專利名稱:阻斷c5a受體的化合物及其在治療中的應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及結(jié)合C5a受體(C5aR)并阻斷由內(nèi)源性C5a介導(dǎo)的炎性和免疫調(diào)節(jié)活性，以治療炎性疾病和疾病狀況的化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及C5a受體(C5aR)N末端氨基酸序列用于選擇和開發(fā)抗C5aR化合物的用途。
我們的先天免疫系統(tǒng)保護(hù)身體不被外來侵入者(例如，細(xì)菌、病毒、真菌和癌細(xì)胞)入侵。此系統(tǒng)最重要的細(xì)胞是單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。識別后它們攝取并殺死入侵者如細(xì)菌、真菌和病毒。由于它們是身體的第一道防線的一部分，因而其最重要的任務(wù)是盡可能快地殺死并去除侵入者。這通過極具攻擊性的物質(zhì)(如自由基和酶)來完成，這些物質(zhì)不僅對入侵者是致命的，也導(dǎo)致鄰近宿主細(xì)胞的損傷。來自這些被損傷的細(xì)胞和先天系統(tǒng)本身局部激活的細(xì)胞的物質(zhì)將進(jìn)一步吸引更多數(shù)量的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，引發(fā)局部炎癥。一旦所有的入侵者被殺死并去除，同時(shí)去除了該進(jìn)程中被殺死的多種細(xì)胞，炎癥將平息。然后，炎癥反應(yīng)所引發(fā)的創(chuàng)傷開始康復(fù)。
在一些情況下，這種由嗜中性粒細(xì)胞的過度激活而導(dǎo)致的攻擊性破壞性炎癥反應(yīng)過度強(qiáng)烈，或者甚至在沒有感染性觸發(fā)的情況下啟動(dòng)。在一些情況下，這種炎癥反應(yīng)是形成嚴(yán)重的、有時(shí)候致死性紊亂的原因，其包括像成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、血栓活動(dòng)如心臟病發(fā)作和中風(fēng)后的嚴(yán)重組織損傷、炎性腸道疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
補(bǔ)體(C)系統(tǒng)是先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵成員，在宿主抗病原體中扮演中樞角色。它還是啟動(dòng)炎癥的強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)器，如果不加調(diào)節(jié)，能夠?qū)е乱l(fā)嚴(yán)重組織損傷的病理。當(dāng)細(xì)菌已經(jīng)侵入身體并且，例如感染了中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如在腦膜炎中)時(shí)，微生物來源的物質(zhì)導(dǎo)致補(bǔ)體因子5(C5)轉(zhuǎn)化酶-復(fù)合體的激活，其將補(bǔ)體系統(tǒng)的C5轉(zhuǎn)化為其活化的C5a形式。C5a是化學(xué)引誘劑激活并從血管吸引細(xì)胞(遷移過程)的物質(zhì)。嗜中性粒細(xì)胞對這兩種物質(zhì)起反應(yīng)，也對白介素-8(IL-8)起反應(yīng)。
活化的嗜中性粒細(xì)胞能夠輕易地從血管遷移。這是因?yàn)榛瘜W(xué)引誘劑、微生物產(chǎn)物和來自活化單核細(xì)胞的物質(zhì)將增加血管的通透性并刺激血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)某些粘附分子。嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)選擇蛋白和整聯(lián)蛋白(例如，CD11b/CD18)，其結(jié)合這些粘附分子。一旦嗜中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞，其能夠在化學(xué)引誘劑/趨化因子的引導(dǎo)下通過細(xì)胞遷移到感染部位，此處這些物質(zhì)的濃度最高。
這些物質(zhì)還激活嗜中性粒細(xì)胞以生產(chǎn)一定范圍的其他分子，其中一些吸引更多的嗜中性粒細(xì)胞(接著是單核細(xì)胞)，但它們主要負(fù)責(zé)破壞入侵細(xì)菌。一些這樣的物質(zhì)(例如，自由基、降解蛋白質(zhì)的酶(蛋白酶)和降解細(xì)胞膜的酶(脂肪酶))具有如此的反應(yīng)性和非特異性，以致來自周圍組織的細(xì)胞(和嗜中性粒細(xì)胞本身)被破壞，引發(fā)組織損傷。此損傷由于源于血液的液體的存在而加劇，所述的流體越過滲漏的血管壁，造成總是伴隨炎癥的腫脹(稱為水腫)。此過多的液體所引發(fā)的壓力增大導(dǎo)致更多的細(xì)胞損傷和死亡。
在以后的炎癥過程中，單核細(xì)胞遷移到現(xiàn)場而激活。除了在去除細(xì)菌和細(xì)胞碎片中的作用，它們還生產(chǎn)一些物質(zhì)如腫瘤壞死因子(TNF)和IL-8，其繼而吸引更多活化的嗜中性粒細(xì)胞，引發(fā)更多的局部損傷。TNF還對嗜中性粒細(xì)胞有直接的刺激效應(yīng)。一旦全部入侵者已被去除，炎癥反應(yīng)將平息，所述區(qū)域的剩余″傷亡″將被清理。然后創(chuàng)傷愈合進(jìn)程開始。通常，損傷的組織將被主要由成纖維細(xì)胞和膠原形成的疤痕組織所取代。當(dāng)炎癥在身體具有重要功能的區(qū)域例如由心肌細(xì)胞、腦細(xì)胞或肺泡細(xì)胞形成的組織中發(fā)生時(shí)，正常功能將被形成的疤痕所損害，引發(fā)嚴(yán)重癥狀如心力衰竭、麻痹和肺氣腫。為了最小化這些癥狀的衰弱性后果，盡可能快地“阻抑”所述的炎癥反應(yīng)是重要的。
干預(yù)以控制所述的急性早期炎癥反應(yīng)為許多具有可歸因于上述事件的癥狀的受試者提供了改善預(yù)后的機(jī)會(huì)。這樣的方法已被提倡用于許多基于急慢性炎癥的疾病，而且相關(guān)疾病模型中的研究結(jié)果顯示其具有潛力。在功效或安全性方面，經(jīng)典抗炎藥如甾體類和非甾體類抗炎藥(NSAIDS)不具有所述的理想作用譜。甾體類影響″錯(cuò)誤的″細(xì)胞類型(單核細(xì)胞)，并且其阻抑作用很容易被繞開。NSAIDS通常顯示相對溫和的效果，這部分地是由于它們是在炎性進(jìn)程晚期介入的。兩類藥物都由于其藥理學(xué)活性的其他方面而產(chǎn)生一定程度的不良副作用。直接而特異地防止嗜中性粒細(xì)胞的遷移和活化的藥物可能具有許多好處。幾種尚處于早期開發(fā)中的藥物只干擾嗜中性粒細(xì)胞活化(例如C5轉(zhuǎn)化酶抑制劑、抗C5a的抗體、C5a受體阻斷藥物)和遷移(抗嗜中性粒細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白(象CD11b/CD18)和L-選擇蛋白的抗體以及抗內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子(像ICAM-1和E-選擇蛋白)的抗體)的一個(gè)方面?？筎NF和IL-8的抗體在慢性炎癥中有影響，但在急性炎癥中只有邊緣性的作用，因?yàn)閱魏思?xì)胞(其主要負(fù)責(zé)這些物質(zhì)的產(chǎn)生)在急性期中起的作用最小。
有時(shí)，急性炎癥的成因不能去除，從而炎癥變成慢性的。除肺結(jié)核、慢性肝炎和某些其他適應(yīng)癥之外，在感染中很少出現(xiàn)這樣的情況。然而，慢性炎癥還可以由非細(xì)菌的刺激例如自身免疫反應(yīng)所引起。研究已顯示在慢性炎癥中單核細(xì)胞的作用突出得多，嗜中性粒細(xì)胞遷移和活化、單核細(xì)胞遷移和活化、組織損傷、死亡細(xì)胞的去除和創(chuàng)傷愈合都同時(shí)發(fā)生。細(xì)胞與許多不同細(xì)胞因子和趨化因子之間相互作用的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)已成為許多年集中研究的課題。人們曾經(jīng)相信單核細(xì)胞及其產(chǎn)物是阻抑慢性炎癥所需要抑制的最重要的成分。這解釋了為什么與單核細(xì)胞特異地相互作用的甾體類通常相對于急性炎癥在慢性炎癥中更為有效。然而長期用甾體類治療不是理想的選擇，因?yàn)樵诋a(chǎn)生臨床效果所需的劑量下，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不可接受的副作用。后來使用抗TNF或IL-8抗體的治療顯示了良好效果，而且最初被視為單核細(xì)胞在慢性炎癥中起主要作用的證據(jù)。但新近的研究對單核細(xì)胞在炎癥中獨(dú)一無二的作用提出了疑問，并指出嗜中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵性作用，目前看來嗜中性粒細(xì)胞代表了治療干預(yù)的更好的靶標(biāo)。
慢性炎性癥狀的潛在病因并不總是清楚的，而且最初的病因可能不會(huì)總是導(dǎo)致將來的復(fù)發(fā)。一些科學(xué)家相信在某些慢性炎性疾病中存在事件的連續(xù)循環(huán)。他們的想法是現(xiàn)有的活化嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞持續(xù)地吸引和活化新的細(xì)胞群，這樣，即使最初的刺激已不復(fù)存在，炎癥反應(yīng)也將無限地持續(xù)下去。這暗示，使用嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞活化的有效抑制劑進(jìn)行急性和周期性治療，可能終止新細(xì)胞募集的循環(huán)，從而適時(shí)地導(dǎo)致病癥進(jìn)展的改變，或者甚至是完全治愈，而不僅僅是癥狀的減輕。
希望發(fā)現(xiàn)可用于炎癥治療的替代性化合物。
一種有希望的候選化合物是具有炎癥抑制特性的新藥物，其發(fā)現(xiàn)于生長中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)的胞外基質(zhì)中，命名為來自于金黃色葡萄球菌的趨化性抑制蛋白(CHIPS)，如WO00/02913中所述。在fMLP-和C5a-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化性中，發(fā)現(xiàn)CHIPS抑制fMLP-和C5a-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化。使用FITC-標(biāo)記的CHIPS發(fā)現(xiàn)，CHIPS以不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合C5aR和FPR二者。這些受體屬于趨化因子受體家族，它們都是7次跨膜的異源三聚體G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的成員。嗜中性粒細(xì)胞在其表面上包含該受體家族的幾個(gè)成員，包括甲?；?、C5a、C3a、PAF和LTB4的受體，以及分別識別IL-8和NAP/GRO/ENA的趨化因子受體CXCR1和CXCR2。GPCR具有胞外的N-端部分、三個(gè)胞外和三個(gè)胞內(nèi)環(huán)和胞內(nèi)C-端部分。
然而，預(yù)期完整分子太大而不能用于治療。此外，發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予個(gè)體CHIPS時(shí)，由于預(yù)先存在抗這種細(xì)菌毒力因子的抗體而導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成。
因此本發(fā)明的目的是提供具有炎癥抑制特性的替代性化合物。
本發(fā)明基于CHIPS與C5aR相互作用并因此抑制C5a介導(dǎo)的活化作用的研究。由文獻(xiàn)得知C5a在兩個(gè)不同的位點(diǎn)識別位點(diǎn)和活化位點(diǎn)結(jié)合其受體。認(rèn)為識別位點(diǎn)位于C5aR N-端殘基21-30片段。然而，存在于C5aR N-端位置10、15、16和18的天冬氨酸對于受體對C5a的結(jié)合親和性似乎也是關(guān)鍵的。
這些結(jié)果使本發(fā)明人想到，C5a結(jié)合于由氨基酸21-30組成的識別位點(diǎn)，并且通過C5aR N-端殘基10-18與C5aR包外環(huán)的分子內(nèi)接觸穩(wěn)定如此獲得的構(gòu)象。該結(jié)合和穩(wěn)定化將C5a置于適當(dāng)?shù)奈恢?，以通過其C末端活化位點(diǎn)激活所述受體。
發(fā)明人使用兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)，在HEK293細(xì)胞中表達(dá)完整C5aR和單獨(dú)表達(dá)C5aR N-端。由此發(fā)現(xiàn)CHIPS主要結(jié)合到C5aR N-端。
C5aR N-端定點(diǎn)突變研究驚奇地證實(shí)，CHIPS-結(jié)合位點(diǎn)不位于C5a識別位點(diǎn)(氨基酸21-30)?？雌饋鞢HIPS通過C5aR N端殘基10-18區(qū)域而防止所述氨基酸10-18與C5aR胞外環(huán)的分子內(nèi)接觸。位置10、15和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)在這里起重要作用。
完整C5aR的N-端定點(diǎn)突變顯示，D18和G12是涉及CHIPS結(jié)合的最重要的氨基酸，但至少兩個(gè)天冬氨酸突變的組合對于完全抑制CHIPS的結(jié)合是必需的。
C5aR的氨基酸38-350不涉及CHIPS的結(jié)合。
另外，在核磁共振(NMR)中，使用包含氨基酸7至28的磺酸化C5aR-衍生肽(這里稱為“SO4-C5AR pep7-28”)，其中用C5aR-pep7-28滴定5N-標(biāo)記的CHIPSΔ30(CHIPS減去前30個(gè)氨基酸)，發(fā)現(xiàn)了CHIPSΔ30中涉及結(jié)合C5aR N端的確切的氨基酸。最明顯涉及的氨基酸是R46、K50、K51、G52、K54、E60、K100、K101、G102、K105、Y108、V109、和Y121，但下列的氨基酸可能也涉及CHIPS與C5aR-N-端的結(jié)合T37，L38，R44，L45，N47，Y48，L49，T53，A57，F(xiàn)59，K61，V63，I64，L65，Y71，T73，L76，L80，D83，R84，K85，E88，L89，G91，M93，T96，Y97，E103，I110，N111，和K115。
初步試驗(yàn)使用了兩個(gè)CHIPS突變體，它們含有賴氨酸突變K50、K51+K54和K100、K101+K105，初步試驗(yàn)確實(shí)地顯示這兩個(gè)賴氨酸區(qū)域都涉及CHIPS與C5aR的結(jié)合。
因此，本發(fā)明基于CHIPS與C5aR的精確結(jié)合位置信息。另外，本發(fā)明還提供了有關(guān)CHIPS分子內(nèi)涉及結(jié)合C5aR的氨基酸的信息。然后將上述雙重發(fā)現(xiàn)用于開發(fā)抗-C5aR化合物，所述化合物可以是CHIPS-衍生的化合物或者非CHIPS-衍生的化合物。
因而本發(fā)明涉及化合物，該化合物能夠防止人C5aR的N-端殘基10至18與其胞外環(huán)的分子內(nèi)接觸。特別地，本發(fā)明涉及化合物，該化合物能夠結(jié)合到人C5a受體(C5aR)中的下列殘基位置10、15、和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)。
本發(fā)明更特別地涉及如下通式的化合物
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm (I)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段(stretch)；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X39、X7和X11各自分別是39、7或11個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
具體而言，本發(fā)明涉及如下通式的化合物
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm (II)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X、X2、X3、X5、X11和X39各自分別是1、2、3、5、11和39個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段。
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述化合物具有通式
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm (III)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X11和X16各自分別是1、2、3、4、5、6、7或16個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；并且有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述化合物具有通式
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm (IV)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
I是異亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X、X2、X3和X5，各自分別是1、2、3或5個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
在式I中，Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-90個(gè)，更優(yōu)選-75個(gè)，最優(yōu)選1-59個(gè)。
在式II中，Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-50個(gè)，更優(yōu)選1-25個(gè)，最優(yōu)選1-15個(gè)。
在式III和IV中，Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-50個(gè)，更優(yōu)選1-25個(gè)，最優(yōu)選1-6個(gè)。
更具體的實(shí)施方案是CHIPSΔ1，CHIPSΔ17，CHIPSΔ30，其缺少天然產(chǎn)生的CHIPS N末端結(jié)構(gòu)域的1、17和30個(gè)氨基酸。天然CHIPS不包括于本發(fā)明所要求的范圍內(nèi)。
因此本發(fā)明涉及具有骨架的化合物，在所述骨架中，與CHIPS中相同或相似的氨基酸殘基以與CHIPS中相同或相似的構(gòu)象存在，這允許它們結(jié)合于C5aR的10、15和18位天冬氨酸(D10、D15和D18)和12位甘氨酸(G12)。涉及結(jié)合的CHIPS的氨基酸殘基的鑒定是生產(chǎn)一系列化合物的基礎(chǔ)，這些化合物可能差異很大，但是有一個(gè)共同之處，即所需構(gòu)象中的結(jié)合殘基。在此基礎(chǔ)上，分子建模領(lǐng)域的技術(shù)人員通過使用抗體或所謂的結(jié)合體(bindingbodies)，通過篩選肽文庫或其他使用這些序列為模板的方法，將能設(shè)計(jì)出滿足這些要求并因此能用于涉及C5aR的適應(yīng)癥的治療的化合物。
可以通過多種方式來在本發(fā)明的化合物中提供與天然CHIPS構(gòu)象相同或相似的結(jié)合殘基，例如通過以氨基酸、非成蛋白質(zhì)性類似物、或跨越相同空間距離的其他分子來連接熱點(diǎn)。
或者，可以用從C5aR方面獲得的信息由化合物文庫篩選結(jié)合C5aR的化合物。因此本發(fā)明提供了鑒定能夠結(jié)合C5aR的化合物的方法，包括
a)提供候選化合物文庫，
b)將文庫成員與C5aR相關(guān)化合物接觸，該C5aR相關(guān)化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分別是0-9、1、2和0-20個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以與天然C5aR中發(fā)現(xiàn)的相同或相似的構(gòu)象存在，
c)鑒定結(jié)合C5aR相關(guān)化合物的文庫成員，C5aR相關(guān)化合物可以是C5aR本身或至少包含目前發(fā)現(xiàn)涉及結(jié)合天然構(gòu)象形式的CHIPS的殘基。
以上方法可以進(jìn)一步包括提供如此鑒定的成員，以用于預(yù)防或治療的步驟。本發(fā)明還涉及這樣鑒定的化合物和其用途。
適合地，具有CHIPS中發(fā)現(xiàn)的C5aR結(jié)合殘基的化合物為肽或多肽。然而，所有的這些肽可以作為起點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步修飾，例如用其他構(gòu)建單元取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
具有結(jié)合C5aR能力的肽可以通過已知的化學(xué)合成方法制備。通過合成方法構(gòu)建肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些合成的肽由于與涉及結(jié)合C5aR的CHIPS的序列段有共同的一級，二級和/或三級結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象特征，將擁有與之相同的活性，指結(jié)合C5aR的性質(zhì)。因此，這樣合成生產(chǎn)的肽，可以作為生物學(xué)活性上或免疫上的替代物來替代具有所需的C5aR結(jié)合能力并由成蛋白質(zhì)性氨基酸組成的(多)肽。
這里提供的化合物還包括以氨基酸序列為特征的化合物，在所述氨基酸序列中天然地提供了或者有意地引入了修飾。肽的修飾可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的常規(guī)技術(shù)完成?；衔镄蛄兄懈信d趣的修飾包括置換、插入或缺失編碼序列中所選擇的氨基酸殘基。
在一些實(shí)例中，肽在藥物中使用的潛能可能由于幾種原因而受到限制。例如肽可能過于親水而不能穿過像細(xì)胞膜和血腦屏障之類的膜，可能通過腎臟和肝臟迅速地從體內(nèi)排出，從而導(dǎo)致低的生物利用度。另外，由于可能被蛋白酶迅速降解，例如在胃腸道中，肽的生物穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性可能較差。同樣，肽通常是可呈現(xiàn)為數(shù)千種構(gòu)象的柔性化合物。生物活性構(gòu)象通常只是這些可能性中的一種，其有時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致對靶受體例如C5aR的低選擇性和親和性。最后，肽的效力可能不足以用于治療目的。
由于上述缺陷，肽有時(shí)主要用作設(shè)計(jì)其他藥物的來源，而本身不作為實(shí)際藥物。在這種情況下，需要開發(fā)減少了這些缺陷的化合物。肽的替代物為所謂的肽模擬物。以本發(fā)明的化合物為基礎(chǔ)的肽模擬物也是本申請的一部分。在那種情況下，一個(gè)或多個(gè)氨基酸被肽模擬物構(gòu)建單元所取代。
文獻(xiàn)中描述了肽模擬物的多種定義。其中，將肽模擬物描述為“設(shè)計(jì)用于將肽中包含的信息轉(zhuǎn)變?yōu)樾⌒头请慕Y(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)”，“模擬肽的生物學(xué)活性但不包含任何肽鍵的分子”，“在與受體和酶相互作用中作為肽的合適替代物的結(jié)構(gòu)”以及“化學(xué)特洛伊木馬”。
總體上，肽模擬物可分為兩類。第一類由具有非肽樣結(jié)構(gòu)的化合物組成，通常是其上附著了藥效基團(tuán)的支架。因此，它們是低分子量化合物，并且與天然肽無結(jié)構(gòu)相似性，因此對蛋白水解酶的穩(wěn)定性更高。
第二類主要的肽模擬物由具有與肽相似的模塊構(gòu)造的化合物即寡聚肽模擬物組成。這些化合物可通過肽側(cè)鏈或肽骨架的修飾而獲得。后一類肽模擬物可認(rèn)為是通過用其他部分替換肽的酰胺鍵而由肽衍生的。因此，預(yù)期這些化合物對于蛋白酶降解更加不敏感。酰胺鍵的修飾也影響其他特征，例如親脂性，氫鍵容量，構(gòu)象柔性，這在有利的實(shí)例中可能導(dǎo)致化合物的藥理學(xué)和/或制藥學(xué)特性全面改善。
寡聚肽模擬物原則上可從單體構(gòu)建單元起始，在反應(yīng)步驟的重復(fù)循環(huán)中制備。因此，這些化合物可能適合于自動(dòng)合成，類似于已經(jīng)完善的在肽合成儀中制備肽的方法。單體構(gòu)建單元的另一種應(yīng)用在于制備肽/肽模擬物雜交體組合天然氨基酸和肽模擬物構(gòu)建單元來生成只有一些酰胺鍵被替代的產(chǎn)物。這可使化合物與天然肽的差異足夠大，以獲得增強(qiáng)的生物穩(wěn)定性，但仍具有與原始結(jié)構(gòu)足夠的相似性，以保留生物活性。
用于本發(fā)明的合適的肽模擬物構(gòu)建單元是酰胺鍵替代物(surrogates)，例如寡聚-β-肽(Juaristi，E.Enantioselective Synthesis of b-Amino Acids；Wiley-VCHNew YorK，1996)，插烯肽(vinylogous peptides)(Hagihari，M.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)，擬肽(peptoids)(Simon，R.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，9367-9371；Zuckermann，R.N.等，J.Med.Chem.1994，37，2678-2685；Kruijtzer，J.A.W.&Liskamp，R.M.J.TetrahedronLett.1995，36，6969-6972)；Kruijtzer，J.A.W.Thesis；Utrecht University，1996；Kruijtzer，J.A.W.等，Chem.Eur.J.1998，4，1570-1580)，寡砜(oligosulfones)(Sommerfield，I.&Seebach，D.Angew.Chem.，Int.Ed.Eng.1995，34，553-554)，磷酸二酯(Lin，P.S.；Ganesan，A.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，511-514)，寡聚磺酰胺(Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1991，32，409-412；Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1992，33，6389-6392；Moree，W.J.等，Tetrahedron 1993，49，1133-1150；Moree，W.J.Thesis；Leiden University，1994；Moree，W.J.等，J.Org.Chem.1995，60，5157-5169；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，3035-3040；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.1996，4，667-672；Lwik，D.W.P.M.Thesis；Utrecht University，1998)，擬肽磺酰胺(van Ameijde，J.&Liskamp，R.M.J.Tetrahedron Lett.2000，41，1103-1106)，插烯磺酰胺(vinylogous sulfonamides)(Gennari，C.等，Eur.J.Org.Chem.1998，2437-2449)，azatides(或肼基肽)(Han，H.&Janda，K.D.J.Am.Chem.Soc.1996，118，2539-2544)，寡聚氨基甲酸酯(Paikoff，S.J.等，Tetrahedron Lett.1996，37，5653-5656；Cho，C.Y.等，Science 1993，261，1303-1305)，脲擬肽(ureapepoids)(Kruijtzer，J.A.W.等，Tetrahedron Lett.1997，38，5335-5338；Wilson，M.E.&Nowick，J.S.Tetrahedron Lett.1998，39，6613-6616)和oligopyrrolinones(Smith III，A.B.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)。
已經(jīng)開發(fā)了插烯肽和oligopyrrolinones，用于形成類似于肽的那些二級結(jié)構(gòu)(β-鏈構(gòu)象)，或模擬肽的二級結(jié)構(gòu)。預(yù)期所有這些寡聚肽模擬物都是抗蛋白酶的，可以在高產(chǎn)率偶聯(lián)反應(yīng)中從光學(xué)活性單體(除了擬肽)裝配。
肽磺酰胺由包含一個(gè)或多個(gè)磺酰胺過渡態(tài)等排物的α-或β-取代氨基乙烷磺酰胺組成，所述磺酰胺過渡態(tài)等排物為酰胺鍵的水解類似物。已發(fā)現(xiàn)包含酰胺鍵水解的過渡態(tài)類似物的肽類似物在蛋白酶抑制劑如HIV-蛋白酶抑制劑開發(fā)中的廣泛用途。
另一種開發(fā)寡聚肽模擬物的方法是，通過用不可水解的替代物如氨基甲酸酯、砜、脲和磺胺基團(tuán)替換所有的酰胺鍵，從而完全修飾肽的骨架。這樣的寡聚肽模擬物可能具有增強(qiáng)的代謝穩(wěn)定性。最近，已設(shè)計(jì)出以酰胺為基礎(chǔ)的替代性寡聚肽模擬物，即N-取代的甘氨酸寡肽，所謂的擬肽。擬肽的特點(diǎn)是氨基酸側(cè)鏈存在于酰胺氮上，而不象肽中那樣存在于α-C原子上，這導(dǎo)致代謝穩(wěn)定性增強(qiáng)，同時(shí)消除骨架的手性。手性α-C原子的缺失可認(rèn)為是優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閷τ跀M肽來說不再存在肽中存在的空間限制。另外，擬肽中側(cè)鏈與羰基之間的空間與肽中相同。盡管肽與擬肽不同，但已表明它們產(chǎn)生生物活性化合物。
將肽鏈翻譯成擬肽肽模擬物可能產(chǎn)生擬肽(直接翻譯)或反擬肽(retropeptoid)(反序列)。在后一類中保持了羰基對側(cè)鏈的相對方向，因此與親本肽更為相似。
此處將有關(guān)肽模擬物的綜述性文章引入作為參考Adang，A.E.P.等；Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，63-78；Giannis，A.&Kolter，T.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1993，32，1244-1267；Moos，W.H.等，Annu.Rep.Med.Chem.1993，28，315-324；Gallop，M.A.等，J.Med.Chem.1994，37，1233-1251；Olson，G.L.等，J.Med.Chem.1993，36，3039-30304；Liskamp，R.M.J.Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，1-19；Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，305-307；Gante，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，1699-1720；Gordon，E.M.等，Med.Chem.1994，37，1385-1401；和Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，633-636。
因此，本發(fā)明還涉及這樣的化合物，它們本身不是肽或多肽，但具有與本發(fā)明的化合物相似的結(jié)構(gòu)和功能。這種分子的例子有上述的肽模擬物，還有其中一個(gè)或多個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸被非成蛋白質(zhì)性氨基酸或D-氨基酸所取代的化合物。當(dāng)本申請中涉及化合物時(shí)，還將包括這樣的其他化合物，這些化合物具有與原始肽化合物相似或相同的結(jié)構(gòu)和功能，因此也就具有相似或相同的生物學(xué)活性。
更具體而言，可用于取代的非成蛋白質(zhì)性氨基酸選自下列2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-環(huán)己基丙氨酸(Cha)、對-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、對-苯甲?；奖彼?Bpa)、鳥氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))、4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))、4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))、4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
在本發(fā)明的化合物中取代成蛋白質(zhì)性氨基酸的合適的D-氨基酸為例如選自下列D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-組氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-賴氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸、D-蘇氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-環(huán)己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(DPhe(p-NH2))、對-苯甲?；?D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鳥氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br))、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-TYr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
本發(fā)明化合物中的一個(gè)或多個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸可由例如選自下列的擬肽構(gòu)建單元所取代N-取代的甘氨酸，如N-芐基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲?；谆?甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲?；一?甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羥乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羥丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(對羥基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
本發(fā)明的所有化合物也可以是環(huán)狀的。環(huán)狀化合物可以具有改善的效力、穩(wěn)定性、剛性和/或其他制藥學(xué)和/或藥理學(xué)特征。
另一方面，本發(fā)明涉及抗C5aR或C5aR相關(guān)化合物的抗體或其衍生物，該C5aR相關(guān)化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20個(gè)的序列段。這里所用的衍生物是眾所周知的具有抗體的特異性但不是完整抗體的化合物。衍生物的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括scFv、Fab片段、嵌合抗體、雙功能抗體及其他。
本發(fā)明化合物的功能活性可通過多種方法測定?？赏ㄟ^用流式細(xì)胞儀測定化合物防止熒光-C5a(如FITC-C5a)結(jié)合嗜中性粒細(xì)胞的能力而測定化合物的C5aR結(jié)合活性。
也可通過趨化性試驗(yàn)如轉(zhuǎn)孔系統(tǒng)(Transwell system)測定化合物防止嗜中性粒細(xì)胞向C5a遷移的能力而測定化合物的活性。另外，基于趨化因子包括C5a啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度迅速瞬時(shí)提高的能力的試驗(yàn)，可用于篩選本發(fā)明化合物的生物學(xué)活性?；蛘?，基于趨化因子包括C5a啟動(dòng)例如彈性蛋白酶的分泌的能力的試驗(yàn)，可用于篩選本發(fā)明的化合物的生物學(xué)活性，其中彈性蛋白酶由細(xì)胞松弛素B刺激的嗜中性粒細(xì)胞分泌?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的多種其他試驗(yàn)，包括但不限于多種鈣特異性熒光探針與流式細(xì)胞儀或熒光測定法、或微量生理測定組合。作為用于以任何方法篩選生物學(xué)活性的細(xì)胞，例如可以使用新分離的嗜中性粒細(xì)胞或用C5aR、野生型或突變形式的該受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療涉及嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的C5a受體(C5aR)的適應(yīng)癥。這類適應(yīng)癥可涉及急性或慢性炎癥反應(yīng)，可選自表4所列出的組。表4并不意味著限制本發(fā)明化合物的可能用途。化合物在未來的適應(yīng)癥中的用途也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述化合物在預(yù)防或治療涉及除嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥。其他細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、Kupfer細(xì)胞、肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
本發(fā)明的化合物也可用于針對由產(chǎn)CHIPS細(xì)菌如金黃色葡萄球菌引起的感染的預(yù)防性或治療性疫苗中。
本發(fā)明的化合物也可用于制備涂覆組合物，用于通過皮膚介入人體的或在手術(shù)過程中置于體內(nèi)的醫(yī)學(xué)裝置表面上。該表面可以是導(dǎo)管尖端的表面。適合地，所述組合物為緩釋組合物。
本發(fā)明涉及化合物本身以及如上所述的化合物的多種用途。另外，本發(fā)明提供治療性和預(yù)防性組合物，包含合適的賦形劑和一種或多種所要求的化合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥，該方法包括給藥預(yù)防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。所要治療的適應(yīng)癥與上述相同。
在其另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及除嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥，所述方法包括給藥預(yù)防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。所述的其他細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、Kupfer細(xì)胞、肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
本發(fā)明的對受試者進(jìn)行抗產(chǎn)CHIPS細(xì)菌感染的預(yù)防或治療性處理的方法，該方法包括施用預(yù)防或治療有效量的一種或多種所要求的化合物。
標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼編碼20種氨基酸，這些氨基酸被稱為成蛋白質(zhì)性(proteinogenic)(構(gòu)成蛋白質(zhì))的。在自然界中已發(fā)現(xiàn)500種以上的其他氨基酸。這些其他的氨基酸此處稱為“非成蛋白質(zhì)性氨基酸”。
蛋白中的所有氨基酸呈現(xiàn)出與L-甘油醛相同的絕對空間構(gòu)型。因此，它們都是L-氨基酸。D-氨基酸從未在蛋白中發(fā)現(xiàn)，盡管它們存在于自然界中。此處將其稱為“D-氨基酸”。
肽模擬物(peptidomimetic)是包括非肽結(jié)構(gòu)成分、能模仿或拮抗天然親本肽的生物學(xué)作用的化合物。肽模擬物不再有經(jīng)典的肽特征如肽鍵。肽模擬物的組成部分此處稱為“肽模擬物構(gòu)建單元”(peptidomimetic building blocks)。
所有特定氨基酸的非蛋白質(zhì)變異體此處稱為“其非成蛋白質(zhì)性類似物”。
將進(jìn)一步在下述實(shí)施例中闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例不意味著以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中參考下述附圖
圖1顯示CHIPS-FITC與C5aR N末端的結(jié)合，C5aR N末端包括不同的點(diǎn)突變和缺失，用pDISPLAY載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。
圖2A顯示CHIPS-FITC與完整C5aR的結(jié)合，C5aR其N末端包含不同的點(diǎn)突變和缺失，用pcDNA3.1載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。
圖2B顯示CHIPS-FITC與完整C5aR和C5aR嵌合體的結(jié)合，其中N末端和胞外環(huán)由其他G蛋白偶聯(lián)受體的相應(yīng)區(qū)域所交換。在大多數(shù)嵌合體中也構(gòu)建了額外的D10A突變。所有受體均使用pcDNA3.1載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。
圖3顯示包含7-28位氨基酸的SO4-C5aR-N末端肽對CHIPS-FITC結(jié)合野生型C5aR的抑制，該野生型C5aR表達(dá)于U937細(xì)胞上。
圖4顯示人嗜中性粒細(xì)胞中WT-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員的能力。
圖5A+B顯示CHIPS31-121和CHIPS31-121的所示突變體對抗C5aR單克隆抗體結(jié)合C5aR的抑制，其中C5aR表達(dá)于U937細(xì)胞上。
表1顯示所有涉及結(jié)合野生型CHIPS(WT-CHIPS)的C5aR的氨基酸，其通過測試所有C5aR突變體和C5aR嵌合體的WT-CHIPS結(jié)合而獲得，如圖1和2中所描述的。
表2顯示所有涉及或可能涉及CHIPS31-121與C5aR結(jié)合的CHIPS31-121的氨基酸，其通過在15N-1H-HSQC NMR試驗(yàn)中用SO4-C5AR pep7-28滴定15N-標(biāo)記的CHIPS31-121而獲得。
表3顯示不同CHIPS31-121突變體的IC50值，其中單個(gè)的氨基酸取代為丙氨酸(除非另有說明)。用圖6A+B所示試驗(yàn)完成IC50的測定。
表4列出了由炎癥反應(yīng)引發(fā)的疾病和疾病狀況，其涉及補(bǔ)體活化和/或嗜中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞。對本發(fā)明多肽治療這些疾病的治療有效性的支持可在以下參考文獻(xiàn)中所發(fā)現(xiàn)
對于ARDSDemling RH(1995).The modern version of adult respiratorydistress syndrome.Ann.Rev.Med.46193-202；和Fujishima S，Aikawa N(1995)Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation.Intensive Care Med21277-285；
對于嚴(yán)重感染(腦膜炎)Tunkel AR和Scheld WM(1993).Pathogenesisand pathophysiology of bacterial meningitis.Clin.Microbiol.Rev.6118.對于缺血/再灌注后損傷Helier T，等(1999).Selection of a C5a receptor antagonistfrom phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complexdisease and ischemia/reperfusion injury.J.Immunol.163985-994。
對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Edwards SW和Hallett MB 25(1997).Seeing thewood for the treesthe forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis.Immunology Today 18320-324；和Pillinger MH，Abramson SB(1995).Theneutrophil in rheumatoid arthritis.Rheum.Dis.Clin.North Am.199521691-714。
對于心肌梗塞Byrne JG，Smith WJ，Murphy MP，Couper GS，AppleyardRF，Cohn LH(1992).Complete prevention of myocardial stunning，contracture，low-reflow，and edema after heart transplantation by blocking neutrophiladhesion molecules during reperfusion.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.1041589-96。
對于CORDCox G(1998).The role of neutrophils in inflammation.Can.Respir.J.5 Suppl A37A-40A；and Hiemstra S PS，van Wetering S，Stolk J(1998).Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructivepulmonary diseaseeffects on pulmonary epithelium.Eur.Respir.J.121200-1208。
對于中風(fēng)Barone FC，F(xiàn)euerstein GZ(1999).Inflammatory mediators andstrokenew opportunities for novel therapeutics.J.Cereb.Blood Flow Metab.19819-834；和Jean WC，Spellman SR.Nussbaum ES，Low WC(1998).Reperfusion injury after focal cerebral ischemiathe role of inflammation and thetherapeutic horizon.Neurosurgery 431382-1396。
對于腦膜炎luomanen EI(1996).Molecular and cellular mechanisms ofpneumococcal meningitis.Ann.N.Y.Acad.Sci.7974252。
對于所有補(bǔ)體直接相關(guān)疾病改編自A.Sahu和J.D.LambrisImmunophannacology 49(2000)133-148。
實(shí)施例
實(shí)施例1
C5aR中CHIPS結(jié)合位點(diǎn)的鑒定
材料與方法
1.1完整C5aR和C5aR N-端的克隆
用引物PCR擴(kuò)增編碼人全長C5aR的DNA序列，所述引物的序列經(jīng)修飾，在C5aR開放閱讀框(ORF)的第一個(gè)蛋氨酸(起始密碼子)的下游引入了N末端FLAG表位標(biāo)簽(DYKDDDDK)，以及允許在表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆帶FLAG標(biāo)簽的C5aR序列的限制性位點(diǎn)(EcoRI和XbaI)。所述片段以合適的方向插入，使得可以由CMV啟動(dòng)子表達(dá)帶FLAG標(biāo)簽的C5aR。通過序列分析確認(rèn)克隆的FLAG-標(biāo)記的C5aR序列。FLAG-標(biāo)簽使得可以用單克隆抗體(mAb)M2(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)檢測C5aR。
用引物通過PCR克隆編碼人C5aR的前38個(gè)氨基酸(相當(dāng)于C5aR N末端)的DNA序列，所述引物序列被修飾以引入限制性位點(diǎn)(AccI和BglII)，從而可以在表達(dá)質(zhì)粒pDISPLAY(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆C5aR N末端序列。所述片段以合適的方向插入，使得可以由CMV啟動(dòng)子表達(dá)C5aR N末端。存在于C5aR N末端序列上游的鼠Igκ鏈V-J2-C信號肽序列使C5aR N末端蛋白得以被定向引導(dǎo)至真核細(xì)胞的分泌途徑。存在于C5aR N-端序列下游的PDGF受體的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)5aR N-端蛋白錨定于真核細(xì)胞的質(zhì)膜以進(jìn)行展示。存在于C5aR N末端序列上游和信號肽下游的血凝素A表位標(biāo)簽使得可以用mAb 12CA5(Roche，Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)檢測pDISPLAY C5aR N-末端蛋白。通過序列分析確認(rèn)克隆的C5aR N末端序列。
1.2 CHIPS制備
用Thermal Ace DNA聚合酶(Invitrogen，Paisley，UK)PCR擴(kuò)增編碼WT-CHIPS(CHIPS 1-121)的金黃色葡萄球菌的染色體DNA，所用引物為
CHIPS 1-121的5’TTTACTTTTGAACCGTTTCCTAC與
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點(diǎn))的組合。用金黃色葡萄球菌Newman的染色體DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述模板是用高純度PCR模板制備試劑盒(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)分離的。提供N-端組氨酸標(biāo)簽的pRSET表達(dá)載體(Invitrogen)用BamHI消化并用S1核酸酶(Roche Diagnostics；100U/ml，30min 37℃)處理，以準(zhǔn)確地在編碼腸激酶裂解位點(diǎn)的DNA序列之后提供平端載體。
隨后，用EcoRI消化載體，并與EcoRI-消化的PCR產(chǎn)物連接。在TOP10F’大腸桿菌(E.Coli)中增殖質(zhì)粒。為了表達(dá)，轉(zhuǎn)化了BL21(DE3)E.Coli，1個(gè)克隆在含有50μg/ml羧芐青霉素(Sigma)的2ml LB中生長一整天，隨后過夜(1∶1000)。第二天早上，沉淀細(xì)胞并重懸于含50μg/ml羧芐青霉素的新鮮LB中，獲得0.1的OD660。培養(yǎng)物生長至OD660為0.8，用1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)2.5小時(shí)。然后，沉淀細(xì)胞并重懸于含500mM NaCl，pH7.8的20mM磷酸鈉緩沖液中，-20℃保存直至使用。
為分離CHIPS1-121或CHIPS31-121，用100μg/ml卵清溶菌酶(Sigma)在冰上處理細(xì)胞15分鐘。為進(jìn)一步裂解細(xì)胞，超聲處理細(xì)菌，在液氮中冷凍并在37℃水浴中解凍，總共四個(gè)循環(huán)。
之后，在冰上加入RNase和DNase(5μg/ml)，作用30分鐘。隨后，將溶解產(chǎn)物于3000g 4℃下離心30分鐘，以0.45μm過濾器過濾，用冰冷的pH7.8磷酸鹽緩沖液1∶1稀釋，并以0.2ml/min的流速通過帶電荷的鎳柱(Invitrogen)。分別用pH7.8、pH6.0、和pH5.3的磷酸鹽緩沖液沖洗柱子。用PBS/50mMEDTA洗脫柱子。室溫下用腸激酶(1U/ml蛋白)裂解4小時(shí)以去除組氨酸標(biāo)簽。
1.3用FITC標(biāo)記純化的CHIPS蛋白
室溫下將純化的CHIPS(500μg/ml蛋白)和1/10體積的1mg/ml FITC(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)luorescein Isothiocyanate，異構(gòu)體I；Sigma)一起在pH9.6的1M碳酸鈉緩沖液中溫育1小時(shí)。使混合物通過脫鹽柱(Pharmacia，F(xiàn)ast DesaltingHR 10/10)，將FITC-標(biāo)記的CHIPS與游離的FITC分離，由在線偶聯(lián)熒光儀(on-line coupled fluorometer)(Perkin Elmer)監(jiān)測洗出液的OD280和熒光。合并具有高OD280和熒光的級分，用Micro BCA蛋白測定(Pierce)分析蛋白含量。將CHIPS-FITC在-20℃以小等份保存。
1.4 C5aR與C5aR N-端的表達(dá)
在HEK293細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染包含C5aR的ORF的pcDNA3.1質(zhì)粒來表達(dá)完整C5aR。因此，根據(jù)生產(chǎn)商的說明(Invitrogen)，在6孔平板中用lipofectamine2000(5μl)以1μgDNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，所述HEK293細(xì)胞保持在含有0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、10μg/ml慶大霉素和10％FCS的MEM(Gibco Invitrogen Corporation)中。
轉(zhuǎn)染2至3天后，用PBS/胰蛋白酶收集細(xì)胞，用RPMI/0.05％人血清白蛋白(HSA；CLB，Amsterdam，The Neterlands)洗滌，與10μg/ml抗-FLAG M2mAb和3μg/ml FITC-標(biāo)記的CHIPS一起培養(yǎng)，隨后與2μ/ml APC標(biāo)記的羊抗小鼠Igs(PharMingen，San Diego，CA，USA)一起培養(yǎng)。在添加碘化丙啶(propidium jodide)后，洗滌細(xì)胞并在流式細(xì)胞儀上檢測CHIPS-FITC與表達(dá)C5aR N-端蛋白(APC-陽性)且為碘化丙啶陰性(活的)細(xì)胞的結(jié)合。
為了表達(dá)C5aR N-端，如上述在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染包含C5aR N-端序列的pDISPLAY質(zhì)粒，不同的是當(dāng)檢測CHIPS-FITC的結(jié)合時(shí)，所述細(xì)胞與5μg/ml抗-HA標(biāo)簽12CA5mAb而不是抗-FLAG M2 mAb一起培養(yǎng)。
1.5 C5aR-或C5aRN-末端-突變體和C5aR嵌合體的克隆與表達(dá)
通過重疊延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在C5aR和/或C5aR N末端上進(jìn)行定點(diǎn)誘變。誘變在C5aR N末端從氨基酸脯氨酸9(命名為P9)直到天冬氨酸21(命名為D21)的所有氨基酸上進(jìn)行。表1描述了C5aRN末端的全部氨基酸序列。所有的氨基酸都突變?yōu)楸彼?A；命名為P9A、D10A等)，作為單突變或突變組合。只有酪氨酸(Y)11和14變?yōu)楸奖彼?F；命名為Y11F等.)而不是丙氨酸。其他的突變體是缺失N末端8、13、或18位氨基酸，命名為del-8、del-13、del-18。還通過重疊延伸PCR構(gòu)建了下述的C5aR嵌合體
*N-C3aR+C5aRC5aR的N-末端(對應(yīng)于C5aR的氨基酸1-37)替換為C3aR的N-末端(對應(yīng)于C3aR的氨基酸1-23)。
*N-C5aR+C3aRC3aR的N-末端(對應(yīng)于C3aR的氨基酸1-23)替換為C5aR的N-末端(對應(yīng)于C5aR的氨基酸1-37)。
*C5aR-lp1(IL8R)C5aR胞外環(huán)1(對應(yīng)于C5aR的氨基酸90-117)替換為IL8R的胞外環(huán)1(對應(yīng)于IL8R的氨基酸93-118)。
*C5aR-lp2(IL8R)C5aR胞外環(huán)2(對應(yīng)于C5aR的氨基酸172-211)替換為IL8R的胞外環(huán)2(對應(yīng)于IL8R的氨基酸172-211)。
*C5aR-lp3(C3aR)C5aR胞外環(huán)3(對應(yīng)于C5aR的氨基酸265-280)替換為C3aR的胞外環(huán)3(對應(yīng)于C3aR的氨基酸400-415)。
在上述所有的C5aR嵌合體中，除N-C3aR+C5aR外，還構(gòu)建了額外的D10A突變。如1.1所述將突變的完整C5aR和C5aR嵌合體的PCR片段克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中。如1.1中所述將突變的C5aR N-末端的PCR片段克隆到pDISPLAY質(zhì)粒中。
結(jié)果
圖1顯示CHIPS-FITC與C5aR N末端的結(jié)合，C5aR N末端包含不同的點(diǎn)突變和缺失，用pDISPLAY載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。由此可見，通過位置15和18的突變和1-13位以及更多氨基酸的刪除使結(jié)合幾乎完全消除。
圖2A顯示CHIPS-FITC與完整C5aR的結(jié)合，在C5aR的N末端包含不同的點(diǎn)突變和刪除，其用pcDNA3.1載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。由此可見第10、15和18位3個(gè)天冬氨酸的突變最顯著地減少了CHIPS-FITC與完整C5aR的結(jié)合。
圖2B顯示CHIPS-FITC與完整C5aR和C5aR嵌合體的結(jié)合，其中N末端和胞外環(huán)替換為其他G蛋白偶聯(lián)受體的相應(yīng)區(qū)域。在大部分嵌合體中也構(gòu)建了額外的D10A突變。所有的受體都用pcDNA3.1載體表達(dá)于HEK-293細(xì)胞上。圖2B顯示沒有一個(gè)C5aR的胞外環(huán)涉及與CHIPS的結(jié)合。因而，CHIPS只結(jié)合C5aRN-末端。
表1顯示所有涉及結(jié)合WT-CHIPS的C5aR的氨基酸，其通過測試所有C5aR突變體和C5aR嵌合體的WT-CHIPS結(jié)合而獲得，如圖1和2中所描述。發(fā)現(xiàn)位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸涉及此結(jié)合。未發(fā)現(xiàn)氨基酸38-350與結(jié)合有關(guān)。
實(shí)施例2
磺化的C5aR N-末端肽7-28對CHIPS-FITC結(jié)合C5aR的影響
材料與方法
SO4-C5aR pep7-28對CHIPS-FITC結(jié)合C5aR的影響
4℃下，將CHIPS-FITC(0至1μg/ml)與200μM的SO4-C5aR pep7-28一起預(yù)培養(yǎng)30分鐘。然后，加入表達(dá)野生型C5aR的U937細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞/ml)，4℃下再培養(yǎng)30分鐘。隨后，在流式細(xì)胞儀上分析CHIPS-FITC與U937細(xì)胞的結(jié)合。
結(jié)果
圖3顯示SO4-C5aR pep 7-28對CHIPS-FITC結(jié)合野生型C5aR的抑制，該野生型C5aR表達(dá)于U937細(xì)胞上。由這些結(jié)果可以推斷只有一部分合成為硫酸化肽(該肽中存在的兩個(gè)酪氨酸都是硫酸化的，天然C5aR中同樣如此)的C5aRN-末端(氨基酸7至28)能結(jié)合CHIPS，并防止其結(jié)合表達(dá)于U937細(xì)胞上的C5aR。
實(shí)施例3
WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121的C5a抑制活性的比較
材料與方法
3.1 CHIPS31-121的表達(dá)與純化
如1.2節(jié)CHIPS的制備中所述克隆、表達(dá)和純化CHIPS31-121，使用引物
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點(diǎn))。
3.2嗜中性粒細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員
為了測定WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121對C5a誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的影響，室溫并持續(xù)攪拌的情況下，向嗜中性粒細(xì)胞加載RPMI/0.05％HAS中的2μM的Fluo-3AM，用緩沖液洗滌兩次，在RPMI/0.05％HAS中懸浮至1×106個(gè)細(xì)胞/ml。隨后，室溫下，在有或沒有30nM WT-CHIPS或CHIPS31-121的情況下預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘。每個(gè)細(xì)胞樣品首先測定約10秒鐘以確定基礎(chǔ)熒光水平。接下來，加入濃縮的C5a(所用C5a的濃度范圍10-12M至10-7M)，并迅速放回樣品容器中繼續(xù)測定。在FACScan或Calibur流式細(xì)胞儀上以前向散射和側(cè)向散射設(shè)門分析細(xì)胞，以排除死亡細(xì)胞和碎片。
結(jié)果
圖4顯示W(wǎng)T-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a誘導(dǎo)的人嗜中性粒細(xì)胞中鈣動(dòng)員的能力。由此可見，CHIPS31-121在抑制C5a-誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員方面與WT-CHIPS同樣有效或者更加有效。因此，對于C5a-抑制能力而言，WT-CHIPS的前30個(gè)氨基酸并不重要。
實(shí)施例4
涉及CHIPS與C5aR結(jié)合的CHIPS31-121的氨基酸
材料與方法
4.1 15N-和13C/15N-均一標(biāo)記的CHIPS31-121的制備
如1.2節(jié)CHIPS制備中所述克隆并表達(dá)15N-標(biāo)記的和13C/15N-標(biāo)記的CHIPS31-121(CHIPS，缺少前30個(gè)氨基酸)，使用引物
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下劃線的序列代表EcoRI位點(diǎn))。
對于CHIPS31-121的15N-標(biāo)記，用pRSET/CHIPS31-121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌不培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，而是培養(yǎng)在M9基本培養(yǎng)基中，每升該基本培養(yǎng)基包含6g Na2HPO4、3g KH2PO4、0.5g NaCl、1g 15NH4Cl、2ml 1M MgSO4、10μl CaCl2、1ml 0.01M FeSO4、10ml 20％葡萄糖、1ml1000×維生素溶液(每升1000×維生素溶液包含0.4g氯化膽堿、0.5g葉酸、0.5g泛酸、0.5g煙酰胺、1.0g肌醇、0.5g鹽酸吡哆醛、0.5g鹽酸硫胺素、0.05g核黃素、和1g生物素)，和1ml的1000X微量營養(yǎng)素(每升1000X微量營養(yǎng)素包含3×10-6 M鉬酸銨，4×10-4M H3BO3，3×10-5M CoCl2，1×10-5MCuSO4，8×10-5M MnCl2，和1×10-5M ZnSO4)。
對于CHIPS31-121的13C/15N-標(biāo)記，每升M9基本培養(yǎng)基使用1g 15NH4Cl和2g 13C-葡萄糖。將純化的CHIPS31-121樣品在含有20mM磷酸鈉緩沖液pH5.0/0.01％NaN3的93％1H2O/7％2H2O(v/v)中溶解至1-2mM的濃度。
4.2 NMR波譜
4.2.1概述
所有的NMR數(shù)據(jù)均在Varian Unity INOVA 500(UIPS)或INOVA600(GBB)NMR波譜儀上于298K獲得。用NMRPipe包(Delaglio等，1995)處理NMR數(shù)據(jù)，并用Sparky NNR歸屬與積分軟件(T.D.Goddard and D.G.Kneller，SPARKY 3，University of California，San Francisco)分析。
4.2.2波譜歸屬
用標(biāo)準(zhǔn)三重共振試驗(yàn)(參見Cavanagh等，1996)對骨架1H，15N，13Cα/β和1Hα/β核進(jìn)行歸屬。用先前13Cα/β和1Hα/β核的歸屬作為起點(diǎn)，通過HC(C)H-TOCSY(Kay等，1993)試驗(yàn)的解析完成脂肪族側(cè)鏈的歸屬。用2D試驗(yàn)歸屬芳香族側(cè)鏈，其將13Cβ和1Hβ共振與芳香族部分的質(zhì)子相關(guān)聯(lián)(Yamazaki等，1993)，再加上13C載體置于芳香族區(qū)域的的3DHC(C)H-TOCSY，以連接芳香族自旋系統(tǒng)。用15.5ms DIPSI-3混合序列(Shaka等，1988)完成HC(C)H-TOCSY試驗(yàn)中的相干混合。
4.2.3 NMR滴定試驗(yàn)
進(jìn)行滴定試驗(yàn)，其中監(jiān)測CHIPS31-1211H和15N的化學(xué)位移，作為遞增的SO4-C5AR pep7-28量的函數(shù)。獲得了樣品的1H-15N HSQC系列試驗(yàn)，其中[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]的比率在0∶1和1∶1之間變動(dòng)。這是通過向400ml的0.45mM CHIPS31-121溶液加入9ml的4mM SO4-C5ARpep7-28(這提供了1∶5的初始[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]比率)以及隨后加入9ml的等份而實(shí)現(xiàn)的。
結(jié)果
表2顯示了所有涉及或可能涉及CHIPS31-121與C5aR結(jié)合的CHIPS31-121的氨基酸，其由15N-1H-HSQC NMR試驗(yàn)中通過用SO4-C5ARpep7-2815滴定N-標(biāo)記的CHIPS31-121而獲得。證實(shí)了殘基R46，K50，K51，K54，E60，K100，K101，G102，K105，Y108，V109和Y121與結(jié)合有關(guān)。
實(shí)施例5
涉及CHIPS與C5aR結(jié)合的CHIPS31-121的氨基酸的分子生物學(xué)確認(rèn)
材料與方法
5.1 CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體在周質(zhì)滲漏(periplasmic leaky)表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)
為了在周質(zhì)滲漏表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體，將CHIPS31-121克隆到pET-22b(+)-載體(Novagen)中。這樣，如1.2節(jié)CHIPS制備中所述，PCR擴(kuò)增CHIPS31-121，使用引物
5’CGATGGCCAATAGTGGTCTTCCTACAACG和
3’CTACTAGCTGAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG。
通過重疊延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在CHIPS31-121上使用定點(diǎn)誘變構(gòu)建所有的CHIPS31-121突變體。用MscI和EcoRI消化純化的PCR產(chǎn)物，隨后連接到MscI-和EcoRI-消化的pET-22b(+)-載體中。在TOP10F’大腸桿菌中增殖質(zhì)粒。
用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)E.Coli用于表達(dá)。30℃下用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)過夜，完成CHIPS31-121和CHIPS31-121突變體的表達(dá)。加入HSA(0.1％)以抵消蛋白的損耗。隨后，收集上清并加入PMSF以避免針對所表達(dá)的蛋白的蛋白酶活性。
用捕獲ELISA(capture ELISA)測定細(xì)菌上清中表達(dá)的CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體的濃度，其中多克隆兔抗-CHIPS抗體包被到ELISA平板上。
結(jié)合后，用生物素化的多克隆兔抗-CHIPS抗體，隨后用鏈霉親合素-過氧化物酶結(jié)合檢測CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體。
5.2 CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體與抗-C5aR mAb競爭結(jié)合表達(dá)C5aR的U937細(xì)胞
表達(dá)C5aR的U937細(xì)胞與遞增濃度的CHIPS31-121或CHIPS31-121突變體(存在于細(xì)菌上清中)一起在含有0.05％人血清白蛋白(RPMI/0.05％HSA)的RPMI中于冰上培養(yǎng)15分鐘。然后，將所述樣品與10μg/ml FITC-標(biāo)記的抗-C5aR S5/1mAb(抗-CD88(Serotec，Oxford，UK))一起在冰上培養(yǎng)30分鐘。洗滌后，在FACscan流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)上分析細(xì)胞。
結(jié)果
圖5A+B顯示CHIPS31-121和所示的CHIPS31-121突變體對抗C5aR單克隆抗體結(jié)合C5aR的抑制，其中C5aR表達(dá)于U937細(xì)胞上。圖5A中的粗線顯示CHIPS31-121和在結(jié)合C5aR中影響最大的CHIPS31-121突變體(為E60，K100，Y108，V109和Y121)。圖5B中的粗線顯示在CHIPS31-121和結(jié)合C5aR中影響最大的CHIPS31-121突變體(為R46，N47，K50，K51，K54，K101，G102，K105和Y121刪除的)。所有突變體均為單一氨基酸取代為丙氨酸(除非另作說明)。
表3顯示不同的CHIPS31-121突變體的IC50值，其中的單個(gè)氨基酸取代為丙氨酸(除非另作說明)。用圖5A+B所示試驗(yàn)完成IC50的測定。
表1
涉及或可能涉及CHIPS與C5aR結(jié)合的C5aR的氨基酸，通過C5aR-N末端和完整C5aR+/-突變體的表達(dá)獲得

氨基酸38-350
ILALVIFAVVFLVGVLGNALVVWVTAFEAKRTINAIWFLNLAVADFLSCLALPILFTSIVQHHHWPFGGAACSILPSLILLNMYASILLLATISADRFLLVFKPIWCQNFRGAGLAWIACAVAWGLALLLTIPSFLYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIVRLVLGFLWPLLTLTICYTFILLRTWSRRATRSTKTLKVVVAVVASFFIFWLPYQVTGIMMSFLEPSSPTFLLLNKLDSLCVSFAYINCCINPIIYVVAGQGFQGRLRKSLPSLLRNVLTEESVVRESKSFTRSTVDTMAQKTQAV
不涉及CHIPS的結(jié)合
表2涉及或可能涉及CHIPS與C5aR結(jié)合的CHIPS的氨基酸，在15N-1H-HSQC NMR試驗(yàn)中通過用C5aR-pep7-2B滴定15N-標(biāo)記的CHIPS-delta-30而獲得





表3
CHIPS31-121突變體(取代為丙氨酸，除非另作說明)的IC50值，其在抑制抗-C5aR mAb與表達(dá)C5aR的U937細(xì)胞結(jié)合中測得。
表4
涉及補(bǔ)體激活和/或涉及嗜中性粒細(xì)胞和或單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)引發(fā)的疾病。
·急性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎 30 ·中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病
·急性移植排斥 ·子宮內(nèi)膜異位癥
·成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS) ·實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)
·酒精性肝炎 ·實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性神經(jīng)炎(EAN)
·異基因移植 ·凍傷
·阿爾茨海默氏病 35 ·胃癌
·動(dòng)脈硬化 ·胃腸疾病
·阿蒂斯反應(yīng)(Arthus reaction) ·泌尿生殖性疾病
·哮喘 ·痛風(fēng)
·動(dòng)脈粥樣硬化 ·幽門螺桿菌(Heliobacter pylon)
·特應(yīng)性皮炎 40 胃炎
·細(xì)菌性腦膜炎 ·血液透析
·支氣管癌 ·遺傳性血管水腫
·大皰性類天皰瘡 ·高敏性肺炎
·燒傷 ·原發(fā)性肺纖維化
·心肺轉(zhuǎn)流術(shù) 45 ·免疫復(fù)合物(IC)-誘導(dǎo)的血管炎
·心血管疾病 ·缺血性(ischaemic)休克
·慢性支氣管炎 ·缺血-再灌注事件(episodes)
·慢性淋巴自血病 ·缺血-再灌注損傷
·慢性阻塞性肺病(COPD) ·關(guān)節(jié)病
·接觸性皮炎 50 ·(大)血管手術(shù)
·Crohn氏病 ·金屬煙霧熱
·皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤 ·多發(fā)性硬化
·囊性纖維化病 ·多發(fā)性系統(tǒng)器官衰竭
·皮膚病 ·重癥肌無力
·心肌梗塞
·胰腺炎
·腹膜炎
·胸膜肺氣腫(pleural emphesema)
·心肺轉(zhuǎn)流術(shù)后(CBP)炎癥
·牛皮癬
·重復(fù)性勞損(RSI)(repetitve strain injury)
·呼吸系統(tǒng)疾病
·類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
·敗血癥
·敗血性休克
·鼻竇炎
·皮膚疾病
·中風(fēng)
·系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)
·移植
·(外傷性)腦損傷
·潰瘍性結(jié)腸炎
·尿道感染
·血管滲漏綜合征
·脈管炎
·異種移植
權(quán)利要求
1.化合物，其能夠防止人C5aR N-端殘基10至18與其胞外環(huán)的分子內(nèi)接觸。
2.如權(quán)利要求
1所述的化合物，其特征在于其能夠結(jié)合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸。
3.如權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中該化合物具有通式
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm (I)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X39、X7、和X11各自分別是39、7或11個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
4.如權(quán)利要求
3中所述的化合物，其中通式I中的Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-90個(gè)，更優(yōu)選-75個(gè)，最優(yōu)選1-59個(gè)殘基。
5.如權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述化合物具有通式
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm(II)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X，X2，X3，X5和X39各自分別是1、2、3、5、11和39個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸，非成蛋白質(zhì)性氨基酸，D-氨基酸，肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
6.如權(quán)利要求
5中所述的化合物，其中式II中的Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-50個(gè)，更優(yōu)選1-25個(gè)，最優(yōu)選1-15個(gè)。
7.如權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述化合物具有通式
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm (III)，
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7和X11各自分別是1、2、3、4、5、6、7或11個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
8.如權(quán)利要求
1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中該化合物具有通式
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm(IV)，
其中，
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；
T是蘇氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
R是精氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
I是異亮氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
K是賴氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
V是纈氨酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物；
X，X2，X3和X5各自分別是1、2、3或5個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸、非成蛋白質(zhì)性氨基酸、D-氨基酸、肽模擬物構(gòu)建單元或其組合的序列段；并且具有與天然CHIPS相同的三維構(gòu)象。
9.如權(quán)利要求
7或8所述的化合物，其中式III和IV中的Xn和Xm可以各自包含0-100個(gè)，優(yōu)選1-50個(gè)，更優(yōu)選1-25個(gè)，最優(yōu)選1-6個(gè)。
10.如權(quán)利要求
1-9中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述化合物選自CHIPSΔ1、CHIPSΔ17、CHIPSΔ30，其分別缺失天然CHIPS的N末端結(jié)構(gòu)域的1、17和30個(gè)氨基酸。
11.如權(quán)利要求
1-10任一項(xiàng)中的化合物，其中所述非成蛋白質(zhì)性類似物選自下組2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-環(huán)己基丙氨酸(Cha)、對-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、對-苯甲?；奖彼?Bpa)、鳥氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))，4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))，4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))，4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
12.如權(quán)利要求
1-11任一項(xiàng)中所述的化合物，其中所述非成蛋白質(zhì)性類似物為選自下列的D氨基酸D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-組氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-賴氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸、D-蘇氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-環(huán)己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NH2))、對-苯甲酰基-D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鳥氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br)、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-Tyr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
13.如權(quán)利要求
1-12任一項(xiàng)中所述的化合物，其中所述非成蛋白質(zhì)性類似物為選自下列的肽模擬物構(gòu)建單元寡聚-β-肽、寡聚磺酰胺、插烯磺酰胺、肼基肽/azatides、寡聚氨基甲酸酯、脲擬肽、oligourea、磷酸二酯、擬肽、寡砜、擬肽磺酰胺、插烯肽。
14.如權(quán)利要求
13中所述的化合物，其中的肽模擬物構(gòu)建單元選自N-取代的甘氨酸，如N-芐基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲?；一?甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羥乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羥丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(對-羥基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
15.如權(quán)利要求
1-14中任一項(xiàng)所述的化合物，其為環(huán)狀的。
16.如權(quán)利要求
1和2所述的化合物，該化合物為抗C5aR或C5aR相關(guān)化合物的抗體或其衍生物，C5aR相關(guān)化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20個(gè)的序列段。
17.用于預(yù)防或治療的如權(quán)利要求
1-16中任一項(xiàng)所述的化合物。
18.用于預(yù)防或治療適應(yīng)癥的如權(quán)利要求
1-16中任一項(xiàng)所述的化合物，所述適應(yīng)癥涉及嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的C5a受體(C5aR)。
19.如權(quán)利要求
18所述的化合物，其中所述適應(yīng)癥涉及急性或慢性炎癥反應(yīng)。
20.如權(quán)利要求
19所述的化合物，其中所述適應(yīng)癥選自表4所列出的組。
21.用于預(yù)防或治療適應(yīng)癥的如權(quán)利要求
1-16中任一項(xiàng)所述的化合物，所述適應(yīng)癥涉及除嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞上的C5aR。
22.如權(quán)利要求
21所述的化合物，其中其他細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，Kupfer細(xì)胞，肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
23.用于預(yù)防性或治療性疫苗中的如權(quán)利要求
1-16任一項(xiàng)中所述的化合物，所述疫苗用于產(chǎn)CHIPS細(xì)菌所引起的感染。
24.如權(quán)利要求
23中所述的化合物，其中產(chǎn)CHIPS細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。
25.如權(quán)利要求
1-16中所述的化合物在制備用于預(yù)防或治療用的治療制劑中的用途。
26.如權(quán)利要求
25中所述的用途，其中治療制劑用于預(yù)防和治療涉及嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥。
27.如權(quán)利要求
25所述的用途，其中所述適應(yīng)癥涉及急性或慢性炎癥反應(yīng)。
28.如權(quán)利要求
27所述的用途，其中所述適應(yīng)癥選自表4所列出的組。
29.如權(quán)利要求
25所述的用途，其中治療組合物用于預(yù)防或治療涉及除嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥。
30.如權(quán)利要求
29所述的用途，其中其他細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，Kupfer細(xì)胞，肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求
25中所述的用途，其中所述治療制劑為預(yù)防性或治療性疫苗，所述疫苗用于針對產(chǎn)CHIPS細(xì)菌所引起的感染的預(yù)防或治療。
32.如權(quán)利要求
31中所述的用途，其中產(chǎn)CHIPS細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。
33.治療組合物，包含合適的賦形劑和一種或多種如權(quán)利要求
1-16中所述的化合物。
34.預(yù)防組合物，其包含合適的賦形劑和一種或多種如權(quán)利要求
1-16中所述的化合物。
35.如權(quán)利要求
1-16中任一項(xiàng)中所述的化合物在制備用于醫(yī)用裝置表面上的涂覆組合物中的用途，所述醫(yī)用裝置通過皮膚介入人體或在手術(shù)過程中置于體內(nèi)。
36.如權(quán)利要求
35中所述的用途，其中所述表面為導(dǎo)管尖端的表面。
37.如權(quán)利要求
35和36中所述的用途，其中所述組合物為緩釋組合物。
38.治療性或預(yù)防性組合物，其包含合適的賦形劑和一種或多種如權(quán)利要求
1-16任一項(xiàng)中所述的化合物。
39.預(yù)防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥，該方法包括施用預(yù)防或治療有效量的如權(quán)利要求
1-16任一項(xiàng)中所述的一種或多種化合物。
40.如權(quán)利要求
39中所述的方法，其中所述適應(yīng)癥涉及急性或慢性炎癥反應(yīng)。
41.如權(quán)利要求
39中所述的方法，其中所述適應(yīng)癥選自表4所列出的組。
42.預(yù)防或治療受試者的方法，所述受試者患有涉及除嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞上的C5aR的適應(yīng)癥，所述方法包括給予預(yù)防或治療有效量的如權(quán)利要求
1-16任一項(xiàng)中所述的一種或多種化合物。
43.如權(quán)利要求
42中所述的方法，其中所述其他細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、Kupfer細(xì)胞、肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
44.對受試者施行抗產(chǎn)CHIPS細(xì)菌感染的預(yù)防性或治療性處理的方法，所述方法包括施用預(yù)防或治療有效量的如權(quán)利要求
1-16任一項(xiàng)中所述的一種或多種化合物。
45.鑒定可與C5aR結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括
a)提供候選化合物文庫，
b)將文庫成員與C5aR相關(guān)化合物接觸，該C5aR相關(guān)化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分別是0-9、1、2和0-20個(gè)成蛋白質(zhì)性氨基酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以與天然產(chǎn)生的C5aR中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象相同或相似的構(gòu)象存在，和
c)鑒定文庫中結(jié)合所述C5aR相關(guān)化合物的成員。
46.如權(quán)利要求
45所述的方法，其還包括提供如此鑒定的成員用于預(yù)防或治療的步驟。
47.按照權(quán)利要求
45所述方法鑒定的化合物。
48.如權(quán)利要求
47所述的化合物在制備治療和預(yù)防與C5aR有關(guān)的適應(yīng)癥的藥物組合物中的用途。
專利摘要
本發(fā)明涉及能夠防止人C5aR N－端殘基10至18與其胞外環(huán)分子內(nèi)接觸的化合物。更特別地，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸以及位置12的甘氨酸的化合物。這樣的化合物優(yōu)選具有通式Xn－E－X39－K－X7－Y－V－X11－Y－Xm，其中Xn、X39、X7、X11和Xm為氨基酸和其他字母代表相應(yīng)的氨基酸或其非成蛋白質(zhì)性類似物的序列段。本發(fā)明還涉及其在預(yù)防和治療中的用途。
文檔編號G01N33/566GK1997664SQ200580019673
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月15日
發(fā)明者約翰尼斯·A·G·范斯特里普, 卡拉·J·C·德哈斯, 約翰·凱明克, 科克·P·M·范凱塞爾 申請人:鱷魚生物科學(xué)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan