專(zhuān)利名稱(chēng):雞傳染性法氏囊病毒vp3基因、所表達(dá)的重組蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種雞傳染性法氏囊病毒VP3基因，該基因表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化，所表達(dá)的重組蛋白及該重組蛋白所制備的檢測(cè)或診斷傳染性法氏囊病毒的試劑盒，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病(chicken infectious busal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus，IBDV)引起的雞和火雞的一種急性高度接觸性傳染病，該病主要侵害3-12周齡的雛雞和青年雞，給世界各國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的損失。IBDV的靶細(xì)胞是未成熟的B淋巴細(xì)胞或B前淋巴細(xì)胞，感染后很快發(fā)生變性和壞死。由于法氏囊是B細(xì)胞成熟的重要器官，雞在感染IBDV后，淋巴濾泡內(nèi)的B細(xì)胞大量裂解死亡，網(wǎng)狀細(xì)胞呈凋亡過(guò)程，最終導(dǎo)致法氏囊等器官萎縮，使病雞更易感染其他致病因子，而且對(duì)某些疫苗(如新城疫、禽流感等)的免疫應(yīng)答能力下降，導(dǎo)致免疫失敗。研究表明傳染性法氏囊病毒常與其他一些疾病呈混合感染，這可能是引發(fā)雞群多疾病爆發(fā)，使養(yǎng)禽業(yè)的疫病更加復(fù)雜和嚴(yán)重的主要原因之一。如何準(zhǔn)確的對(duì)IBDV進(jìn)行快速診斷是及時(shí)掌握IBDV流行的分子機(jī)制、抗原變異，并據(jù)此制定正確的疾病防制措施的必要前提。
雞傳染性法氏囊病是雞傳染性法氏囊病病毒引起能夠使雞死亡的禽類(lèi)的一種重要的傳染病。在我國(guó)，雞傳染性法氏囊病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害是巨大的，雖然該病疫苗已經(jīng)列入免疫程序，但是免疫效果的好壞直接影響著該病防制的成功與否，同時(shí)感染后也會(huì)使其他疫病易感，近年來(lái)變異株和高致病力毒株的出現(xiàn)也時(shí)不時(shí)造成該病的地域性流行及點(diǎn)狀爆發(fā)，給該病的防制帶來(lái)很多新的挑戰(zhàn)。
國(guó)外學(xué)者Jorgel等在昆蟲(chóng)細(xì)胞中分別表達(dá)了IBDV結(jié)構(gòu)蛋白VPX(VP2-VP4-VP3)和VP3，使用表達(dá)的重組蛋白作為診斷用抗原進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。對(duì)超過(guò)300份雞血清的監(jiān)測(cè)結(jié)果證明與兩種商業(yè)試劑盒(美國(guó)IDDEXX和KPL)比較，VPX具有較好的相關(guān)性，陽(yáng)性檢出率為100％，與兩種商業(yè)試劑盒一致，陰性檢出率為56.6％，高于兩種商業(yè)試劑盒；而VP3的相關(guān)性稍差，陽(yáng)性檢出率為96％，陰性檢出率為26.6％，與KPL一致，而低于IDDEXX的46.6％。Saravanan P等(2004)使用兩段合成的IBDV VP2多抗原肽(MAPs)，分別作為診斷用抗原，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)IBDV抗體，兩段多抗原肽的特異性和敏感性均好于全病毒。
目前IBD的診斷主要通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、以全病毒抗原建立的免疫熒光試驗(yàn)以及進(jìn)口的ELISA試劑盒(包被抗原主要為全病毒)等方法來(lái)進(jìn)行。上述這些方法中，有的存在特異性不高的問(wèn)題，有的存在步驟煩瑣、成本昂貴的缺陷，并且現(xiàn)有的這些診斷方法均不能夠?qū)P2亞單位疫苗免疫和野毒感染區(qū)別開(kāi)來(lái)，對(duì)雞傳染性法氏囊病的診斷和預(yù)防造成了一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性高，易純化制備、成本低的重組IBDV VP3蛋白，該重組蛋白可作為診斷抗原，不僅能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出待測(cè)血液樣品中的傳染性法氏囊病毒，還能夠準(zhǔn)確的將VP2亞單位疫苗免疫和野毒感染區(qū)分開(kāi)來(lái)。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組IBDV VP3蛋白，含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種編碼上述重組蛋白基因，含有該基因的原核表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種編碼上述重組IBDV VP3蛋白cDNA，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的原核表達(dá)載體，含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。其中，所述的原核表達(dá)載體優(yōu)選為pPROVP3，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌(E.coli)DH5α。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備本發(fā)明重組IBDVVP3蛋白的方法。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種制備本發(fā)明重組IBDV VP3蛋白的方法，包括以下步驟用上述的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)重組VP3蛋白表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組VP3蛋白。
作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將SEQ ID NO1所示的核苷酸序列插入到原核表達(dá)載體pPROEX-Hta上的EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組原核表達(dá)載體pPROVP3；將所得到的重組原核表達(dá)載體pPROVP3通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α；用IPTG誘導(dǎo)重組IBDV VP3蛋白的表達(dá)，將所表達(dá)的蛋白采用常規(guī)的方法回收并純化即得。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種診斷或檢測(cè)傳染性法氏囊病毒的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種檢測(cè)或診斷雞傳染性法氏囊病毒的試劑盒，該試劑盒主要由包被有抗原的酶標(biāo)板，樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體，底物顯色液、終止液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清組成，其中，所述的用于包被酶標(biāo)板的抗原為本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病毒VP3重組蛋白；所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；所述的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。
上述試劑盒中，所述的樣品稀釋液、洗液、酶標(biāo)抗體結(jié)合物，底物顯色液和終止液均為本領(lǐng)域試劑盒中的常規(guī)用品，其制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的酶標(biāo)抗體結(jié)合物優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗雞IgG；所述的底物顯色液優(yōu)選為鄰苯二胺(OPD)。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用本發(fā)明重組IBDVVP3蛋白體外檢測(cè)或診斷傳染性法氏囊病毒的方法。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種應(yīng)用本發(fā)明重組IBDV VP3蛋白體外檢測(cè)或診斷傳染性法氏囊病毒的間接ELISA方法，包括用抗原包被酶標(biāo)板，封閉，再依次加入待檢血清、酶標(biāo)抗體結(jié)合物、底物顯色液、終止液、測(cè)定OD值等步驟，其中，用濃度為2～4μg/ml的重組IBDV VP3蛋白包被酶標(biāo)板；所述的封閉劑選自1％馬血清加PBS、0.5％馬血清加PBS、5％牛血清加PBS、5％脫脂乳加PBS或3％脫脂乳加PBS；封閉時(shí)間為60分鐘-120分鐘；所加入待檢血清的稀釋度為1∶100-1∶200；底物顯色液與酶標(biāo)抗體結(jié)合物的作用時(shí)間為10-15分鐘。
間接ELISA抗原的包被濃度、血清的稀釋倍數(shù)以及反應(yīng)時(shí)間等都是影響試驗(yàn)穩(wěn)定性的重要因素，為了得到了理想的反應(yīng)體系，本發(fā)明人分別對(duì)這些條件進(jìn)行了反復(fù)的試驗(yàn)和測(cè)試。最終發(fā)現(xiàn)抗原用2μg/ml的濃度包被、血清作1∶100稀釋反應(yīng)60min，結(jié)果較為滿(mǎn)意。抗原包被后的固相載體表面會(huì)留有部分可吸附蛋白質(zhì)的活性部位，這些部位會(huì)影響試驗(yàn)的特異性，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同封閉劑作用不同的時(shí)間及對(duì)封閉結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)含有0.5％馬血清或3％的脫脂乳封閉的PBST都有良好的封閉作用，可明顯的降低反應(yīng)的非特異性。試驗(yàn)結(jié)果良好。但快診板要長(zhǎng)期保存，則3％的脫脂乳封閉的效果就不太理想，測(cè)得的OD值普遍升高，因?yàn)槊撝橹械牡鞍壮煞指鼮閺?fù)雜，且容易變性，影響了最終的檢測(cè)結(jié)果。因此，本發(fā)明確立了0.5％馬血清的PBS作為最適封閉液。此外，本發(fā)明還通過(guò)大量的試驗(yàn)確立待檢血清與包被抗原的作用最佳時(shí)間為60分鐘，酶標(biāo)抗體結(jié)合物與待檢血清的最佳作用時(shí)間為60分鐘；底物顯色液與酶標(biāo)抗體結(jié)合物的最佳作用時(shí)間為15分鐘。
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，成本低廉，可以大量生產(chǎn)目的蛋白。當(dāng)目的蛋白與標(biāo)簽蛋白融合后，還可以方便蛋白的純化，所以目前應(yīng)用廣泛。本發(fā)明通過(guò)對(duì)雞傳染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列進(jìn)行篩選和分析，選取了其中一段抗原表位較豐富、能夠在原核細(xì)胞中高效表達(dá)的cDNA序列(SEQ IDNO1)，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，采用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，用所表達(dá)的IBDV部分VP3重組蛋白作為包被抗原，成功地建立了IBDV間接ELISA診斷方法，經(jīng)特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)，該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，同時(shí)本發(fā)明確定了ELISA的最佳反應(yīng)條件，為免疫雞群抗體檢測(cè)和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡(jiǎn)便的血清學(xué)鑒別診斷方法。
在獸醫(yī)實(shí)際臨床工作中大量的血清樣品監(jiān)測(cè)及現(xiàn)地未知疾病的爆發(fā)迫切需要一種反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)捷、結(jié)果準(zhǔn)確的診斷方法。ELISA試驗(yàn)(ELISA)診斷方法在以上提到的這些方面很符合臨床的要求。ELISA診斷方法已經(jīng)越來(lái)越普及的應(yīng)用到各種疫病的診斷中。間接ELISA作為一種快速的診斷方法其敏感性就成為該診斷方法實(shí)用性的先決條件。
本發(fā)明以重組IBDV VP3蛋白為抗原所建立的間接ELISA方法，具有很好的特異性，除可用于IBD的常規(guī)血清學(xué)診斷外，還可用于鑒別診斷，即用VP2亞單位疫苗免疫后，不會(huì)產(chǎn)生抗VP3的抗體，如用本發(fā)明建立的ELISA方法檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)，即為野毒感染。所以本方法的建立更重要的意義是將有利于VP2亞單位疫苗的有效預(yù)防及撲殺計(jì)劃，有利于雞場(chǎng)的凈化，為生產(chǎn)實(shí)踐提供一種快速有效地鑒別診斷方法，為徹底撲滅法氏囊病提供技術(shù)支撐。
用本發(fā)明所表達(dá)的IBDV部分VP3重組蛋白作為包被抗原，具有全病毒無(wú)可比擬的安全性，不存在潛在的病毒逃逸和擴(kuò)散的威脅，同時(shí)具有很高的特異性，并且能夠作為現(xiàn)有技術(shù)中VP2亞單位疫苗的配套產(chǎn)品，可以鑒別亞單位疫苗免疫和野毒感染，為今后啟動(dòng)IBDV根除計(jì)劃創(chuàng)造了技術(shù)條件。
本發(fā)明試劑盒可以鑒別基因工程亞單位疫苗免疫與野毒感染雞產(chǎn)生抗體。本發(fā)明試劑盒用于雞傳染性法氏囊病間接ELISA試驗(yàn)，用于雞傳染性法氏囊病抗體的血清學(xué)診斷、現(xiàn)地疫情監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查等。
本發(fā)明的間接ELISA試劑盒具有很高的敏感性，在雞體感染病毒后第5天即可檢出抗體，與瓊擴(kuò)診斷方法的檢出時(shí)間相同，間接ELISA方法檢測(cè)抗體持續(xù)期相對(duì)瓊擴(kuò)方法時(shí)間長(zhǎng)，間接ELISA方法可以很方便的進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所用時(shí)間短于瓊擴(kuò)診斷，相對(duì)更為快速。本發(fā)明試劑盒所用包被抗原是生物安全性很高的亞單位蛋白，不存在散毒危險(xiǎn)?？梢栽趯?shí)際臨床工作中得到更為廣泛的應(yīng)用。
圖1VP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
1.VP3基因的PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；3.Marker。
圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pPROVP3的PCR鑒定。
M.DL2000 Marker；1.陽(yáng)性對(duì)照(PA質(zhì)粒)；2.陰性對(duì)照；3.4.重組表達(dá)質(zhì)粒VP3/PA PCR產(chǎn)物。
圖3VP3/PA推導(dǎo)的氨基酸序列與vvIBDV-GX等株的比較。
圖4重組融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)。
1.pPROEX-HTa轉(zhuǎn)化DH5α；2.VP3/PA轉(zhuǎn)化DH5α(加IPTG誘導(dǎo)前)；3.VP3/PA轉(zhuǎn)化DH5α(加IPTG誘導(dǎo)4h)；4.超聲波裂解的沉淀(包涵體)；5.超聲波裂解的上清；M.蛋白Marker。
圖5重組融合蛋白的Western blot檢測(cè)。
M.蛋白Marker；1.重組融合蛋白；2.陰性對(duì)照(插入空載體誘導(dǎo)菌株)。
圖6抗原最適包被濃度和血清最適稀釋度的確定試驗(yàn)結(jié)果。
圖7鑒別診斷試驗(yàn)結(jié)果。
圖8競(jìng)爭(zhēng)抑制性試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
雞傳染性法氏囊病毒重組VP3蛋白的制備1、試驗(yàn)材料1.1病毒 vvIBDV-Gx株由哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽免疫抑制病課題組分離、鑒定及保存。
1.2菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，表達(dá)載體pPROEX-HTa購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。
1.3工具酶與主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和HindIII、一步法反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司；鄰苯二胺及膠回收試劑盒購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其它試劑為從商業(yè)公司購(gòu)買(mǎi)的分析純產(chǎn)品。
1.4試驗(yàn)用血清及動(dòng)物 雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室用SPF雞制備，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清來(lái)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF雞血清。
2試驗(yàn)方法2.1VP3基因RT-PCR擴(kuò)增取感染IBDV-Gx病毒雞法氏囊組織100mg，凍融三次后，剪碎研磨，補(bǔ)加TE(pH8.0)至445μl，加50μl 10％SDS，5μl蛋白酶K(100mg/ml)，56℃孵育4h。加等體積的酚(pH4.5)、氯仿抽提兩次，等體積的氯仿抽提一次。移上清到另一1.5ml離心管，加1/10體積的NaAc(3M，pH5.2)、2.5倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀2h。4℃、12000RPM離心10min，棄上清，用75％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。加入50μl TE(pH8.0)溶解RNA。以Gx(AY444873)序列為參照，用DNASTAR軟件對(duì)IBDV VP3限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)、ORF及模擬表達(dá)VP3蛋白抗原性分析，選擇抗原表位較豐富的2382bp-3152bp(SEQ IDNO1)，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物分別含有EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)PF5′GAC GAA TTC ATG GCC GCT TCA GAG TTC A-3′PR5′CCA AAG CTT TCA CTC AAG GTC CTC ATC A-3′；用一步法RT-PCR試劑盒，取1μg RNA作為RT-PCR模板，進(jìn)行VP3基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為42℃反轉(zhuǎn)錄60min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，得到了一條約800bp片段(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期大小一致。
2.2表達(dá)載體pPROVP3的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒膠回收后，與原核表達(dá)載體pPROEX-HTa，分別用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化，將回收后的片段和載體質(zhì)粒pPROEX-HTa以摩爾比3∶1混勻，用T4DNA連接酶，16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。隨機(jī)挑取一些菌落，于含氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)過(guò)夜后小量提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定(PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。PCR擴(kuò)增獲得了800bp左右的片段，說(shuō)明插入片斷為目的基因VP3片段)，并測(cè)序鑒定(上海Invitrogen公司)，確定陽(yáng)性菌株。將所構(gòu)建的重組表達(dá)載體命名pPROVP3。根據(jù)pPROVP3重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，推導(dǎo)出的氨基酸序列，與vvIBDV-GX株等進(jìn)行了比較，結(jié)果本試驗(yàn)所克隆表達(dá)的片段與IBDV-G株完全一致(除了目的片段兩端的載體自身氨基酸外)參見(jiàn)圖3。
2.3誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組菌30μl接種至3ml的LB培養(yǎng)液(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃振搖過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)物100μl接種于10ml的LB培養(yǎng)液(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃劇烈振搖至OD590為0.5～1.0時(shí)，取1ml菌液作為0h對(duì)照，余下的菌液加入IPTG至終濃度為0.6mM，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，4h后收菌，其中取出1ml菌液，以12000RPM離心2min，余下菌液做超聲波裂解，以12000RPM離心10min分別收集上清和沉淀，同時(shí)用未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照。收集的菌液用1ml pH7.4的PBS重懸沉淀，12000RPM離心2min，用100μl pH7.4的PBS懸浮，加入等體積的2×SDS上樣buffer，混勻，水浴煮沸5min，用12％的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)進(jìn)行電泳。電泳顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生了約33kDa的蛋白帶(圖4)，與由核苷酸序列推導(dǎo)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小相符進(jìn)一步說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物為VP3融合蛋白，其中VP3蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為29kDa。經(jīng)薄層掃描分析，目的蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白量的33.9％。超聲波裂解表明蛋白以包涵體形式存在。另外在目的條帶下方還有一條約32kDa的較小條帶。
2.4Western blot分析將SDS-PAGE電泳的蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，用含5％脫脂乳的PBST封閉，以vvIBDV-G株高免血清為一抗(1∶500稀釋)，Sigma公司HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG為二抗，DAB顯色。結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物能被IBDV陽(yáng)性血清所識(shí)別，證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性，而目的條帶下方的較小條帶不與IBDV陽(yáng)性血清反應(yīng)(見(jiàn)圖5)。
2.5重組VP3蛋白的純化利用大腸桿菌pPROE-HTa表達(dá)載體融合表達(dá)了IBDV的VP3蛋白，其羧基端含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。按Amersham公司HisTrap kit說(shuō)明書(shū)提供的一般策略，進(jìn)行蛋白純化，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋成100μg/ml后，保存于-20℃冰箱，留作實(shí)施例2的ELISA抗原和實(shí)施例3制備試劑盒使用。
應(yīng)用本發(fā)明重組VP3蛋白在建立雞傳染性法氏囊病間接ELISA診斷方法中的應(yīng)用一、試驗(yàn)材料1、包被抗原實(shí)施例1所純化的重組VP3蛋白。
2、試驗(yàn)用血清及動(dòng)物雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均由本發(fā)明人按照常規(guī)方法用SPF雞制備，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF雞血清。
二、試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法采用間接ELISA方法，檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗血清12份，以IBDV全病毒包被板進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)對(duì)照。
按常規(guī)方法在酶標(biāo)板上進(jìn)行。將本發(fā)明重組VP3蛋白用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，包被反應(yīng)板4℃過(guò)夜，翌日取出用封閉劑封閉1h，然后加入待檢血清，37℃反應(yīng)1h取出加入適當(dāng)濃度的二抗酶結(jié)合物，1h后取出洗滌，然后加入底物顯色液。37℃避光反應(yīng)10-20min后，用2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD492nm值。試驗(yàn)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照。
本試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行了摸索下述間接ELISA診斷方法的最佳條件的一系列試驗(yàn)抗原最佳濃度和血清最佳稀釋度；最佳封閉劑和最佳封閉時(shí)間；酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間；一抗最佳作用時(shí)間和底物最佳顯色時(shí)間；經(jīng)過(guò)了一系列的試驗(yàn)摸索，最終確立了上述試驗(yàn)條件的最佳值，具體如下1、最佳抗原濃度和最佳血清稀釋度的確定用不同濃度的本發(fā)明VP3重組蛋白包被酶標(biāo)板后，用不同倍數(shù)稀釋的陽(yáng)性血清與之作用，以方陣滴定法確定抗原濃度。由圖6結(jié)果可見(jiàn)，抗原包被濃度為2-4μg/ml，血清1∶100-1∶200稀釋時(shí)，陽(yáng)性血清OD值接近1.0，陰性血清OD值小于0.2。一般的，酶標(biāo)儀在檢測(cè)OD值為1.0左右時(shí)誤差最小，反應(yīng)最靈敏。此外，還要考慮節(jié)省純化的VP3蛋白，據(jù)此，確定2μg/ml為抗原的最適包被濃度，1∶100為血清最適稀釋度。
2、最佳封閉劑和最佳封閉時(shí)間的選擇本試驗(yàn)分別用1％馬血清、0.5％馬血清、5％牛血清、5％脫脂乳、3％脫脂乳加PBST作為封閉劑，每孔加100μl，作用時(shí)間分別為60min、90min、120min，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，選擇最適的封閉液。
試驗(yàn)結(jié)果表明，封閉時(shí)間為60min，效果要好于90min和120min的封閉效果，其中用0.5％馬血清的封閉效果最好，能有效的封閉在體表面的殘留活性部位，試驗(yàn)特異性高，結(jié)果令人滿(mǎn)意。所以本試驗(yàn)確立用0.5％馬血清的PBS(0.01M、pH7.4，PBS的具體配制方法NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；KH2PO40.5g，加水溶解后定容至1升)緩沖液作為試驗(yàn)用封閉液，封閉時(shí)間為60min。
3、酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清作1∶100稀釋?zhuān)笜?biāo)抗體作1∶5000稀釋?zhuān)謩e作用30min、60min、90min和120min，按間接ELISA程序測(cè)定。當(dāng)酶標(biāo)抗體作用60min時(shí)，P/N值最大。因此，本試驗(yàn)確定60min為酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間。
4、一抗最佳作用時(shí)間和底物最佳顯色時(shí)間一抗作用時(shí)間分別為37℃，30min、60min、90min、120min；底物顯色時(shí)間分別為5min、10min、15min、20min、25min。其它按已確定的ELISA程序。由ELISA檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，一抗最佳作用時(shí)間60min；底物顯色時(shí)間為10-15min，P/N值最大。因此，確定一抗最佳作用時(shí)間為60min，底物最適作用時(shí)間為15min。
5、間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定92份IBDV陰性血清樣品中，在本試驗(yàn)確定的上述最佳條件下進(jìn)行間接ELISA測(cè)定。
S/P的計(jì)算公式為S/P＝(樣品OD值-標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D值)/(標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性O(shè)D值-標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D值)。這些血清數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣品S/P的平均值X＝0.033，標(biāo)準(zhǔn)差S＝0.205，取置信區(qū)間上限X+3S≈0.24，作為IBDV陽(yáng)性血清的下限；X+2S≈0.17，定為可疑界限。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，S/P值≥X+3S時(shí)，可以在99.7％的水平上判定為陽(yáng)性。因此，得到間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)，即S/P值≥0.24者判為陽(yáng)性，S/P值≤0.17者判為陰性，介于二者之間者判為可疑。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性陰性血清之差小于0.5時(shí)，試驗(yàn)無(wú)效。
三、診斷結(jié)果對(duì)于試驗(yàn)用的12份血清，使用全病毒包被進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)得的OD值根據(jù)已有標(biāo)準(zhǔn)判定均為陽(yáng)性。使用重組VP3蛋白包被進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)得的OD值則均為陰性(本次試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性O(shè)D值為1.25，標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D值為0.075，根據(jù)建立的判定標(biāo)準(zhǔn)S/P≤0.17為陰性，本次試驗(yàn)中樣品的S/P值均小于0.17(圖7)。
試驗(yàn)結(jié)果表明，將本發(fā)明重組VP3蛋白用作包被抗原，采用間接ELISA方法可以方便、快速、準(zhǔn)確的診斷出血清樣品中雞傳染性法氏囊病病毒抗體；本試驗(yàn)所建立的間接ELISA診斷雞傳染性法氏囊病病毒方法，具有敏感性強(qiáng)、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床檢測(cè)的應(yīng)用。
實(shí)施例3 本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒的制備1、包被有抗原的酶標(biāo)板的制備1.1抗原的制備采用實(shí)施例1所純化的重組VP3蛋白。
1.2包被抗原的最終濃度為2μg/ml，每孔包被量為100μl，蓋上包被微孔板，置于4℃冰箱中孵育過(guò)夜；1.3洗滌孵育2h后，棄去酶標(biāo)板內(nèi)的包被液，開(kāi)始洗滌(洗滌液的組成及配制為0.01M、pH7.4的PBS加0.5％ Tween 20)，每孔洗滌3次，時(shí)間間隔為每次3min，洗滌完后，將包被板在吸水紙上扣干。
1.4封閉用封閉劑進(jìn)行封閉(封閉劑為0.5％馬血清的PBS)，封閉完成后，蓋上包被微孔板，置于37℃水浴箱中孵育1h。
1.5洗滌封閉結(jié)束后，棄去酶標(biāo)板內(nèi)的封閉液，將包被酶標(biāo)板洗滌，每孔洗滌3次，時(shí)間間隔為每次3分鐘，洗滌完后，將包被板在吸水紙上扣干，將經(jīng)過(guò)上述處理后的包被酶標(biāo)板，蓋上蓋子，置于37℃烘箱中干燥30min。
1.6保存-20℃中保存，有效期6個(gè)月。
2、陰性血清的制備2.1制造用動(dòng)物 選取6～8周齡的SPF雞群。
2.2血清制造 無(wú)菌條件下，采集SPF雞血液，分離血清，用0.22μm濾膜過(guò)濾，在無(wú)菌條件下每瓶分裝1ml，保存于-20℃冰箱。
2.3陰性對(duì)照血清檢驗(yàn)2.3.1物理性狀 液體時(shí)為淡黃色或淡紅色清亮液體。
2.3.2無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
2.4保存 制品在-20℃保存，有效期為1年。
3、陽(yáng)性血清的制備及檢驗(yàn)3.1制造動(dòng)物 選用6～8周齡的SPF雞群，在負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。
3.2免疫原 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的以國(guó)內(nèi)超強(qiáng)毒株(vvIBDV-G)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)適應(yīng)株病毒制備的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗。
3.3免疫接種方法及程序 通過(guò)肌肉注射途徑分3次接種疫苗0.5ml、0.5ml和1ml，每次間隔14日，最后一次接種后14天，采血制備血清測(cè)定效價(jià)。
3.3效價(jià)測(cè)定 用0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBST，pH7.4，含0.05％Tween-20)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清作1∶100，進(jìn)行ELISA測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清應(yīng)S/P值≥0.24。
3.4分裝 對(duì)血清抗體效價(jià)合格的免疫雞無(wú)菌采血，分離血清。用0.22μm濾膜過(guò)濾，在無(wú)菌條件下每瓶分裝1ml，保存于-20℃冰箱。
3.5陽(yáng)性對(duì)照血清檢驗(yàn)3.5.1物理性狀 為淡黃色或淡紅色清亮液體。
3.5.2無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
3.6保存 制品在-20℃保存，有效期為1年。
4、酶標(biāo)抗體結(jié)合物制備及檢驗(yàn)4.1酶標(biāo)抗體結(jié)合物制備4.1.1酶結(jié)合物 為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗雞IgG，購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。
4.1.2酶結(jié)合物稀釋液 0.01M的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。
4.1.3酶結(jié)合物使用液的制備 按1∶5000用酶結(jié)合物稀釋液稀釋?zhuān)?.22μm濾膜過(guò)濾。
4.2酶標(biāo)抗體結(jié)合物的檢驗(yàn)4.2.1物理性狀 應(yīng)為澄清、淡黃色溶液，無(wú)臭、無(wú)味，無(wú)沉淀物。
4.2.2無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)301頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
4.3保存 制品在-20℃保存，有效期為1年。
5、底物顯色液的制備及檢驗(yàn)5.1底物顯色液的制備 往容器內(nèi)加入700ml無(wú)菌去離子水，然后依次加入5.1g檸檬酸、18.4g Na2HPO4，0.4g鄰苯二胺(OPD)，混合溶解后，用無(wú)菌去離子水定容至1L，用0.22μm濾膜過(guò)濾。-20℃避光保存。
5.2物理性狀 應(yīng)為澄清、淡黃色溶液，無(wú)沉淀物。
5.3無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
5.4保存 -20℃避光保存，有效期為1年。
6、樣品稀釋液的制備及檢驗(yàn)6.1樣品稀釋液的制備 在容器內(nèi)加入總體積90％的滅菌去離子水，依次加入60g NaH2PO4、4g Na2HPO4.2H2O、50g NaCl、6g慶大霉素，在18～25℃下攪拌使各組分充分溶解并混合均勻。測(cè)量溶液的酸堿度，用適量0.1M鹽酸或0.1M氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.1～7.3。用滅菌去離子水定容至30L，0.22μm濾膜濾過(guò)。
6.2樣本稀釋液的檢驗(yàn)6.2.1物理性狀 應(yīng)為澄清的金黃色溶液，無(wú)臭、無(wú)味、無(wú)沉淀物。
6.2.2pH值應(yīng)為7.1～7.3。
6.2.3無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)301頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
6.3保存 在室溫下保存，使用期為2年。
7、洗液的制備及檢驗(yàn)7.1洗液的制備 在容器內(nèi)加入總體積80％的滅菌去離子水，依次加入60gNaH2PO4、300g Na2HPO4.2H2O、100gNaCl及15ml吐溫(Tween-20)，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?。用滅菌去離子水定容至30L。0.22μm濾膜濾過(guò)。無(wú)菌分裝，每瓶120ml。
7.2洗液的檢驗(yàn)7.2.1物理性狀 應(yīng)為澄清、無(wú)色、無(wú)臭、無(wú)味的溶液，無(wú)沉淀物。
7.2.2pH值應(yīng)為7.0～7.2。
7.2.3無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)301頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
7.3保存 在室溫下保存，使用期為2年。
8、終止液的制備及檢驗(yàn)8.1終止液的制備 用去離子水將硫酸稀釋成2M，即為終止液。
8.2終止液的檢驗(yàn)8.2.1物理性狀 應(yīng)為澄清、無(wú)色溶液。
8.2.2無(wú)菌檢驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
8.3保存 在室溫下保存，使用期為2年。
9試劑盒的組裝及檢驗(yàn)9.1組裝將檢驗(yàn)合格的各試劑盒組份按表1組裝成試劑盒。
表1
將每支塑料瓶插入泡沫墊各個(gè)孔中，將泡沫墊裝入中紙盒中，在上面放上經(jīng)真空包裝的酶標(biāo)板，陰性血清、陽(yáng)性血清和抗體稀釋液，濃縮的洗液，置于包裝盒的相應(yīng)位置中。放入說(shuō)明書(shū)。
9.2成品檢驗(yàn)9.2.1物理性狀 逐盒檢驗(yàn)，應(yīng)潔凈，密封好。盒中各組分應(yīng)齊全，無(wú)破損，無(wú)滲漏，各個(gè)試劑標(biāo)簽完好、清楚。其中酶標(biāo)板應(yīng)為真空密封，打開(kāi)后為無(wú)色透明。陽(yáng)性與陰性血清為淡黃色或微紅色液體。底物液裝在棕色瓶中。其他溶液為無(wú)色透明的液體，無(wú)沉淀，無(wú)異物。
9.2.2無(wú)菌檢驗(yàn) 試劑盒內(nèi)各組分按標(biāo)準(zhǔn)301頁(yè)檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌污染。
9.2.3特異性檢驗(yàn)9.2.3.1試劑盒內(nèi)的陰性血清按試劑盒使用的說(shuō)明檢測(cè)后，結(jié)果應(yīng)為陰性。
9.2.3.2試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性血清按試劑盒使用的說(shuō)明檢測(cè)后，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。
9.2.4效價(jià)測(cè)定 抗原包被板的效價(jià)測(cè)定用0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBST，pH7.4，含0.5％Tween-20)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清作1∶100稀釋?zhuān)M(jìn)行ELISA測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清應(yīng)S/P值≥0.24。
9.2.5稀釋液 按8.5.3.1檢測(cè)，結(jié)果為陰性。
10、本試劑盒使用說(shuō)明與判定10.1使用說(shuō)明ELISA板加入用樣品稀釋液稀釋的待檢血清及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清，37℃孵育1h后取出洗滌，加入酶結(jié)合物，37℃孵育1h后取出洗滌，然后加入顯色液，37℃避光反應(yīng)10～20min后，用終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD492nm。
10.2結(jié)果判定 S/P值≥0.24者判為陽(yáng)性，S/P值≤0.17者判為陰性，介于二者之間者判為可疑，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性陰性血清之差小于0.5時(shí)，試驗(yàn)無(wú)效。S/P的計(jì)算公式為S/P＝(樣品OD值-標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D值)/(標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性O(shè)D值-標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D值)。
10.2特異性檢驗(yàn)用本試劑盒檢驗(yàn)雞新城疫(ND)；雞傳支(IBD)；禽流感(AI)；雞馬立克(MD)；禽白血病(AL-J)；禽貧血病(CIA)；雞白痢(PD)7種疫病陽(yáng)性血清不發(fā)生反應(yīng)。
10.3鑒別診斷本試劑盒配合全病毒包被抗原間接ELISA方法，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)雞傳染性法氏囊病重組VP2蛋白基因工程亞單位疫苗免疫雞血清為陰性，全病毒包被抗原間接ELISA檢測(cè)相同血清為陽(yáng)性。本試劑盒可以鑒別基因工程亞單位疫苗免疫與野毒感染雞產(chǎn)生抗體。
11、試劑盒貯藏 本試劑盒-20℃保存，有效期6個(gè)月。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明重組VP3蛋白鑒別診斷試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、包被抗原1)實(shí)施例1所純化的重組VP3蛋白；2)雞傳染性法氏囊病全病毒蛋白(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。
2、試驗(yàn)用血清及動(dòng)物雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清由本發(fā)明人按照常規(guī)方法用SPF雞制備，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF雞血清。
二、試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法采用間接ELISA方法，檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗血清35份，以IBDV全病毒包被板進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)對(duì)照。
按常規(guī)方法在酶標(biāo)板上進(jìn)行(同實(shí)施例2)。將本發(fā)明重組VP3蛋白用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，包被反應(yīng)板4℃過(guò)夜，翌日取出用封閉劑封閉1h(同實(shí)施例2)，然后加入待檢血清(雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清)，37℃反應(yīng)1h取出加入適當(dāng)濃度的二抗酶結(jié)合物(同實(shí)施例2)，1h后取出洗滌，然后加入底物顯色液(同實(shí)施例2)。37℃避光反應(yīng)10-20min后，用2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD492nm值。
試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 本發(fā)明重組VP3蛋白鑒別診斷試驗(yàn)
試驗(yàn)結(jié)果表明，將本發(fā)明重組VP3蛋白用作包被抗原，采用間接ELISA方法，可以準(zhǔn)確的鑒別診斷出雞傳染性法氏囊病病毒野毒感染和VP2亞單位疫苗免疫。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒的敏感性試驗(yàn)一、1試驗(yàn)材料與方法1.1試驗(yàn)用病毒雞傳染性法氏囊病病毒Gt株(IBDV-Gt)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)，毒價(jià)為106.25EID50/0.2ml。
1.2試驗(yàn)用雞6-8周齡SPF級(jí)白來(lái)航雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心感染室的負(fù)壓隔離器中。
1.3檢測(cè)用試劑盒本發(fā)明實(shí)施例3所制備的診斷試劑盒。
1.4雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)抗原購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)公司，批號(hào)200305。
1.5雞傳染性法氏囊病陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)，批號(hào)200305。
二、人工感染試驗(yàn)感染時(shí)每只雞采用103EID50的劑量0.2ml滴鼻、點(diǎn)眼接種，共接種50只，感染后的第3、5、7、14和21天，21天以后每隔10天，直至180天，每次采血20只，分離血清，用于瓊擴(kuò)試驗(yàn)(AGP)和間接ELISA試驗(yàn)。
三、試驗(yàn)結(jié)果感染后不同時(shí)間采血，分離血清，檢測(cè)瓊擴(kuò)抗體和ELISA抗體陽(yáng)性率。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 人工接種雞的抗體陽(yáng)性檢出率
從試驗(yàn)結(jié)果可以看出感染后的第3、5、7、14、18和21天間接ELISA診斷方法檢出率是0、10％、20％、100％、100％，瓊擴(kuò)診斷方法檢出率分別是0、0、0、40％、90％，ELISA檢出率高于AGP；感染100天后，AGP檢出率開(kāi)始下降，ELISA檢出率降低幅度較為緩慢。
從上面結(jié)果可以看出，本發(fā)明間接ELISA試劑盒具有很高的敏感性，在雞體感染病毒后第5天即可檢出抗體，比瓊擴(kuò)診斷方法的檢出時(shí)間早。間接ELISA方法檢測(cè)抗體持續(xù)期相對(duì)瓊擴(kuò)方法時(shí)間長(zhǎng)，間接ELISA方法可以很方便的進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所用時(shí)間短于瓊擴(kuò)診斷，相對(duì)更為快速。本發(fā)明試劑盒所用包被抗原是生物安全性很高的亞單位蛋白，不存在散毒危險(xiǎn)，可以在實(shí)際臨床工作中得到更為廣泛的應(yīng)用。
試驗(yàn)例2 本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒的特異性試驗(yàn)1、試驗(yàn)材料和方法1.1雞傳染性法氏囊病、雞傳染性貧血、禽白血病(AL)-J亞群標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室免疫抑制病課題組制備和保存。雞馬立克氏病(MD)、雞新城疫(ND)、禽流感(AI)、雞傳染性支氣管炎病(IB)、雞白痢(PD)的陽(yáng)性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)公司提供。
1.2雞傳染性法氏囊病重組VP3蛋白間接ELISA診斷試劑盒本發(fā)明實(shí)施例3所制備。
1.3間接ELISA操作步驟按照實(shí)施例2所確定的最佳條件來(lái)進(jìn)行。
1.4阻斷實(shí)驗(yàn) 又稱(chēng)競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，將陽(yáng)性血清作1∶25～1∶51200共12個(gè)梯度，倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度加入等量的IBDV陽(yáng)性血清(1∶100稀釋?zhuān)泻驮囼?yàn)效價(jià)為107)，于37℃作用60min，進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，比較結(jié)果。
1.5交叉試驗(yàn) 在同一條件下，將雞新城疫(ND)；雞傳支(IBD)；禽流感(AI)；雞馬立克(MD)；禽白血病(AL-J)；雞傳染性貧血(CIA)；雞白痢(PD)陽(yáng)性血清以1∶100稀釋?zhuān)M(jìn)行間接ELISA程序測(cè)定。
2試驗(yàn)結(jié)果2.1競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn) 不做任何處理的陽(yáng)性血清顯示了較高的OD值，當(dāng)把IBDV陽(yáng)性血清稀釋到1∶6400倍時(shí)，仍然呈陽(yáng)性反應(yīng)，而IBDV全病毒中和試驗(yàn)用抗原處理的陽(yáng)性血清OD值呈明顯下降，1∶6400倍稀釋后呈明顯的陰性結(jié)果(圖8)。
2.2交叉試驗(yàn) 對(duì)7種其他疾病的陽(yáng)性血清按間接ELISA程序測(cè)定，S/P值均小于0.07(表4)，為陰性，即沒(méi)有交叉反應(yīng)性。
表4 交叉試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒具有較高的特異性。
試驗(yàn)例3 本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒批間和批內(nèi)的重復(fù)性研究試驗(yàn)為考察利用本發(fā)明重組蛋白制備的間接ELISA診斷試劑盒在使用過(guò)程中檢測(cè)效果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，特進(jìn)行以下試驗(yàn)。
1材料和方法1.1雞傳染性法氏囊病重組VP3蛋白間接ELISA試劑盒 分別按照本發(fā)明實(shí)施例3的方法制備成4批。
1.2雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 共5份，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所免疫抑制病實(shí)驗(yàn)室研制并保存，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為SPF雞血清。
1.3批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批制備的重組抗原試劑盒，取5份不同抗體水平的IBDV陽(yáng)性血清，在同一時(shí)間，同一條件，同一批試驗(yàn)中按間接ELISA程序測(cè)定，每份血樣平行做5孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見(jiàn)表5)。
表5
1.4批間重復(fù)性試驗(yàn)1.4.1用同一批制備的試劑盒，取5份不同抗體水平的陽(yáng)性血清和1份陰性血清，在8個(gè)不同時(shí)間按間接ELISA程序測(cè)定，每份血樣平行做2孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.4.2取4批不同批次制備的本發(fā)明重組抗原試劑盒，在相同條件下檢測(cè)4份不同抗體水平的陽(yáng)性血清和1份陰性血清，每份血樣重復(fù)2孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.1批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 取抗體水平不同的5份陽(yáng)性血清和一份陰性血清，在同一批次實(shí)驗(yàn)中，按間接ELISA程序測(cè)定不同孔徑的OD值，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其變異系數(shù)位于1.97％～7.12％之間，小于10％。說(shuō)明同一樣品在同一批試驗(yàn)中變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。見(jiàn)表3。
2.2批間重復(fù)性試驗(yàn)2.2.1取抗體水平不同的5份陽(yáng)性血清在8個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)日按間接ELISA程序測(cè)定其OD值，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其變異系數(shù)位于2.00％～11.09％之間，小于15％，說(shuō)明同一樣品在不同批次試驗(yàn)中變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。見(jiàn)表6。
表6 批間重復(fù)性結(jié)果
2.2.2用4批不同的本發(fā)明重組抗原包被的反應(yīng)板，在相同條件下檢測(cè)4份陽(yáng)性血清和1份陰性血清，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，S/P值的變異系數(shù)在2.2-11.3％之間(見(jiàn)表7)，小于15％，說(shuō)明同一樣品在不同批次抗原試驗(yàn)中變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。
表7 批間重復(fù)性試驗(yàn)
試驗(yàn)例3 本發(fā)明間接ELISA診斷試劑盒診斷方法符合率試驗(yàn)本試驗(yàn)主要是考察雞傳染性法氏囊病重組VP3蛋白間接ELISA診斷試劑盒與雞傳染性法氏囊病全病毒瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和雞傳染性法氏囊病的其他常用診斷方法的檢測(cè)差異性。
1試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法1.1雞傳染性法氏囊病全病毒抗原 雞傳染性法氏囊病抗原由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室免疫抑制病課題組試制生產(chǎn)，其瓊脂擴(kuò)散價(jià)為2。
1.2間接免疫熒光試驗(yàn)用病毒 雞傳染性法氏囊病病毒Gt株(IBDV-Gt)暫由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。毒價(jià)為4.0×108PFU/ml。
1.3雞傳染性法氏囊病病毒陽(yáng)性血清以及陰性血清 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室免疫抑制病課題組制備并提供。
1.4禽類(lèi)其他疫病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清如新城疫等7種疾病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所維科公司，共計(jì)14份(每種疫病血清兩份)。
1.5免疫血清 實(shí)驗(yàn)室人工免疫SPF雞，在免疫后不同時(shí)間采集分離免疫雞的血清，共計(jì)200份。
1.6待檢血清 一共330份，分別采自于哈爾濱地區(qū)110份，大慶50份，青島25份，河北45份，河南40份，北京33份，山東27份。
1.7全病毒間接免疫熒光試驗(yàn)，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)均按常規(guī)方法進(jìn)行。
2試驗(yàn)結(jié)果2.1瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)所有的血清樣品，其中陰性血清為陰性，陽(yáng)性血清檢測(cè)為陽(yáng)性，其他7種疫病陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陰性，免疫雞血清和現(xiàn)地血清中檢測(cè)陽(yáng)性的分別是154份和292份，具體結(jié)果見(jiàn)表6。
2.2間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 用全病毒抗原建立的間接ELISA方法檢測(cè)所有血清樣品，其中所有陰性血清均為陰性結(jié)果；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為陽(yáng)性結(jié)果；7種其他疫病陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果也全為陰性；免疫雞血清中檢出193份血清陽(yáng)性，現(xiàn)地血清中檢出312份為陽(yáng)性，具體結(jié)果見(jiàn)表8。
2.3重組蛋白間接ELISA診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果 用間接ELISA方法檢測(cè)所有的血清樣品，其中陰性血清均為陰性，陽(yáng)性血清檢測(cè)為陽(yáng)性，其他7種疫病陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果全為陰性，免疫雞血清檢測(cè)陽(yáng)性的血清樣品有159份；現(xiàn)地血清樣品中有270份為陽(yáng)性，具體結(jié)果見(jiàn)表8。
對(duì)總共710份雞血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢出446份血清樣品陽(yáng)性，用間接免疫熒光試驗(yàn)檢出505份血清樣品為陽(yáng)性；用間接ELISA方法檢出429份血清樣品為陽(yáng)性。其中與瓊擴(kuò)方法的符合率為96.2％(421/446)，與間接免疫熒光試驗(yàn)方法的符合率為83.4％(421/505)，從上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，間接免疫熒光試驗(yàn)方法敏感性較高，瓊擴(kuò)試驗(yàn)次之，重組抗原間接ELISA方法和瓊擴(kuò)方法檢出率近似。但是對(duì)于群體的大量樣品檢測(cè)來(lái)說(shuō)，重組抗原間接ELISA診斷方法更為適宜。
表8 重組抗原間接ELISA方法和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)及間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)血清樣品的比較性檢測(cè)
注表中試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示的為陽(yáng)性數(shù)據(jù)。
間接免疫熒光試驗(yàn)需要熒光顯微鏡設(shè)備限制了該方法的使用，瓊擴(kuò)試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)不太適合緊急診斷的需要。因此本發(fā)明重組抗原間接ELISA診斷方法將是雞傳染性法氏囊病血清學(xué)監(jiān)測(cè)的主要手段之一。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>雞傳染性法氏囊病毒VP3基因、其表達(dá)載體、所表達(dá)的重組蛋白及由該重組蛋白所制備的試劑盒<130>22<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>780<212>DNA<213>雞傳染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus)<400>1atggccgctt cagagttcaa agaaaccccc gaactcgaga gcgccgtcag agccatggaa 60gcagcagcca acgtggaccc actgttccat tctgcgctca gtgtgttcat gtggctggaa 120gaaaatggga ttgtgaccga catggccaac ttcgcactca gcgacccgaa cgcccatcgg 180atgcgcaatt ttctcgcaaa cgcaccacaa gcaggcagca agtcgcaaag agccaagtac 240gggacagcag gctacggagt ggaggcccgg ggccccactc cagaggaagc acagagggaa 300aaagacacac ggatctcaaa gaagatggag actatgggca tctactttgc aacaccagaa 360tgggtagcac tcaatgggca ccgggggcca agccccggcc agctgaagta ctggcagaac 420acacgagaaa tacctgatcc aaacgaggac tacctagact acgtgcatgc agagaagagc 480cggttggcat cagaagaaca aatcctaagg gcagctacgt cgatctacgg ggctccagga 540caggcagagc caccccaagc cttcatagac gaagtcgcca aagtctatga aatcaaccat 600gggcgtggcc ccaaccaaga acagatgaaa gatctgctct tgactgcgat ggagatgaag 660catcgcaatc ccaggcgggc tccaccaaag cccaagccaa aacccaatgt tccaacacag 720agaccccctg gtcggctggg ccgctggatc agggctgtct ctgatgagga ccttgagtga 780<210>2<211>259<212>PRT<213>雞傳染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus)<400>2Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val1 5 10 15Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe His Ser Ala20 25 30Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met35 40 45Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Ash Phe50 55 60Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr65 70 75 80Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu85 90 95
Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lvs Lvs Met Glu Thr Met100 105 110Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg115 120 125Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu Ile130 135 140Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser145 150 155 160Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr165 170 175Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val180 185 190Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln195 200 205Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn Pro210 215 220Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Val Pro Thr Gln225 230 235 240Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Ala Val Ser Asp Glu245 250 255Asp Leu Glu
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列中的一段cDNA，其特征是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求
1 SEQ ID NO1所示核苷酸序列的原核表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求
2的原核表達(dá)載體，其特征是所述的原核表達(dá)載體為pPROVP3。
4.一種雞傳染性法氏囊病毒重組VP3蛋白，其特征是含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一種制備權(quán)利要求
4的重組蛋白的方法，包括用權(quán)利要求
2的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)重組VP3蛋白表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組VP3蛋白。
6.一種檢測(cè)或診斷雞傳染性法氏囊病毒的試劑盒，該試劑盒主要由包被有抗原的酶標(biāo)板，樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體，底物顯色液、終止液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清組成，其特征是所述的用于包被酶標(biāo)板的抗原為權(quán)利要求
4的重組VP3蛋白。
7.按照權(quán)利要求
6的試劑盒，其特征是所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；所述的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；所述的酶標(biāo)抗體結(jié)合物為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG；所述的底物顯色液為鄰苯二胺。
8.權(quán)利要求
4的重組VP3蛋白在體外檢測(cè)或診斷雞傳染性法氏囊病毒中的應(yīng)用，包括用抗原包被酶標(biāo)板，用封閉劑封閉，再依次加入待檢血清、酶標(biāo)抗體結(jié)合物、底物顯色液、終止液、測(cè)定OD值等步驟，其特征是用濃度為2～4μg/ml的重組VP3蛋白包被酶標(biāo)板；所述的封閉劑選自1％馬血清加PBS、0.5％馬血清加PBS、5％牛血清加PBS、5％脫脂乳加PBS或3％脫脂乳加PBS，封閉時(shí)間為60分鐘-120分鐘；所加入待檢血清的稀釋度為1∶100-1∶200；底物顯色液與酶標(biāo)抗體結(jié)合物的作用時(shí)間為10-15分鐘。
9.按照權(quán)利要求
8的應(yīng)用，其特征是用2μg/ml重組IBDV VP3蛋白包被酶標(biāo)板；所述的封閉劑為0.5％馬血清加PBS，封閉時(shí)間為60分鐘；所加入待檢血清的稀釋度為1∶100；待檢血清與包被抗原的作用時(shí)間為60分鐘，酶標(biāo)抗體結(jié)合物與待檢血清的作用時(shí)間為60分鐘；底物顯色液與酶標(biāo)抗體結(jié)合物的作用時(shí)間為15分鐘
10.權(quán)利要求
1的雞傳染性法氏囊病毒VP3 cDNA或權(quán)利要求
4的雞傳染性法氏囊病毒VP3重組蛋白在制備檢測(cè)或診斷雞傳染性法氏囊病毒藥物中的應(yīng)用。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雞傳染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列中的一段cDNA、利用其表達(dá)載體制備重組蛋白的方法、應(yīng)用該重組蛋白所建立的一種IBDV間接ELISA診斷方法以及由該重組蛋白所制備的試劑盒。本發(fā)明通過(guò)對(duì)雞傳染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列進(jìn)行篩選和分析，選取了其中一段抗原表位較豐富、能夠在原核細(xì)胞中高效表達(dá)的cDNA序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，用所表達(dá)的重組蛋白作為包被抗原，成功地建立了IBDV間接ELISA診斷方法，并確定了該方法的最佳反應(yīng)條件，為免疫雞群抗體檢測(cè)和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡(jiǎn)便的血清學(xué)鑒別診斷方法。本發(fā)明還提供了用該重組VP3蛋白作為包被抗原的試劑盒，試驗(yàn)表明，該試劑盒具有良好的敏感性、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1990870SQ200510135606
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月31日
發(fā)明者王笑梅, 高宏雷, 高玉龍, 付朝陽(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan