專利名稱:凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用凝膠阻滯色譜柱上聚合平均分子量小于200kD且分子量分布較窄聚合血紅蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
輸血是臨床醫(yī)學(xué)中一種安全可靠的療法，尤其在急救醫(yī)學(xué)中的作用是任何其他手段無法完全替代的。隨著科學(xué)的發(fā)展，輸血的用途越來越廣泛，血液需求也日益增加。但實際應(yīng)用時還存在著許多難題，如血源短缺，有效儲存期短；輸血前必須經(jīng)過嚴格的血型鑒定和交叉配血試驗，煩瑣費時；同時輸血過程可能發(fā)生不良反應(yīng)和某些傳染病的傳播，如乙型、丙型肝炎，艾滋病等。隨著人們對血液制品安全性要求的不斷提高，血液代用品的研究越來越受到重視。尤其是基于血紅蛋白的血液代用品不但可以替代血紅細胞的攜氧功能、儲存方便，而且可以去除如AIDS、肝炎病毒等病原微生物。這些都預(yù)示著血紅蛋白修飾物將有很好的市場需求。用它可以救治車禍等事故中大量失血的病人。尤其是在戰(zhàn)爭或其他災(zāi)難發(fā)生時，由于血紅蛋白修飾物不存在血液配型問題，其干粉只需與生理鹽水混合就可以直接輸血，將挽救很多的生命。
血紅蛋白由四個亞基(α1α2β1β2)組成，是紅細胞中一種負責(zé)氧氣傳遞的蛋白。由于其獨特的氧結(jié)合特性、正常生理代謝途徑等原因，以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品非常符合人體的生理需要。與紅細胞不同，由于聚合血紅蛋白中沒有膜蛋白、可以巴氏消毒，所以解決了輸血治療中存在的相關(guān)傳染病等問題。同時，聚合血紅蛋白可以在室溫下長時間保存，突破了人血保存和運輸條件要求較嚴，災(zāi)害和戰(zhàn)傷搶救輸血受到限制。然而，未經(jīng)修飾聚合的血紅蛋白不能作為血液代用品直接使用，這主要是因為(1)未經(jīng)修飾的血紅蛋白會失去2，3-二磷酸甘油酸的調(diào)節(jié)，使得血紅蛋白對氧的結(jié)合力升高，不能向組織有效供氧。(2)未經(jīng)聚合的血紅蛋白會使血漿的膠體滲透壓升高。(3)未經(jīng)聚合的血紅蛋白四聚體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期只有2～4小時，會迅速分解成二聚體和單體從腎臟濾過形成血尿。只進行分子內(nèi)聚合的四聚體會進入血管的內(nèi)皮細胞，與其中的NO結(jié)合引發(fā)血壓升高、腹痛等副作用。
1975年Benesch等用5’-磷酸吡哆醛對血紅蛋白的2，3-DPG空穴進行修飾，使P50提高至30mmHg以上。但這種修飾后的血紅蛋白穩(wěn)定性較差，可以用雙官能團或多官能團的交聯(lián)劑進行分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，生成多聚血紅蛋白，以提高穩(wěn)定性、降低膠體滲透壓和攜氧能力。目前最廣泛使用的交聯(lián)劑有戊二醛和開鏈棉子糖。
Northfield公司開發(fā)了戊二醛聚合磷酸吡哆醛人血紅蛋白PolyHeme(US Patent No.6,552,173)。PolyHeme中四聚體血紅蛋白濃度低于1％，有效地避免了腎毒性和四聚體血紅蛋白和NO結(jié)合而引起副作用。PolyHeme的血紅蛋白濃度為14g/dl，滲透壓為20-25mmHg，P50為28-30mmHg[15]。這些指標均與全血相近。目前，該產(chǎn)品已進入III期臨床試驗。1998年，Biopure公司的戊二醛聚合牛血紅蛋白HemopureTM經(jīng)FDA批準進入III期臨床試驗(US Patent No.5,955,581)。牛血紅蛋白的優(yōu)點在于來源廣泛，無需2，3-DPG的修飾就可以達到很大的P50值。HemopureTM中的濃度達13±1g/dl，高鐵血紅蛋白含量小于15％，P50為34mmHg，膠體滲透壓為17mmHg，而粘度只有全血的三分之一。此外，Hemosol公司開發(fā)了開環(huán)棉籽糖聚合血紅蛋白HemolinkTM。棉籽糖經(jīng)高碘酸氧化得到含有6個醛基的開環(huán)棉籽糖(US Patent No.5,770,727)。開環(huán)棉籽糖的醛基可以與血紅蛋白上的2，3-DPG結(jié)合空穴中的氨基進行特異性反應(yīng)，也可以和Hb表面氨基進行非特異性反應(yīng)。最終產(chǎn)物中約含40％分子內(nèi)交聯(lián)產(chǎn)物聚合血紅蛋白(64kD)和60％的分子間交聯(lián)產(chǎn)物(128kD-600kD)[17-18]。HemolinkTM中蛋白含量為10g/dl，P50為34mmHg，膠體滲透壓為24mmHg。
戊二醛是一種同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個醛基可以分別和兩個相同或不同的氨基生產(chǎn)希夫堿。通常，戊二醛交聯(lián)可以生成65-85％的聚合血紅蛋白。但由于戊二醛的反應(yīng)活性高、無特異性反應(yīng)位點，所以其聚合產(chǎn)物分子量分布寬、平均分子量較大。盡管這種聚合血紅蛋白分子的分子量分布不會改變它的載氧特性，但會降低血漿的膠體滲透壓并增加粘度，進而影響其血液動力學(xué)特性。因此，F(xiàn)DA在回復(fù)Biopure公司戊二醛聚合牛血紅蛋III期臨床批文中明確要求降低平均分子量。此外，寬的分子量分布也會給后續(xù)的分離過程帶來很大麻煩。因此，如何制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白降低其粘度和流動性就成為了該領(lǐng)域的研究的重點和難點。一種解決方法是用新型交聯(lián)劑，如聚胺類交聯(lián)劑等來制備分子量分布較窄的聚合血紅蛋白。但是這些交聯(lián)劑價格昂貴、分子量分布仍然較寬、需要進行大量毒理學(xué)評價，因而至今還沒有一種產(chǎn)品進入臨床研究。中國科學(xué)院北京過程研究所蘇志國、胡濤創(chuàng)造性地提出了另一種解決方法(中國專利No.01136190.5)。其具體方法是將血紅蛋白在pH＝7～9的環(huán)境下靜態(tài)吸附于陰離子交換介質(zhì)上用200～500倍戊二醛進行交聯(lián)。最終得到分子量專一(128kD)的血紅蛋白。但此方法也存在一些問題如陰離子交換介質(zhì)的利用率低(0.5-4mg血紅蛋白/ml固相)、使用高摩爾比的戊二醛會使血紅蛋白過度修飾、使用不含氨基的HEPES緩沖體系價格昂貴等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，它是一種獨有的聚合血紅蛋白的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其步驟包括(1)將天然血紅蛋白進行化學(xué)修飾或預(yù)聚合；(2)將修飾或預(yù)聚合的血紅蛋白充分脫氧后用泵加入凝膠阻滯色譜柱中平衡，然后分步加入雙功能交聯(lián)劑進行聚合反應(yīng)，血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為1∶10～1∶50；(3)用緩沖溶液將步驟1生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應(yīng)，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～10∶1，反應(yīng)時間1～3小時，最后超濾濃縮；(4)采用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理后，再用超濾、層析等方法對該產(chǎn)物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
上述步驟(1)中所用的血紅蛋白來源于人血紅蛋白、牛血紅蛋白、豬血紅蛋白或其它哺乳動物血紅蛋白。
上述步驟(1)中加入適量修飾劑、分子內(nèi)交聯(lián)劑或其他雙功能交聯(lián)劑進行預(yù)交聯(lián)。例如用分子內(nèi)交聯(lián)劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯(lián)劑如3～8倍摩爾比戊二醛進行預(yù)交聯(lián)。
上述步驟(2)中加入的雙功能交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
上述步驟(2)中色譜柱填料為凝膠阻滯色譜介質(zhì)，緩沖液pH值為5.0～9.0。
上述步驟(2)中脫氧方法，包括減壓真空抽氣脫氧與惰性氣體鼓泡式脫氧。
上述步驟(2)所述的反應(yīng)時間為3～20小時。
上述步驟(2)所述的反應(yīng)溫度為0～30℃。
上述步驟(2)中血紅蛋白與同型雙功能試劑摩爾比為1∶10～50。
本發(fā)明的工作原理為我們提出了自己的原創(chuàng)思想——在色譜柱上創(chuàng)造一個動態(tài)的不對稱環(huán)境，以達到均一聚合。即在原有反應(yīng)裝置上加裝一個根據(jù)分子尺寸進行分離的凝膠阻滯色譜柱。而當聚合度增大的時候，分子尺寸必然增大。因此，凝膠阻滯色譜柱可以對血紅蛋白四聚體和聚合度不同的聚合血紅蛋白進行分離。當混合液在反應(yīng)體系中循環(huán)時，四聚體和聚合度較低的聚合血紅蛋白會因為保留時間較長，而在色譜柱中富集。如果在色譜柱以外的部分Hb濃度較低且溶液中含有戊二醛，則聚合反應(yīng)主要在色譜柱中進行。聚合度較高的聚合血紅蛋白在色譜柱中的時間短，抑止了其進一步的聚合，使得聚合反應(yīng)趨于均一化。我們在此思想基礎(chǔ)上確立了獨有的制備方法。該方法具有收率高(＞60％)、使用低摩爾比的戊二醛不會使血紅蛋白過度修飾、離子交換介質(zhì)的利用率高(1～100mg/ml血紅蛋白/ml固相)、使用價格便宜的PBS緩沖體系等優(yōu)點。不但如此，由于緩沖溶液的pH值以及離子強度對凝膠阻滯色譜的分離過程無明顯影響，所以該方法適用于較大的pH(5.0～9.0)和離子強度范圍。進而影響氨基的反應(yīng)活性以及聚合反應(yīng)的反應(yīng)時間。
本發(fā)明選用的血紅蛋白可為人血紅蛋白，是從人紅細胞中純化出來的。紅細胞破膜后血紅蛋白丟失了效應(yīng)劑2，3-二磷酸甘油酸。這使得比人血紅蛋白對氧的結(jié)合力明顯上升，必須經(jīng)過2，3-DPG位點進行化學(xué)修飾。另外，本發(fā)明也可適用于其它來源的血紅蛋白，如牛血紅蛋白、豬血紅蛋白。使用本發(fā)明所述方法以牛血紅蛋白和豬血紅蛋白為原料，與戊二醛反應(yīng)后，所得結(jié)果與人血紅蛋白的制備結(jié)果相似。
本發(fā)明使用的血紅蛋白是根據(jù)標準的已知技術(shù)來提取和制備的。首先收集并裂解人紅細胞。通過超速離心、過濾等方法除去細胞碎片和細胞基質(zhì)。最后，用DEAE纖維素離子交換選擇吸附的方法除去雜蛋白，獲得純化的人血紅蛋白。純化血紅蛋白要經(jīng)過PLP修飾，在低溫下保存。血紅蛋白在天然狀態(tài)下可分為脫氧血紅蛋白和氧合血紅蛋白。脫氧血紅蛋白在構(gòu)象上處于緊張態(tài)(T態(tài))，而氧合血紅蛋白在構(gòu)象上處于松弛態(tài)(R態(tài))。由于T態(tài)被視為血紅蛋白在紅細胞中天然存在的構(gòu)象，因而脫氧血紅蛋白的氧結(jié)合性能更能滿足人的需要，本發(fā)明也利用脫氧血紅蛋白制備聚合血紅蛋白。血紅蛋白脫氧形成脫氧血紅蛋白是在與戊二醛反應(yīng)之前進行的。本發(fā)明采用充入氮氣的方法來完成血紅蛋白的脫氧過程，色譜柱的填料和緩沖液抽去空氣，聚合反應(yīng)在氮氣保護下進行。
本發(fā)明在柱上聚合之前可以使用分子內(nèi)交聯(lián)劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯(lián)劑，如3～8倍摩爾比戊二醛進行預(yù)交聯(lián)。
本發(fā)明采用柱上聚合法制備聚合血紅蛋白，為了使血紅蛋白四聚體進行較為均一的聚合，我們將在原有反應(yīng)裝置上加裝一個可以對血紅蛋白四聚體進行富集的色譜柱，這根色譜柱可以對血紅蛋白四聚體和聚合度不同的聚合血紅蛋白進行分離。當混合液在反應(yīng)體系中循環(huán)時，四聚體和聚合度較低的聚合血紅蛋白會因為保留時間較長，而在色譜柱中富集。如果在色譜柱以外的部分Hb濃度較低且溶液中含有戊二醛，則聚合反應(yīng)主要在色譜柱中進行。聚合度較高的聚合血紅蛋白在色譜柱中的時間短，抑止了其進一步的聚合，使得聚合反應(yīng)趨于均一化。在制備過程中，吸附的血紅蛋白在固相上的密度以及與參與反應(yīng)的戊二醛的摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、緩沖液的性質(zhì)及其pH值，對于制備的聚合血紅蛋白的純度及其產(chǎn)率有很大的影響。
本發(fā)明采用0～30℃作為反應(yīng)溫度，填料采用的是凝膠阻滯色譜介質(zhì)，所使用緩沖液的pH值在5～9之間。反應(yīng)時間隨pH值減小而增大，所以反應(yīng)一般為3～20小時。時間再延長，聚合血紅蛋白的產(chǎn)率不再增加。血紅蛋白與色譜填料的比例以及與戊二醛的摩爾比，對于制備的聚合血紅蛋自分子量的均性至關(guān)重要。本發(fā)明在1～100mg血紅蛋白/ml填料和戊二醛與血紅蛋白摩爾比為10～50∶1的范圍內(nèi)優(yōu)化反應(yīng)物的配比。實驗結(jié)果表明在20～60mg血紅蛋白/ml填料和1 5～30∶1(戊二醛與血紅蛋白的摩爾比)的配比下，聚臺血紅蛋白基本上是兩個分子聚合的血紅蛋白，而且產(chǎn)率較高。而高于這一配比，聚合血紅蛋白的產(chǎn)率有所增加，但是有較多聚血紅蛋白生成。因此，本發(fā)明采用這一配比制備聚合產(chǎn)物。

圖1為本發(fā)明所涉一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法的裝置圖。
其中1、儲液器，2、泵，3、色譜柱。
圖2為本發(fā)明所涉一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法的聚合血紅蛋白樣品的SEC-HPLC結(jié)果曲線圖。
具體實施方式
以下將通過具體實施方式
的形式再對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的具體實施方式
，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1取5g濃度為75mg/ml的PLP修飾后的人血紅蛋白溶液(pH＝7.4)在20℃通氮2小時，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)。裝填Φ1.6×30cm Superdex S-300凝膠阻滯交換柱，用脫氧后的10mM PBS(pH＝7.4)緩沖液平衡(裝置圖見圖1)。將血紅蛋白溶液泵入色譜柱中循環(huán)，并使儲液器中溶液最終體積為40ml。1小時后，分10次每隔0.5小時，向儲液器中加入7.7ml戊二醛。繼續(xù)反應(yīng)2小時。最后用10mM PBS緩沖液(pH7.4)洗脫。收集物超濾濃縮后，用硼氫化鈉還原。超濾濃縮。收集物用TSK 3000sw凝膠過濾柱，流動相為1/15M PBS+0.1M NaCl(pH7.2)，流速為0.50ml/min，洗脫物在280nm紫外光下檢測。可檢測到3個洗脫峰(色譜圖見圖2)。根據(jù)洗脫時間，可確定前兩個洗脫峰的分子量均小于200kD。第三個為未反應(yīng)的血紅蛋白。
權(quán)利要求
1.一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將天然血紅蛋白進行化學(xué)修飾或預(yù)聚合。(2)將修飾或預(yù)聚合的血紅蛋白充分脫氧后用泵加入凝膠阻滯色譜柱中平衡，然后分步加入雙功能交聯(lián)劑進行聚合反應(yīng)，血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為1∶10～1∶50。(3)用緩沖溶液將步驟1生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應(yīng)，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～10∶1，反應(yīng)時間1～3小時。最后超濾濃縮。(4)采用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理后，再用超濾、層析等方法對該產(chǎn)物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所用的血紅蛋白來源于人血紅蛋白、牛血紅蛋白、豬血紅蛋白或其它哺乳動物血紅蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中加入適量修飾劑、分子內(nèi)交聯(lián)劑或其他雙功能交聯(lián)劑進行預(yù)交聯(lián)。例如用分子內(nèi)交聯(lián)劑，如1～4倍摩爾比的NFPLP、DBBF或其他雙功能交聯(lián)劑如3～8倍摩爾比戊二醛進行預(yù)交聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中加入的雙功能交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中色譜柱填料為凝膠阻滯色譜介質(zhì)，緩沖液pH值為5.0～9.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中脫氧方法，包括減壓真空抽氣脫氧與惰性氣體鼓泡式脫氧。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的反應(yīng)時間為3～20小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的反應(yīng)溫度為0～30℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中血紅蛋白與同型雙功能試劑摩爾比為1∶10～50。
專利摘要
一種凝膠阻滯色譜柱上聚合制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白的方法，它將天然血紅蛋白用泵加入凝膠阻滯色譜中平衡，然后分布加入雙功能交聯(lián)劑進行聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為0～30℃，pH值為5.0～9.0反應(yīng)時間3～10小時；血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為1∶10～1∶50。用氨基的緩沖溶液將生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集。收集液用甘氨酸或賴氨酸中止反應(yīng)，戊二醛與甘氨酸(賴氨酸)的摩爾比為2～3∶1。超濾濃縮。采用硼氫化鈉對得到的聚合血紅蛋白進行還原處理后，再用超濾、層析等方法對該產(chǎn)物進行分離純化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血紅蛋白。
文檔編號A61P7/00GK1990038SQ200510136022
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日
發(fā)明者楊成民, 王翔, 黃磊, 李燊, 張鴻輝, 梁偉光, 李洪英, 許麗麗, 王勁峰, 由英才 申請人:天津協(xié)和生物科技發(fā)展有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan