專利名稱:超氧化歧化酶(sod)的提純方法
本發(fā)明是一種超氧化歧化酶(SOD)的提純方法。
本發(fā)明屬于酶學(xué)，在IPC分類中為C12N9/02。
本發(fā)明與日本專利昭和58-179487相似。將動物肝臟置于0.5M NaCl，10-3M氯化亞銅，PH5.6制成勻漿，溫度70℃的條件下加熱30分鐘，經(jīng)離心棄去沉淀。將上清液用冰凍干燥濃縮，然后在蒸餾水中透析。在經(jīng)透析的SOD溶液中加入10-3～5×10-3M的亞銅鹽，加熱，分離去除雜蛋白，再經(jīng)DEAE和Sephadex兩次層析分離，從而制得純SOD。
本發(fā)明的目的是向醫(yī)藥工業(yè)提供生產(chǎn)成本低廉，操作簡便，又適合于大規(guī)模制備和純化SOD的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容
本發(fā)明實施例1.稱取1000克新鮮豬肝加入含0.15M NaCl和5mM CuCl2溶液(A液)，A液體積是豬肝重的2.5倍制成肝勻漿。然而用0.2M Tris緩沖液調(diào)PH至5.6，于70℃水浴中加熱勻漿至65℃，保持15分鐘。然后，在水中冷卻，經(jīng)過濾或離心得上清液。用600ml蒸餾水洗沉淀，合并上清液。
2.用2M NaOH將上清液調(diào)PH至6.7。加入固體(NH4)2SO4使其為50%(NH4)2SO4飽和度，離心去除沉淀雜蛋白;再加入NH4SO4，使上清液達(dá)到75%飽和度，再次沉淀將沉淀溶于350毫升蒸餾水中，裝入透析袋，在1.4mM CuCl2溶液透析24小時。
3.將透析過的溶液離心去除沉淀。上清液用Tris緩沖液調(diào)PH至5.6。于70℃水浴中保溫10分鐘，再在冷水中冷卻后離心，得上清液。
4.在低溫-10℃條件下，將相當(dāng)于上清液1.5倍容積的丙酮徐徐加入上清液，經(jīng)離心得到沉淀。
5.將沉淀于5×10-3M，PH7.8磷酸緩沖液中進(jìn)行透析。經(jīng)透析過的溶液經(jīng)DEAD-32纖維素層析柱分離SOD。收集的SOD溶液用上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生產(chǎn)的CAX-10超濾膜超濾，用蒸餾水洗脫SOD，并用蒸餾水中透析除去殘留的磷酸鹽。最后用5號細(xì)菌漏斗過濾，得到SOD溶液經(jīng)冰凍干燥，獲得為354.3毫克的SOD粉劑，比活力為2780單位/毫克。
本發(fā)明的優(yōu)點1.本發(fā)明采用低濃度的氯化鈉與肝臟一起勻漿，再直接用硫酸銨鹽析法除去雜蛋白。這樣，克服了在已有技術(shù)中，由于用0.5M NaCl的勻漿無法用硫酸銨鹽析去除雜蛋白，而只能采用反復(fù)透析的辦法。但因透析液的體積過大，因而要先用真空干燥的辦法來縮小透析液體積，有不適用于大規(guī)模制取的缺點。
2.本發(fā)明采用Cu++溶液進(jìn)行透析，有保護(hù)SOD活性和沉淀雜蛋白的作用，它克服了已有技術(shù)中用蒸餾水透析，透析后的SOD溶液再溶于含Cu+的溶液中，使SOD在H2O中透析過程中易失活的缺點。
3.本發(fā)明的提純方法是使SOD在DEAE柱上洗脫峰的出現(xiàn)比已有技術(shù)提前20小時，而且是單一的峰，克服了已有技術(shù)中DEAE柱上洗脫峰與其他雜蛋白峰有交叉現(xiàn)象並要多次層析，不易得到較純凈SOD的缺點。
4.本發(fā)明從1000克豬肝中獲得354.3毫克SOD，它的比活力為2780單位/毫克。它比已有技術(shù)SOD的得率和比活力都高。而已有技術(shù)是125克豬肝得到42.7毫克SOD，其比活力為2277單位/毫克。
本發(fā)明的效果本發(fā)明是一種催化超氧化陰離子的酶，它具有清除機(jī)體炎癥的作用。在醫(yī)藥界已在臨床試用，它對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，化療和放射性治療后產(chǎn)生的炎癥有顯著療效;對自身免疫性疾病，例如全身性紅斑狼瘡也有效。在美國、西德、澳大利亞雖有商品出售，但由于分離提取的方法不適宜大規(guī)模生產(chǎn)，成本高，操作困難。本發(fā)明提供了一套簡便的提純方法，成本低，容易操作和掌握，適宜大規(guī)模生產(chǎn)SOD。
權(quán)利要求
1.一種超氧化歧化酶(SOD)的提純方法，它以動物肝臟為原料，用氯化銅二次處理提取SOD，經(jīng)離心沉淀、透析、分離去除雜蛋白，獲得純SOD，本發(fā)明的特征在于a)肝臟用0.005～0.25MNaCl和1.0～8mM二價銅鹽勻漿，硫酸銨鹽析。b)采用1.0～2.5mM二價銅離子溶液作為SOD粗制液的透析液。c)經(jīng)透析后的SOD粗制液直接加熱去除殘留雜蛋白。
2.根據(jù)權(quán)項1所述的一種超氧化歧化酶(SOD)的提純方法其特征在于a)0.01M NaCl和5mM二價銅鹽為肝臟勻漿時采用的最佳鹽濃度。b)1.4mM二價銅離子溶液為SOD粗制液進(jìn)行透析的最佳濃度。
專利摘要
本發(fā)明是一種超氧化歧化酶(SOD)的提純方法，將動物肝臟勻漿在二價銅鹽的條件下分步加熱和透析沉淀除去雜質(zhì)，提取SOD；采用硫酸銨分步鹽析，除去雜蛋白，收集含SOD的蛋白質(zhì)，再經(jīng)透析、濃縮、干燥，可獲得比活力為2780單位/毫克的SOD。
文檔編號C12N9/02GK86100551SQ86100551
公開日1987年11月25日 申請日期1986年4月2日
發(fā)明者周殿松 申請人:交通部石油部海洋水下工程科學(xué)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan