(fā)明重組VP2蛋白可按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成蛋白亞單位基因工程疫苗。例如，可參照下述方法來(lái)制備以磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4，0.01M、pH7.4，PBS的具體配制方法NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；KH2PO40.5g，加水溶解后定容至1升)將重組VP2蛋白溶液稀釋為400μg/mL，然后將重組蛋白溶液與白油司盤佐劑按1∶1混合放入膠體磨勻質(zhì)機(jī)中，使其乳化。亞單位疫苗的分裝量為250ml/瓶和500ml/瓶?jī)煞N，分裝后的疫苗放4～8℃保存。
為了達(dá)到更好的免疫效果，本發(fā)明蛋白亞單位基因工程疫苗還可含有藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑等。
一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案的整體描述應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增自行分離的國(guó)內(nèi)雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株基因組A片段，基因測(cè)序后，應(yīng)用軟件DNAstar根據(jù)畢赤酵母密碼子偏嗜表將IBDV VP2基因編碼進(jìn)行分子改造和修飾，得到適應(yīng)在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)的新的基因序列，將新的基因序列人工合成后，將其克隆入T載體，然后亞克隆入酵母表達(dá)載體。以電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選，PCR鑒定，得到重組酵母菌株。對(duì)重組酵母菌株進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的高表達(dá)菌株，并將其馴化為工程菌株。對(duì)工程菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，表達(dá)量達(dá)到0.4g/L的水平。經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AIDT)、SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western blot檢測(cè)證明表達(dá)的重組蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性。
本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA能夠在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)(表達(dá)量達(dá)到0.4g/L的水平)，所表達(dá)的重組蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性，將所表達(dá)的重組蛋白制成亞單位疫苗，免疫雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雞傳染性法氏囊病亞單位疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得90％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明蛋白亞單位基因工程疫苗能夠有效防治雞傳染性法氏囊病。
用酵母表達(dá)的重組VP2蛋白免疫，其效果與傳統(tǒng)疫苗一樣。比起用SPF雞法氏囊或細(xì)胞培養(yǎng)物制備的傳統(tǒng)IBD疫苗，酵母菌的培養(yǎng)簡(jiǎn)單、方便，所需培養(yǎng)基價(jià)格也較低，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)粗提即可應(yīng)用。因此，本發(fā)明蛋白亞單位疫苗與現(xiàn)有的疫苗相比將具有更好的應(yīng)用前景。
蛋白亞單位基因工程疫苗是去除遺傳物質(zhì)但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危險(xiǎn)。本發(fā)明亞單位疫苗將為防制當(dāng)前流行的雞傳染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可為防制禽類免疫抑制病提供有效的參考和經(jīng)驗(yàn)，投入應(yīng)用后既能有效的防止疫病造成的損失，同時(shí)也降低了養(yǎng)殖成本，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值，并能帶來(lái)更好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
本發(fā)明蛋白亞單位基因工程疫苗的用法與用量用法經(jīng)由肌肉注射。
用量雛雞0.3mL/羽，成年雞0.5mL/羽圖1雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因與載體構(gòu)建圖譜。
圖2IBDVA片段的RT-PCR結(jié)果。
M、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000+DL2000(TaKaRa公司)；1、IBDV OF243基因3.1Kb；2、超純水為模板PCR對(duì)照。
圖3重組畢赤酵母表達(dá)載體PCR鑒定結(jié)果。
1、2、IBDV VP2基因1.3Kb；M、1Kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(MBI公司)。
圖4酵母重組子鑒定結(jié)果。
1-6、為Mut+表型重組酵母株；M、1Kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(NEB公司)。
圖5重組酵母株誘導(dǎo)蛋白Western blot結(jié)果。
1、pPICZ αC/SMD1168空載體重組酵母菌對(duì)照；1-7不同株pPICZ αVP2/SMD1168重組酵母菌分泌蛋白；M、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施方式材料和試劑1病毒 雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒Gx株由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室分離。
2菌種和載體 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本實(shí)驗(yàn)室制作。畢赤酵母菌種SMD1168和載體pPICZαC購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，pMD18-T購(gòu)自大連TaKaRa生物公司。
3試驗(yàn)試劑 反轉(zhuǎn)錄酶superscriptTMII購(gòu)自Invitrogen公司，ExpandHigh Fidelity PCR System購(gòu)自德國(guó)Roche公司，其他試劑為分析純。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物公司。
重組雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA的合成與克隆1病毒RNA的提取 將感染雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒Gx(vvIBDV-Gx)株的SPF雞法氏囊用研磨器研磨。取200μl病料補(bǔ)加TE(PH8.0)至500μl，加入5μl蛋白酶K和10％SDS 50μl，56℃水浴3小時(shí)。加入等體積酚/氯仿抽提3次，等體積氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5ml離心管，加入1/10體積NaAc(3M，PH5.2)、等體積異丙醇，-20℃沉淀2小時(shí)。4℃、12000轉(zhuǎn)/分、離心15分鐘，用75％乙醇洗一次。真空干燥，將RNA用無(wú)RNA酶去離子水重新溶解。
2基因組A片段RF243基因的獲得對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR，應(yīng)用隨機(jī)引物進(jìn)行RT反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，按照superscriptTMII反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增RF243 PCR引物，引物序列為Paf5`-gcggaattcgatgacgaacctgcaagatcaaac-3`，Par5`-ccgaattccaaggtcctcatcagagacagcc-3`，以RT產(chǎn)物為模板，加10μl入PCR反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)體系為100μl，其他溶液按照Expand High Fidelity PCR System說(shuō)明書(shū)添加，反應(yīng)條件如下預(yù)變性94℃3min，循環(huán)參數(shù)為94℃10sec、55℃20sec、72℃3min，循環(huán)30次，72℃延伸7min。
經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增IBDV-Gx株病毒RNA得到長(zhǎng)度為3.1Kb(SEQ ID NO3)的片段(圖2)。該片段包含IBDV A片段基因完整的大開(kāi)放閱讀框，基因測(cè)序結(jié)果及其推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
應(yīng)用華舜瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，按照說(shuō)明書(shū)操作。PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。堿裂解法提取質(zhì)粒，用PCR進(jìn)行鑒定，PCR鑒定引物及條件同上，鑒定正確重組質(zhì)粒送交大連TaKaRa生物公司測(cè)序。
3、VP2基因的優(yōu)化改造及合成將畢赤酵母密碼子偏嗜表輸入DNAstar軟件Editseq中，以步驟2中測(cè)得序列為原型，以軟件進(jìn)行分子改造和修飾，獲得的新基因序列(SEQ ID NO1)進(jìn)行人工合成。
4、優(yōu)化后VP2基因的擴(kuò)增以優(yōu)化基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增VP2基因引物，在引物兩端引入Xhol I和Xba I酶切位點(diǎn)。引物序列為Pvp2f5`-gcgctcgagaagagagaggctgaagcaatgactaacttgc-3`，Pvp2r5`-gcctctagaagcaccagcgatcttcaatgg-3`，以人工合成的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系100μl，模板2μl，其它溶液按照Expand High Fidelity PCR System說(shuō)明書(shū)添加，反應(yīng)條件如下預(yù)變性94℃，3min，循環(huán)參數(shù)為94℃10sec、55℃20sec、72℃1min，循環(huán)30次，72℃延伸7min。
重組酵母載體的構(gòu)建及鑒定1、重組酵母載體的構(gòu)建將優(yōu)化VP2基因和酵母載體分別用Xhol I和Xba I酶切，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。載體用CIAP去磷酸化。外源片段及載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。構(gòu)建圖譜見(jiàn)圖1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
2、重組質(zhì)粒的提取及鑒定將相應(yīng)抗生素按作用濃度加入低鹽LB中(篩選pPICZαVP2質(zhì)?？股剡x擇ZeocinTM)，挑取單菌落接種LB。堿裂解法提取質(zhì)粒。用PCR方法進(jìn)行鑒定，PCR鑒定引物及條件同實(shí)施例1，PCR擴(kuò)增出1.3Kb條帶(圖3)，將鑒定正確質(zhì)粒送交大連TaKaRa生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的基因符合合成基因測(cè)序的結(jié)果，基因插入正確，與載體讀碼框相符。
重組酵母載體的轉(zhuǎn)化、重組酵母菌株的檢測(cè)和篩選1、轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞將重組酵母載體用Sac I酶切線性化，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，按照Invitrogen公司畢赤酵母電轉(zhuǎn)化指導(dǎo)方法進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化后酵母菌涂布含有抗生素的YPDS平板(篩選pPICZαVP2轉(zhuǎn)化的重組酵母菌抗生素選擇ZeocinTM)。
2、酵母重組子的篩選和鑒定挑取10個(gè)酵母單菌落，接種5ml含有抗生素的YPD，過(guò)夜培養(yǎng)，離心，棄去培養(yǎng)液，用5ml滅菌去離子水洗一次。應(yīng)用蛋白酶K、SDS過(guò)夜消化酵母菌，離心，將上清液轉(zhuǎn)至另一1.5ml離心管，酚、氯仿抽提3次，無(wú)水乙醇沉淀。應(yīng)用AOX1 5`及3`引物進(jìn)行PCR，PCR條件為預(yù)變性94℃3min，循環(huán)參數(shù)為94℃1min、55℃1min、72℃1min，循環(huán)30次，72℃延伸7min。
應(yīng)用蛋白酶K-SDS消化酵母菌，提取酵母DNA，用AOX1 5`及3`引物進(jìn)行PCR，當(dāng)外源基因片段整合進(jìn)入酵母基因組，則PCR產(chǎn)物中應(yīng)當(dāng)有一條比外源基因片段長(zhǎng)593bp左右的DNA片段，否則只有一條約2.2Kb左右的AOX基因片段。當(dāng)外源片段與酵母基因組整合正確時(shí)酵母表型為Mut+，這時(shí)PCR產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)外源基因片段+593bp及2.2Kb兩條DNA片段，整合不正確時(shí)酵母表型為Muts，這時(shí)PCR產(chǎn)物中只有外源基因片段+593bp DNA片段，見(jiàn)圖4，通過(guò)篩選，獲得545株重組酵母。
3、酵母重組子的小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)將PCR鑒定表型為Mut+重組酵母菌株接種25ml BMGY，30℃搖瓶培養(yǎng)(RPM300)，培養(yǎng)菌密度至OD600為8時(shí)離心(3000g，5min)，用5ml BMMY重新懸浮酵母細(xì)胞，繼續(xù)30℃搖瓶培養(yǎng)(RPM300)。每24小時(shí)補(bǔ)加無(wú)水甲醇至1％濃度，吸取菌液100μl，離心，將上清移入另一1.5ml離心管中，凍存于-70℃冰箱。接入BMMY后120小時(shí)收取全部菌液，離心，將上清移入另一滅菌容器，凍存于-70℃冰箱。
4、表達(dá)蛋白的鑒定挑取不同株酵母誘導(dǎo)表達(dá)，將小規(guī)模誘導(dǎo)收獲的樣品取50μl，加入2倍SDS上樣緩沖液50μl，煮沸10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western blot(參照《分子克隆》第二版)測(cè)定表達(dá)量，陽(yáng)性重組酵母菌株分泌蛋白可以和抗IBDV單克隆抗體反應(yīng)見(jiàn)圖5，同一株酵母不同時(shí)間表達(dá)蛋白從24次小時(shí)起能夠得到眼觀量，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，72小時(shí)蛋白濃度最大。不同株酵母相同時(shí)間表達(dá)蛋白的表達(dá)量是不同的，憑借SDS-PAGE篩選到表達(dá)量高的菌株優(yōu)化為工程菌株，表達(dá)量達(dá)到400mg/L。Western-blot結(jié)果證明表達(dá)蛋白能夠和特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。
試驗(yàn)例1本發(fā)明重組蛋白免疫原性的測(cè)定將實(shí)施例2所制備的重組蛋白與油佐劑1∶1乳化，按乳化后的蛋白含量分3個(gè)劑量100μg/ml、200μg/ml、1000μg/ml。取4周齡SPF雞50只，分5組，每組10只。1、2、3組為本發(fā)明重組蛋白免疫組1組免疫劑量為50μg/0.5ml/只，2組免疫劑量為100μg/0.5ml/只，3組免疫劑量為500μg/0.5ml/只；4組為常規(guī)滅活疫苗(雞傳染性法氏囊病滅活疫苗，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)免疫組，免疫劑量為0.5ml/只；免疫途徑均為胸肌注射法；5組為無(wú)免疫對(duì)照組。各組免疫后每7天采血，檢測(cè)瓊擴(kuò)抗體，并于免疫后14天各組取5只攻毒，各組余下的5只于免疫后28天時(shí)攻毒。攻毒后觀察7天，記錄死亡數(shù)，計(jì)算保護(hù)率。試驗(yàn)在負(fù)壓隔離器(澳大利亞進(jìn)口)中進(jìn)行。
免疫14天后攻毒，攻毒后7天，常規(guī)滅活苗免疫組存活率為100％，本發(fā)明亞單位疫苗免疫組存活率為80％以上，未免疫攻毒對(duì)照組存活率為20％。免疫28天后攻毒，攻毒后7天，常規(guī)滅活疫苗組存活率為100％，本發(fā)明亞單位疫苗免疫組存活率為100％，未免疫攻毒對(duì)照組存活率為20％。攻毒結(jié)果表明，用本發(fā)明IBDV重組VP2蛋白免疫SPF雞，可以產(chǎn)生抵抗超強(qiáng)毒IBDV致死攻擊的免疫保護(hù)力。
試驗(yàn)例2本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗毒理學(xué)試驗(yàn)為了考察試驗(yàn)雞對(duì)本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗免疫接種后的毒理學(xué)反應(yīng)，本試驗(yàn)采用大劑量接種的方法分析了本發(fā)明基因工程亞單位疫苗接種后疫苗與機(jī)體之間的相互關(guān)系。
具體試驗(yàn)如下將實(shí)施例2所制各的重組蛋白與油佐劑按1∶1比例乳化，對(duì)7日齡、14日齡和60日齡的試驗(yàn)雞進(jìn)行胸肌注射，每只雞接種1ml(相當(dāng)于2個(gè)免疫劑量)，接種后觀察雞群的精神狀態(tài)以及局部的反應(yīng)情況。
結(jié)果，所有試驗(yàn)雞的注射局部均出現(xiàn)結(jié)節(jié)，注射后第7天周圍組織形成肉牙腫，未吸收部分形成包囊。所有試驗(yàn)雞均無(wú)其他全身反應(yīng)，精神食欲不受影響，發(fā)育正常。試驗(yàn)表明，即使用2倍疫苗免疫劑量注射試驗(yàn)雞，也不會(huì)引起試驗(yàn)雞嚴(yán)重的臨床反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明蛋白亞單位疫苗是安全的，既可用于5周齡以上的雞的免疫，又可用于2周齡雛雞的免疫，甚至可以對(duì)1周齡的雞實(shí)施免疫接種。
表1本發(fā)明疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)例3本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗環(huán)境釋放安全性評(píng)價(jià)2004年6月至2004年12月，在黑龍江哈爾濱市(原太平區(qū))民主鄉(xiāng)哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)對(duì)本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗進(jìn)行了環(huán)境釋放，總的試驗(yàn)規(guī)模為5000羽份。
具體試驗(yàn)方法及結(jié)果如下1雞傳染性法氏囊病病毒基因蛋白在雞體內(nèi)的抗體消長(zhǎng)以50μg本發(fā)明重組蛋白免疫試驗(yàn)雞，疫苗接種后的6個(gè)月內(nèi)隨機(jī)從免疫雞群抽取雞40只，并從同批的非免疫雞取去同樣大小的樣本作為試驗(yàn)對(duì)照，采集血樣，用AG試驗(yàn)檢測(cè)雞群血清抗體的產(chǎn)生情況，血清學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，免疫后1周開(kāi)始出現(xiàn)抗體反應(yīng)，效價(jià)達(dá)到3.12±0.45log2，免疫后8周達(dá)到高峰效價(jià)為5.31±0.36log2。以后每月抗體效價(jià)逐漸消減，到150天抗體效價(jià)仍能達(dá)到4.07±0.21log2，180天抗體效價(jià)能達(dá)到3.38±0.67log2。疫苗接種后的6個(gè)月每30天，隨機(jī)從免疫雞群抽取雞10只，并從同批的非免疫雞群取同樣大小的樣本作為試驗(yàn)對(duì)照，用雞傳染性法氏囊病病毒vvIBVDV-GX株超強(qiáng)毒攻擊，雞群接種亞單位疫苗之后免疫保護(hù)作用出現(xiàn)于免疫后的10天。免疫后150天仍能使免疫雞群80％的免疫雞獲得超強(qiáng)毒攻擊后的保護(hù)。免疫后不同時(shí)間抗體效價(jià)及雞群對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)結(jié)果(見(jiàn)表2)。
表2本發(fā)明疫苗免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果
2細(xì)胞傳代對(duì)重組畢赤酵母菌株穩(wěn)定性的影響將本發(fā)明重組酵母菌株連續(xù)傳代到20次，取第5、10、15、20代菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白表達(dá)量沒(méi)有差異，將表達(dá)蛋白用磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4)稀釋到200μg/mL，然后將重組蛋白溶液與白油司盤佐劑按1∶1混合放入膠體磨勻質(zhì)機(jī)中，使其乳化，以制備的亞單位疫苗免疫試驗(yàn)雞，以50μg/0.5ml/羽經(jīng)胸肌注射接種途徑。免疫后28天攻擊雞傳染性法氏囊病病毒vvIBDV-GX株超強(qiáng)毒，各代次酵母表達(dá)蛋白制備疫苗均可達(dá)到95％以上的保護(hù)率，保護(hù)試驗(yàn)表明，不同代次重組酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)蛋白制成的亞單位疫苗對(duì)免疫雞的保護(hù)效果沒(méi)有發(fā)生改變，都可以使免疫雞抵抗雞傳染性法氏囊病病毒vvIBVDV-GX株超強(qiáng)毒的攻擊，證明插入的外源基因能在酵母的長(zhǎng)期傳代過(guò)程中穩(wěn)定地遺傳并表達(dá)出重組VP2蛋白，表達(dá)蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒的免疫反應(yīng)，雞群使用重組疫苗不會(huì)有免疫失敗的安全隱患(見(jiàn)表3)。
表3不同代次重組酵母菌株表達(dá)蛋白對(duì)雞的保護(hù)效果
3表達(dá)抗雞傳染性法氏囊病亞單位疫苗重組酵母菌株對(duì)環(huán)境的轉(zhuǎn)移情況試驗(yàn)結(jié)束后的1、2、3、4、8、12周，采集試驗(yàn)雞場(chǎng)的飼料、飲水、塵土、糞便和籠具的擦拭物，保存于50％甘油緩沖鹽水中，玻璃研磨器研磨后制成1∶2稀釋的勻漿液，接種含有ZeocinTM抗生素的YPD培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)培養(yǎng)液離心，用北京天為時(shí)代公司酵母基因組提取試劑盒提取酵母DNA，用PCR方法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。PCR使用引物pu5′-tactattgccagcattgctgc-3，pr5′-ggggacccgcgaacggat-3′。條件94℃/3分鐘；94℃/30秒，56℃/30秒，72℃/3分30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR檢測(cè)結(jié)果(表4)表明，試驗(yàn)結(jié)束后不能分離到重組酵母，說(shuō)明本發(fā)明重組酵母菌在環(huán)境中沒(méi)有殘留。
表4試驗(yàn)結(jié)束后重組酵母菌株在環(huán)境中的殘留
試驗(yàn)證明，本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗對(duì)雞群是安全的，而且免疫接種雞免疫后不出現(xiàn)不良反應(yīng)；試驗(yàn)雞免疫后，迅速產(chǎn)生抗體，使機(jī)體能夠抵抗雞傳染性法氏囊病病毒野毒的侵襲；試驗(yàn)結(jié)束后，環(huán)境中沒(méi)有轉(zhuǎn)基因微生物的殘留。
綜上所述，本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗免疫后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，抗體持續(xù)期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上，使免疫雞獲得對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)，保護(hù)率為95％以上，免疫期可達(dá)3個(gè)月。表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒蛋白的重組酵母菌株可以穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白，其表達(dá)的蛋白免疫原性各代次間沒(méi)有差異。試驗(yàn)結(jié)束后環(huán)境中檢測(cè)不出重組酵母菌的存在，證明本測(cè)試對(duì)象本身對(duì)雞群非常安全、可靠，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害。因此，用酵母表達(dá)的抗雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗是一種安全性極高的疫苗。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表達(dá)載體、所表達(dá)的重組蛋白及應(yīng)用<130>12<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1323<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>1atgactaact tgcaagacca aactcaacaa atcgttccat tcatcagatc cttgttgatg 60ccaactactg gtccagcttc catcccagac gacactttgg agaagcacac tttgagatcc 120gagacttcca cttacaactt gactgttggt gacactggtt ccggtttgat cgttttcttc 180ccaggtttcc caggttccat cgttggtgct cactacactt tgcaatccaa cggtaactac 240aagttcgacc aaatgttgtt gactgctcaa aacttgccag cttcctacaa ctactgtaga 300ttggtttcca gatccttgac tgttagatcc tccactttgc caggtggtgt ttacgctttg 360aacggtacta tcaacgctgt tactttccaa ggttccttgt ccgagttgac tgacgtttcc 420tacaacggtt tgatgtccgc tactgctaac atcaacgaca agatcggtaa cgttttggtt 480ggtgagggtg ttactgtttt gtccttgcca acttcctacg acttgggtta cgttagattg 540ggtgacccaa tcccagctat cggtttggac ccaaagatgg ttgctacttg tgactcctcc 600gacagaccaa gagtttacac tatcactgct gctgacgact accaattctc ctcccaatac 660caagctggtg gtgttactat cactttgttc tccgctaaca tcgacgctat cacttccttg 720tccatcggtg gtgagttggt tttccaaact tccgttcaag gtttgatctt gggtgctact 780atctacttga tcggtttcga cggtactgct gttatcacta gagctgttgc tgctgacaac 840ggtttgactg ctggtactga caacttgatg ccattcaaca tcgttatccc aacttccgag 900atcactcaac caatcacttc catcaagttg gagatcgtta cttccaagtc cggtggtcaa 960gctggtgacc aaatgtcctg gtccgcttcc ggttccttgg ctgttactat ccacggtggt 1020aactacccag gtgctttgag accagttact ttggttgctt acgagagagt tgctactggt 1080tccgttgtta ctgttgctgg tgtttccaac ttcgagttga tcccaaaccc agagttggct 1140aagaacttgg ttactgagta cggtagattc gacccaggtg ctatgaacta cactaagttg 1200atcttgtccg agagagacag attgggtatc aagactgttt ggccaactag agagtacact 1260gacttcagag agtacttcat ggaggttgct gacttgaact ccccattgaa gatcgctggt 1320gct 1323<210>2<211>3039<212>DNA<213>chicken infectious busal disease viru<400>2atgacgaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
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165 170 175Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val355 360 365Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445Arg Ala Leu Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe Pro450 455 460
Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr Leu465 470 475 480Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala Ser485 490 495Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln Leu Thr Leu Ala500 505 510Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe Gln Val Pro Gln515 520 525Asn Pro Val Val Asp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Ile Leu Arg Gly530 535 540Ala His Asn Leu Asp Cys Val Leu Arg Glu Gly Ala Thr Leu Phe Pro545 550 555 560Val Val Ile Thr Thr Val Glu Asp Ala Met Thr Pro Lys Ala Leu Asn565 570 575Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp Leu Gln Pro580 585 590Pro Ser Gln Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly His Arg Val595 600 605Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr Gly Arg Asp610 615 620Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser Ile Met Leu625 630 635 640Ser Lys Asp Pro Ile Pro Pro Ile Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Ala645 650 655Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe Arg Pro Lys Val Pro Ile His Val Ala660 665 670Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Glu Asn Val Ser Phe675 680 685Arg Ser Thr Lys Leu Ala Thr Ala His Arg Leu Gly Leu Lys Leu Ala690 695 700Gly Pro Gly Ala Phe Asp Val Asn Thr Gly Ser Asn Trp Ala Thr Phe705 710 715 720Ile Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr725 730 735Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Gly Arg Gln Tyr Asp Leu740 745 750Ala Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala755 760 765
Val Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe His Ser770 775 780Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp785 790 795 800Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn805 810 815Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys820 825 830Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu835 840 845Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr850 855 860Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His865 870 875 880Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu885 890 895Ile Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys900 905 910Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile915 920 925Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu930 935 940Val Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu945 950 955 960Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn965 970 975Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Val Pro Thr980 985 990Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Ala Val Ser Asp995 1000 1005Glu Asp Leu Glu1010
權(quán)利要求
1.一種改造的雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA，其特征是具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求
1 cDNA的重組酵母表達(dá)載體。
3.一種用權(quán)利要求
2的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，其特征是由權(quán)利要求
1的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所編碼。
5.一種制備權(quán)利要求
4重組VP2蛋白的方法，包括以下步驟培養(yǎng)用權(quán)利要求
2的重組酵母表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)重組VP2蛋白的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組VP2蛋白。
6.按照權(quán)利要求
5的方法，其特征是所述的酵母細(xì)胞是SMD1168畢赤酵母細(xì)胞(SMD1168 Pichia strain)。
7.一種抗雞傳染性法氏囊病的蛋白亞單位基因工程疫苗，其特征是該疫苗含有有效量的權(quán)利要求
4的重組VP2蛋白。
8.按照權(quán)利要求
7的蛋白亞單位基因工程疫苗，其特征是該疫苗還含有藥學(xué)上可接受的佐劑、載體或賦型劑。
9.權(quán)利要求
1的雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA在制備防治或診斷雞傳染性法氏囊病藥物中的用途。
10.權(quán)利要求
4的雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白在制備防治或診斷雞傳染性法氏囊病藥物中的用途。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA(SEQ ID NO1)、其表達(dá)載體的構(gòu)建、所表達(dá)的重組VP2蛋白及該重組蛋白在制備抗雞傳染性法氏囊病蛋白亞單位基因工程疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA能夠在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)，所表達(dá)的重組蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性。將本發(fā)明所表達(dá)的重組蛋白制成疫苗，免疫雞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明蛋白亞單位疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，使免疫雞獲得90％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻擊的保護(hù)，并可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1990869SQ200510135583
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日
發(fā)明者王笑梅, 高宏雷, 付朝陽(yáng), 高玉龍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan