專利名稱:一種富集空氣微生物的方法與專用裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于富集空氣微生物的裝置，以及用該裝置富集空氣微生物的方法。
背景技術(shù)：
隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對空氣質(zhì)量的要求也越來越高?？諝馕廴荆貏e是空氣中病原微生物對人類健康帶來的危害正日益受到重視。人類的許多重要傳染病都可通過空氣傳播，有研究表明醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的患病率為3％～20％，而其中由空氣微生物引起的呼吸道感染就約占15％～20％。如2003年在我國及周邊地區(qū)暴發(fā)流行的SARS病毒，該病毒主要就是以氣溶膠的形式在空氣中擴(kuò)散而傳播的，這是一種典型的呼吸道——空氣——呼吸道傳播疾??；另一個例子就是最近發(fā)生的H5N1禽流感疾病，該病毒除可通過動物的分泌物而進(jìn)入水、土壤中外，也可以氣溶膠的形式而傳播。由于空氣中微生物的這種高危害性，因此使得對各種環(huán)境條件下空氣微生物的及時、簡便、準(zhǔn)確的監(jiān)測就有著重要的意義！對空氣微生物的高效、全面的采集是空氣微生物準(zhǔn)確檢測的前提。目前對空氣微生物的采集，主要有兩種方式一種是基于平板暴露式的靜態(tài)沉降采集法，另一種是基于空氣采集器的動態(tài)采集法。但這兩種采集方法都具有一定的局限性。靜態(tài)沉降法容易受到人為因數(shù)、環(huán)境濕度、溫度、密閉性及場地多樣性等外部條件限制而變數(shù)較大，結(jié)果既不全面也不穩(wěn)定；而動態(tài)采集法，無論是離心式還是撞擊式，雖然可以部分克服靜態(tài)沉降采集法的缺陷，但也帶來兩個新的問題，一是氣流的撞擊易造成微生物的死亡，造成結(jié)果的假陰性；二是易受微生物大小與空氣動力學(xué)相互作用的影響，造成在一定的空氣動力學(xué)范圍內(nèi)，只能實(shí)現(xiàn)對一定范圍大小的微生物粒子進(jìn)行收集。
而且更重要的是，這兩種采集方法還有一個共同的致命缺陷，即方法是建立在傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)鑒定基礎(chǔ)上的。也就是說空氣微生物必須收集在有培養(yǎng)基的平皿上，通過培養(yǎng)增菌后，對菌落進(jìn)行計數(shù)或再進(jìn)行后續(xù)的分離培養(yǎng)結(jié)合形態(tài)特性、生化鑒定等方法檢測。
我們知道空氣微生物具有多樣性的特征，其中既有細(xì)菌，也可能存有一些真菌孢子以及病毒等等，而顯然普通的營養(yǎng)培養(yǎng)基是不可能實(shí)現(xiàn)對真菌和病毒等的收集的。即使是細(xì)菌也有許多是難培養(yǎng)的以及需要特殊條件培養(yǎng)的，如結(jié)核分支桿菌。而且這種分離培養(yǎng)鑒定方法還存在著操作復(fù)雜、特異性不強(qiáng)、所需時間長等缺點(diǎn)，再加上許多細(xì)菌生化特征、抗生素敏感型等表型特征不穩(wěn)定，易受到基因調(diào)控、質(zhì)粒獲失及技術(shù)操作等方面的影響，因此易造成假陰性結(jié)果而導(dǎo)致漏診或誤診。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是一種富集空氣微生物的裝置及方法。
本發(fā)明所提供的富集空氣微生物的裝置，包括殼體，所述殼體一端開口，另一端封閉，封閉端帶有多孔網(wǎng)格；過濾收集組件，所述過濾收集組件可拆卸地連接于所述殼體的開口端；風(fēng)機(jī)組件，所述風(fēng)機(jī)組件包括頁輪和與頁輪連接的電動機(jī)，設(shè)于所述殼體內(nèi)部；所述頁輪的葉片端對著所述過濾收集組件。
在本發(fā)明中，過濾收集組件包括膜前收集網(wǎng)槽、濾膜和膜后網(wǎng)式襯墊；所述膜前收集網(wǎng)槽與膜后網(wǎng)式襯墊相互連接，所述濾膜固定于兩者之間；所述過濾收集組件通過膜后網(wǎng)式襯墊連接于所述殼體上。為了提高過濾收集組件之間的密封性，過濾收集組件還包括密封圈，所述密封圈設(shè)于膜前收集網(wǎng)槽和膜后網(wǎng)式襯墊之間。為了便于過濾收集組件的攜帶、滅菌、保存，所述過濾收集組件還配有前密封蓋和后密封蓋。在本發(fā)明中，常用濾膜選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜和聚偏二氟乙烯膜，濾膜孔徑為0.1-10微米；優(yōu)選的，所述濾膜為醋酸纖維素膜，孔徑為0.22微米。
本發(fā)明中各種部件的連接方式有多種，通?？梢圆捎寐菁y連接。
為了能夠精確控制空氣微生物的收集量，富集空氣微生物的裝置還設(shè)有用于控制電動機(jī)的控制組件；所述控制組件嵌設(shè)于所述殼體的表面。
以及，為了方便本發(fā)明裝置的使用和調(diào)節(jié)，富集空氣微生物的裝置還配有支撐架。所述支撐架包括高度可調(diào)試三腳架、方向可調(diào)試支撐架。
應(yīng)用本發(fā)明裝置進(jìn)行空氣微生物富集的方法，包括如下步驟1)清洗、消毒過濾收集組件，開動電動機(jī)，在過濾收集組件上收集空氣微生物；2)將過濾收集組件放入緩沖液中，清洗、離心，收集沉淀，富集得到空氣微生物。
本發(fā)明采用直接吸入濾過式原理，在一定時間內(nèi)對一定體積空氣中全部微生物進(jìn)行過濾富集，然后對富集的微生物進(jìn)行核酸的提取、純化處理，繼而再結(jié)合相應(yīng)的分子微生物學(xué)檢測方法進(jìn)行檢測鑒定。
本發(fā)明采用了非培養(yǎng)基原理的富集方式，可克服由于營養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式差異而造成的空氣微生物收集的局限性，從而可實(shí)現(xiàn)對全部空氣微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒等在內(nèi)的一次性同步收集；本發(fā)明由于對接了非增菌培養(yǎng)的鑒定方式，其一可以充分利用現(xiàn)代分子微生物學(xué)檢測高通量化、自動化、快速化的檢測特性，從而克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定法存在的操作復(fù)雜、特異性不強(qiáng)、所需時間長等缺點(diǎn)；其二可以通過對空氣微生物的實(shí)時收集，實(shí)現(xiàn)對空氣微生物的定量分析，避免由于增菌培養(yǎng)而造成的量化誤差。而且這種主動式的直接吸入濾過收集方法，不僅可以克服靜態(tài)沉降收集法中由于沉降系數(shù)不足或環(huán)境影響因素而造成收集不完整，而且也克服了離心式或撞擊式空氣采集器中由于離心力范圍的局限性而造成只能對相應(yīng)體積、重量大小微生物粒子收集的不足，從而盡可能的控制了由于環(huán)境因素、設(shè)備因素、人為因素以及微生物體積、重量大小等物理因素對收集的影響。
圖1為本發(fā)明富集空氣微生物的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明裝置的過濾收集組件的立體分解示意圖；圖3A、圖3B分別為膜前收集網(wǎng)槽的剖視圖和立體圖；圖4A、圖4B分別為前密封蓋的剖視圖和立體圖；圖5A、圖5B分別為后密封蓋的剖視圖和立體圖；圖6A、圖6B分別為膜后網(wǎng)式襯墊的剖視圖和立體圖；圖7為不包括過濾收集組件的本發(fā)明富集空氣微生物的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖8為包括過濾收集組件的本發(fā)明富集空氣微生物的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式如圖1、圖7和圖8所示，本發(fā)明富集空氣微生物的裝置包括殼體1，殼體1的一端開口，另一端封閉，封閉端帶有多孔網(wǎng)格；過濾收集組件2，用于收集空氣微生物，過濾收集組件2可拆卸地連接于殼體1的開口端；風(fēng)機(jī)組件3，風(fēng)機(jī)組件3包括頁輪32和與頁輪連接的電動機(jī)31，設(shè)于殼體1內(nèi)部，頁輪32的葉片端321對著過濾收集組件2。電動機(jī)31帶動頁輪32轉(zhuǎn)動，葉片321的轉(zhuǎn)動在殼體1內(nèi)部形成真空負(fù)壓，使外部空氣向過濾收集組件2流動，從而在過濾收集組件2上收集到空氣中的微生物。
本發(fā)明富集空氣微生物的裝置還可以設(shè)置有控制組件4及支撐架5。控制組件4主要用于控制調(diào)節(jié)電動機(jī)31的工作模式，包括延時啟動控制、收集時間、空氣體積調(diào)節(jié)等調(diào)控模式，各種常用的單片機(jī)即可以達(dá)到要求，為了便于操作，可在殼體1上設(shè)置液晶屏41和操作面板42。支撐架5用于固定調(diào)節(jié)殼體1的高度以及方向等，包括高度可調(diào)試三腳架、方向可調(diào)試支撐架等。
如圖2所示，過濾收集組件2包括膜前收集網(wǎng)槽21、濾膜23和膜后網(wǎng)式襯墊22；膜前收集網(wǎng)槽21與膜后網(wǎng)式襯墊22相互連接，濾膜23固定于兩者之間，用于收集空氣微生物，濾膜可為尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、醋酸纖維素膜等，濾膜孔徑為0.1-10微米；優(yōu)選的，濾膜為醋酸纖維素膜，濾膜孔徑為0.22微米。為了提高膜前收集網(wǎng)槽21與膜后網(wǎng)式襯墊22連接的密封性，還在兩者之間設(shè)置密封圈24。整個過濾收集組件2通過膜后網(wǎng)式襯墊22連接到殼體1的開口端。
在日常應(yīng)用中，過濾收集組件2一般與殼體1分離，單獨(dú)放置，在需要用來收集微生物時，再將過濾收集組件2與殼體1連接，組裝成為本發(fā)明的富集空氣微生物的裝置。如圖3A、3B，圖4A和4B所示，膜前收集網(wǎng)槽21還配有前密封蓋26；如圖5A、5B，圖6A和6B所示，膜后網(wǎng)式襯墊22也配有后密封蓋25，這樣，整個過濾收集組件2能夠形成良好的密封性，可以防止濾膜23以及膜前收集網(wǎng)槽21與膜后網(wǎng)式襯墊22被灰塵及微生物所污染，保持過濾收集組件2的潔凈度。為了便于拆卸以及密封，前密封蓋27與膜前收集網(wǎng)槽21，膜前收集網(wǎng)槽21與膜后網(wǎng)式襯墊22，膜后網(wǎng)式襯墊22與后密封蓋25，以及膜后網(wǎng)式襯墊22與殼體1的連接方式均采用螺紋連接；當(dāng)然，其他的連接方式也是可行的，如快卡式連接或法蘭式連接等。
應(yīng)用上述富集空氣微生物的裝置對空氣微生物的收集方法，包括如下步驟1)取出濾過收集組件中的濾膜前收集網(wǎng)槽，將濾膜放到濾膜后網(wǎng)式襯墊上，再蓋上濾膜前收集網(wǎng)槽，與前后密封蓋一起高壓消毒處理。
2)停止消毒后，無菌條件下用前后密封蓋蓋住濾過收集組件，備用。
3)在收集場所，用酒精對收集裝置主機(jī)中與濾過收集組件的結(jié)合處消毒處理，打開后密封蓋，接上濾過收集組件。
4)根據(jù)需要設(shè)置延時啟動設(shè)置，并對收集的空氣體積、收集速度參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。
5)收集。
6)收集完畢后，先蓋上前密封蓋，連同取下濾過收集組件，封上后密封蓋。以備核酸的提取。
7)無菌條件下取下濾過收集組件后密封蓋，將前密封蓋打開，連同濾過收集組件放入緩沖液中，清洗，離心。收集沉淀，收集得到空氣微生物。
對收集得到的空氣微生物可以進(jìn)一步進(jìn)行分析處理，例如，可以進(jìn)行核酸提取沉淀中加入裂解液，采用酚-氯仿抽提法或玻璃珠法進(jìn)行核酸的提取、純化。
本文提及的核酸，主要是指DNA或RNA。在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)不同檢測方法的需要，或不同微生物的特征，對微生物的DNA或RNA分別提取或?qū)崿F(xiàn)同步提取。
對微生物核酸的提取，現(xiàn)在已有許多商品化的核酸提取試劑供應(yīng)，如Invitrogen公司的TRIzol Reagent(總RNA提取)及DNAzol Reagent(總DNA提取)；美國MRC公司的Genomic DNA Purification Kit(基因組DNA提取)；Toyobo公司的MagExtractor-Genome(基因組DNA磁珠分離試劑)及MagExtractor-RNA(總RNA磁珠分離試劑)等等。甚至還可運(yùn)用自動化的核酸提取儀器進(jìn)行核酸的提取，如美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司6100型核酸提取儀以及生物梅里埃公司的NucliSENSeasyMAG全自動核酸提取儀等等。這些商品化的提取試劑盒和自動提取儀器均帶有提取所需的配套試劑，并附有標(biāo)準(zhǔn)的方法步驟和程序。操作者只要嚴(yán)格按照方法步驟執(zhí)行，均可以順利實(shí)施收集微生物的核酸提取。
不同公司的提取產(chǎn)品，雖然在試劑組成和方法上有一定的差異，但其本質(zhì)一般都是基于傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法或玻璃珠分離法而進(jìn)行的。因此，本文分別以傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法及玻璃珠法為例來說明微生物核酸的提取步驟和過程，方法主要參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》((美)F.奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f，王海林譯。北京科學(xué)出版社，1998年第一版)。
(一)酚-氯仿抽提法制備微生物基因組DNA(1)細(xì)菌沉淀中加入5-10倍體積的裂解液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH8.0，使用前加入10μg/mL蛋白酶K)；混勻；(2)55～60℃水浴10～20分鐘；離心12000g×10分鐘；取上清；(3)加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混勻，再加入80μL CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7mol/L NaCl)混勻，65℃溫育10分鐘；(4)加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)混勻；離心12000g×10分鐘；吸取上層水相；(5)再加入等體積的酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)；混勻；離心12000g×10分鐘；(6)吸取上層水相，加入0.6體積異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀；離心，棄上清；加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，充分混勻，-20℃放置30分鐘；離心4℃，12000g×10分鐘；(7)輕輕倒去上清液，倒置于濾紙上，盡量沾干多余液體；在真空干燥器內(nèi)干燥沉淀物；(8)用小體積TE緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解沉淀物，備檢測用。
(二)玻璃珠法提取微生物基因組DNA(1)細(xì)菌沉淀中加入5-10倍體積的裂解液(同上)；混勻；55～60℃水浴10～20分鐘；離心5000g×10分鐘；取上清；(2)加入等體積的18mol/L的NaI(2.25g Na2SO3溶于40mL H2O中，加入135gNaI攪拌溶解)，加入1/2體積的玻璃珠懸液(200-300μl的200μm玻璃珠與等體積水混合，使用前短暫渦旋振蕩)，室溫下5分鐘；稍加離心；棄上清；(3)1mL洗滌液(20mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，加入等體積100％乙醇)將DNA/玻璃珠沉淀洗3次，輕輕渦旋振蕩混勻后，稍加離心沉淀玻璃珠；(4)TE緩沖液(同上)重懸沉淀，使終濃度為0.5μg/μL。于45℃溫育2-3分鐘，以將DNA從玻璃珠上洗脫下來。
(5)離心1分鐘，收集上清，備用。
(三)酚-氯仿抽提法制備微生物RNA實(shí)驗(yàn)所用的溶液均用EDPC水處理配置；實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿均在300℃干烤4小時；塑料制品用EDPC水浸泡處理后高壓滅菌，以避免RNA酶污染。
(1)細(xì)菌沉淀中加入5-10倍體積的裂解液(同上，DFPC水配置)；混勻；55～60℃水浴10～20分鐘；離心12000g×10分鐘；取上清；(2)加入等體積的酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)抽提；高速離心5分鐘，取上層水相；(3)用酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)再抽提一次；用氯仿異戊醇(24∶1)抽提；取上層水相；(4)加入15μL 5mol/L NaCl，并2倍體積加預(yù)冷無水乙醇充分混勻，-20℃放置30分鐘；離心4℃，12000g×10分鐘；(5)沉淀用預(yù)冷70％乙醇沖洗，晾干。用95μL DNA酶消化緩沖液溶解沉淀，加入4μL 2.5mg/mL無RNA酶的DNA酶I，37℃水浴1小時；(6)用酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)再抽提一次；移出水相；有機(jī)相中加入100μLTE緩沖液混勻，離心4℃，12000g×10分鐘；合并兩次水相；(7)加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)抽提；加入10μL 5mol/L NaCl，600μL預(yù)冷無水乙醇充分混勻，-20℃放置30分鐘；離心4℃，12000g×10分鐘；(8)沉淀用預(yù)冷70％乙醇沖洗，晾干。用DEPC水溶解，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 對收集到的核酸可進(jìn)行相應(yīng)的檢測分析，目前相關(guān)的分子生物學(xué)檢測方有很多，常用的包括核酸雜交、限制性片段多態(tài)性分析、PCR、LCR及熒光定量PCR等。本文分別以較為常用的PCR、RT-PCR以及芯片檢測為例說明。
(一)PGR檢測方法包括如下步驟(1)針對檢測目標(biāo)，設(shè)計特異檢測片段及相對應(yīng)的特異引物，并合成引物；引物長度一般設(shè)計為15-30bp，常用為20bp左右。檢測片段即引物擴(kuò)增長度一般為200-500bp。
(2)冰上按下列組份配置PCR反應(yīng)液以TAKARA生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶試劑盒為例(DRR01AM)。
10×擴(kuò)增緩沖液 10μL4種dNTP混合物 各200μmol/L引物 各10～100pmol模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5UMg21.5mmol/L加雙或三蒸水至 100μL(3)反應(yīng)管放入PCR儀中。并基于PCR原理設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)及相應(yīng)反應(yīng)程序。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性(一般優(yōu)選設(shè)置為94℃，1分鐘)，再迅速冷卻至40～60℃(一般優(yōu)選設(shè)置為引物Tm值-5℃，30-60秒)，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃(一般優(yōu)選設(shè)置為72℃，反應(yīng)時間設(shè)置根據(jù)150核苷酸/秒/酶分子，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min足夠)，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。反應(yīng)循環(huán)一般設(shè)置為28-35個。
(4)瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物檢測。
(二)RT-PCR檢測。RT-PCR一般分為兩步法和一步法，分別如下RT-PCR兩步法(1)冰上按下列組份配置RT反應(yīng)液以TAKARA生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)為例(DRR019A)。
10×RT緩沖液 1μLdNTP混合物(各2.5mmol/L) 2μLRNase Inhibitor(40U/μL) 0.25μLRandom 9mers(50pmol/μL)或Oligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μL)或特異性下游引物 0.5μL微生物RNA樣品 ≤1μg total RNART反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL) 0.5μLMg2(25mmol/L) 2μl加RNase Free dH2O至 10μL(2)在PCR儀中，設(shè)置下列條件反應(yīng)42℃反應(yīng)15-30分鐘，99℃反應(yīng)5分鐘，然后5℃反應(yīng)5分鐘。若是使用Random 9mers為引物，則必須在42℃反應(yīng)前先設(shè)置30℃反應(yīng)10分鐘。
(3)再以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟同上述的PCR檢測方法。
RT-PCR一步法(1)冰上按下列組份配置RT-PCR反應(yīng)液以TAKARA生物有限公司的One StepRNA PCR Kit(AMV)為例(DRR024A)10×One Step RT-PCR緩沖液 5μLdNTP混合物(各2.5mmol/L) 5μLRNase Inhibitor(40U/μL) 1μL上游特異引物(20μmol/L) 1μL下游特異引物(20μmol/L) 1μL微生物RNA樣品 ≤1μg total RNAAMV-Optimized Taq(5U/μL) 1μLAMV-RTase XL(5U/μL) 1μLMg2(25mmol/L) 10μl加RNase Free dH2O至 50μL(2)在PCR儀中，設(shè)置下列條件反應(yīng)50℃反應(yīng)30分鐘，94℃反應(yīng)2分鐘，然后按設(shè)置PCR條件反應(yīng)(設(shè)置方法同上述的PCR檢測方法)。
(3)瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物檢測。
(三)芯片檢測方法包括如下步驟
(1)針對檢測目標(biāo)，設(shè)計并合成檢測探針；固定探針、構(gòu)建芯片(也可以購買商品化的芯片使用)；(2)根據(jù)芯片的檢測要求，對待檢測微生物核酸特異標(biāo)記(如熒光、同位素、酶及納米金等標(biāo)記)；(3)對芯片進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、漂洗等反應(yīng)處理；(4)對反應(yīng)芯片進(jìn)行結(jié)果檢測分析。
實(shí)施例1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶θ巳焊吡鲃訄鏊h(huán)境空氣中SARS病毒的存在情況進(jìn)行監(jiān)測實(shí)驗(yàn)樣本來源深圳市火車站候車室內(nèi)、深圳市福田長途汽車站候車室內(nèi)空氣樣本實(shí)驗(yàn)步驟(一)收集前準(zhǔn)備(1)打開收集裝置中濾過收集組件中的濾膜前收集網(wǎng)槽，將濾膜放到濾膜后網(wǎng)式襯墊上，蓋上濾膜前收集網(wǎng)槽，與前后密封蓋一起高壓消毒處理。
(2)停止消毒后，無菌條件下用前后密封蓋蓋住濾過收集組件。
(二)樣本的收集分別在上午10點(diǎn)及下午3點(diǎn)，各在深圳市火車站候車室內(nèi)及深圳市福田長途汽車站候車室內(nèi)收集兩次空氣樣本，并連續(xù)收集三天。共有12個樣本。
(1)在收集場所，用酒精對收集裝置主機(jī)中與濾過收集組件的結(jié)合處消毒處理，打開后密封蓋，接上濾過收集組件。
(2)設(shè)置延時3分鐘啟動，收集參數(shù)設(shè)置為空氣濾過速度為200升/分鐘，收集時間為30分鐘；收集。
(5)收集完畢后，先蓋上前密封蓋，連同取下濾過收集組件，封上前密封蓋。以備核酸的提取。
(三)樣本的RNA提取使用深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司的病毒RNA提取試劑盒，且所有用品及液體均經(jīng)無RNA酶處理。
(1)無菌條件下取下濾過收集組件后密封蓋，將前密封蓋打開，連同濾過收集組件放入緩沖液中，渦旋振蕩清洗；無菌水漂洗兩次；收集全部清洗液，12000g離心10分鐘；收集沉淀；(2)沉淀中加入500μL裂解液，吸頭反復(fù)吹打混勻，再加入100μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5秒(不宜過于強(qiáng)烈)；12000g，離心15分鐘；
(3)吸取上層液相，加入250μL異丙醇，顛倒混勻；12000g，離心15分鐘。棄上清，濾紙上沾干多余液體，加入1mL 75％乙醇，顛倒洗滌；12000g，離心10分鐘。輕輕倒去上清，倒置于濾紙上，盡量沾干多余液體；(4)12000g，離心10秒，將管底少量液體用微量加樣器吸干，在真空干燥器內(nèi)短時間干燥沉淀物，DEPC水溶解RNA備用。
(四)RT-PCR檢測反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法參考王艷等《反轉(zhuǎn)錄巢式PCR方法檢測SARS冠狀病毒》見《第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報》23卷第5期421-423頁。實(shí)驗(yàn)試劑為TAKARA生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)(DRR019A)及Ex Taq DNA聚合酶試劑盒(DRR01AM)。采用GAPDH為檢測內(nèi)參對照(1)根據(jù)Genebank DQ640652 SARS全基因序列設(shè)計引物，由上海英駿生物公司合成。上游引物5′-GAAGCTATTCGTCACGTTCG-3′；下游引物5′-CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG-3′；擴(kuò)增片段長度為109bp。檢測內(nèi)參對照GAPDH的上游引物為5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物為5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′；擴(kuò)增片段長度為216bp。
(2)冰上按下列組份配置RT反應(yīng)液10×RT Buffer 1μL，dNTP Mixture 1μL，RNase Inhibitor 0.25μL，SARS病毒或內(nèi)參GAPDH下游引物0.5μL，AMV ReverseTranscriptase 0.5μL，MgCl22μL，RNase Free dH2O 3.75μL，分別各加制備的RNA樣品1μL；42℃反應(yīng)30分鐘，99℃反應(yīng)5分鐘，5℃反應(yīng)5分鐘，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈；(3)冰上按下列組份配置PCR反應(yīng)液10×EX Taq Buffer 5μL，SARS病毒或內(nèi)參GAPDH上游引物0.5μL，MgCl24μL，dH2O 28.75μL，分別各加上述制備的第一鏈模板DNA 10μL。SARS病毒的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循環(huán)30次；最后再置72℃延伸5分鐘。內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次；最后再置72℃延伸5分鐘。
(4)分別對12個樣品的SARS病毒和內(nèi)參GAPDH的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示各樣品均有清晰GAPDH產(chǎn)物條帶，而SARS病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。
實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶︶t(yī)院環(huán)境空氣中結(jié)核分支桿菌的存在情況進(jìn)行監(jiān)測實(shí)驗(yàn)樣本來源深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院門診大廳內(nèi)空氣樣本實(shí)驗(yàn)步驟
(一)收集前準(zhǔn)備同上實(shí)施例1。
(二)樣本的收集分別在上午10點(diǎn)及下午3點(diǎn)，在深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院門診大廳內(nèi)不同位置各收集兩次空氣樣本，并連續(xù)收集三天。共有12個樣本。其余步驟同實(shí)施例1。
(三)樣本的DNA提取(1)無菌條件下取下濾過收集組件后密封蓋，將前密封蓋打開，連同濾過收集組件放入緩沖液中，渦旋振蕩清洗；無菌水漂洗兩次；收集全部清洗液，12000g離心10分鐘；收集沉淀；(2)細(xì)菌沉淀中加入5-10倍體積的裂解液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH8.0，使用前加入10μg/mL蛋白酶K)；混勻；(3)56℃孵育30分鐘后加飽和酚100μL，充分混合直到形成乳濁液，4℃ 12000g離心10分鐘，小心吸取上層水相；(4)加入等體積的酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)混合液，充分搖勻，4℃ 12000g離心10分鐘，小心抽提上層液；(5)再加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)；抽提液中加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.2)，約2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，充分混勻，-20℃放置30分鐘；4℃ 12000g離心10分鐘；(6)輕輕倒去上清液，沉淀加入100μL預(yù)冷的無水乙醇，4℃ 12000g離心10分鐘；(7)再在沉淀中再加70％預(yù)冷的乙醇，搖勻后4℃12000g離心10分鐘，輕輕倒去上清液，將管倒置在吸水紙上，盡量沾干多余液體，真空干燥儀內(nèi)短時間干燥沉淀；(8)加TE緩沖液100μL作PCR擴(kuò)增用。
(四)PCR檢測反應(yīng)試劑采用伊利康生物公司的結(jié)核桿菌核酸擴(kuò)增檢測試劑盒。
(1)引物根據(jù)Genebank AE000516結(jié)核分支桿菌基因組序列設(shè)計的，上游引物序列為5′-GTCCTCGCGAGTCTAGGCCA-3′，下游引物序列為5′-TCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′；檢測片段長度大約為240bp。
(2)檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行試劑盒中取出已分裝好有PCR反應(yīng)混合液的離心管，加20μL反應(yīng)液，離心數(shù)秒，再加入4μL待檢DNA樣品或試劑盒帶確有的陽性模板，混勻后稍加離心。如下表
(3)將上述待擴(kuò)增樣品和陰陽性對照置PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)置擴(kuò)增條件為93℃預(yù)變性3分鐘；然后93℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，循環(huán)35次；最后再置72℃延伸5分鐘。
(4)瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物檢測，結(jié)果顯示陽性對照有清晰的條帶出現(xiàn)，而陰性對照和檢測樣品均無條帶顯示。
權(quán)利要求
1.一種富集空氣微生物的裝置，其特征在于，所述富集空氣微生物的裝置包括殼體，所述殼體一端開口，另一端封閉，封閉端帶有多孔網(wǎng)格；過濾收集組件，所述過濾收集組件可拆卸地連接于所述殼體的開口端；風(fēng)機(jī)組件，所述風(fēng)機(jī)組件包括頁輪和與頁輪連接的電動機(jī)，設(shè)于所述殼體內(nèi)部；所述頁輪的葉片端對著所述過濾收集組件。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述過濾收集組件包括膜前收集網(wǎng)槽、濾膜和膜后網(wǎng)式襯墊；所述膜前收集網(wǎng)槽與所述膜后網(wǎng)式襯墊相互連接，所述濾膜固定于兩者之間；所述過濾收集組件通過膜后網(wǎng)式襯墊連接于所述殼體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述膜前收集網(wǎng)槽與膜后網(wǎng)式襯墊的連接方式為螺紋連接；所述膜后網(wǎng)式襯墊與所述殼體的連接方式為螺紋連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述濾膜選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜和聚偏二氟乙烯膜，濾膜孔徑為0.1-10微米；優(yōu)選的，所述濾膜為醋酸纖維素膜，孔徑為0.22微米。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述過濾收集組件還包括密封圈，所述密封圈設(shè)于膜前收集網(wǎng)槽和膜后網(wǎng)式襯墊之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述過濾收集組件還配有前密封蓋和后密封蓋。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述富集空氣微生物的裝置還設(shè)有用于控制電動機(jī)的控制組件；所述控制組件嵌設(shè)于所述殼體的表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述富集空氣微生物的裝置還配有支撐架。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的富集空氣微生物的裝置，其特征在于所述支撐架包括高度可調(diào)試三腳架、方向可調(diào)試支撐架。
10.一種富集空氣微生物的方法，是在權(quán)利要求
1所述富集空氣微生物的裝置中進(jìn)行的，包括如下步驟1)清洗、消毒過濾收集組件，開動電動機(jī)，在過濾收集組件上收集空氣微生物；2)將過濾收集組件放入緩沖液中，清洗、離心，收集沉淀，富集得到空氣微生物。
專利摘要
本發(fā)明公開了富集空氣微生物的裝置及方法。本發(fā)明所提供的富集空氣微生物的裝置，包括殼體，所述殼體一端開口，另一端封閉，封閉端帶有多孔網(wǎng)格；過濾收集組件，所述過濾收集組件可拆卸地連接于所述殼體的開口端；風(fēng)機(jī)組件，所述風(fēng)機(jī)組件包括頁輪和與頁輪連接的電動機(jī)，設(shè)于所述殼體內(nèi)部；所述頁輪的葉片端對著所述過濾收集組件。本發(fā)明采用直接吸入濾過式原理，在一定時間內(nèi)對一定體積空氣中全部微生物進(jìn)行過濾富集，然后對富集的微生物進(jìn)行核酸的提取、純化處理，繼而再結(jié)合相應(yīng)的分子微生物學(xué)檢測方法進(jìn)行檢測鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK1995320SQ200610169705
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發(fā)明者顧大勇, 李長春, 呂志平, 徐云慶, 吉雁鴻, 張雅鷗, 楊景濤, 周元國, 魯衛(wèi)平, 禹華偉, 梁冰 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan