專利名稱:專門測定胰α-淀粉酶的方法和試劑的制作方法
本發(fā)明涉及一種在有唾液α-淀粉酶存在時，專門測定胰α-淀粉酶的方法和試劑。
α-淀粉酶(E.C3.2.1.1)在打開1，4-α-糖苷連接的寡糖和多糖時，主要是隨機(jī)地水解1，4-α-糖苷鍵，生成麥芽糖和麥芽-寡糖。除了酶在工業(yè)發(fā)酵技術(shù)中的用途以外，酶在臨床分析和診斷領(lǐng)域中也被認(rèn)為是很重要的。因此，在某些疾病中，α-淀粉酶在體液中的含量，例如在血清，尿和十二指腸分泌物中的含量，會有相當(dāng)?shù)母淖?。然而，在體內(nèi)事實(shí)上存在有兩種α-淀粉酶，即胰酶和唾液酶。因?yàn)橹挥幸让冈谠\斷中具有重要性，所以存在著的分析性的任務(wù)是，在有其它不常見并以小量存在的酶存在時，區(qū)分這兩種α-淀粉酶。困難的是，這兩種多重形式具有相似的結(jié)構(gòu)并且在免疫學(xué)上也相同(見K.Lorentz，Laborat or iumsblatter，32，118/1982)。為了消除唾液酶的活性，已知可使用陰離子交換劑吸附，麥蛋白抑制，電泳或電聚焦的方法。但是這些方法，要么是其分離作用不能令人滿意，要么就是對常規(guī)診斷來講太實(shí)驗(yàn)室化了。在以上所述及的方法中，對常規(guī)診斷來講尚可接受的方法是描述于Clin.Chem.28/7，1525-1527/1982，它用從麥胚中獲取的抑制劑抑制唾液型酶，但耗費(fèi)時間，并且選擇性也不能令人滿意。甚至在最佳的抑制劑濃度時，仍保留了13%的唾液型酶活性，而胰酶的活性則被減少到81%。
在已有的，尚未公開的第84114172.4號歐洲專利申請中，已經(jīng)提出了這樣的建議，即在有對唾液α-淀粉酶起反應(yīng)并顯示出對胰α-淀粉酶的交叉反應(yīng)活性為5%或更低的單克隆抗體存在時，在有唾液α-淀粉酶存在的情況下測定胰α-淀粉酶。用這種單克隆抗體，就可以在加入銀沉淀劑的情況下，與唾液α-淀粉酶形成可從溶液中分離出的不溶性復(fù)合物，因此僅使胰酶保留在溶液中并且被測定。此外，用固定化形式的單克隆抗體也能分離唾液淀粉酶。但是，在這兩種情況下，均需形成不溶性相并將其與可溶相分離開來。
因而，本發(fā)明的目的是克服這些缺點(diǎn)，并提供一種方法和試劑，從而可能在體液中，當(dāng)有唾液型的α-淀粉酶存在時，不用進(jìn)行這里所必須的相分離，就能快速，簡便并可靠地測定胰α-淀粉酶。
這樣，根據(jù)本發(fā)明，就提供了在有唾液α-淀粉酶存在的體液中，特別是在血清，血漿，十二指腸液和尿中測定胰α-淀粉酶的方法，即使用存在有單克隆抗體時檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)，其與唾液α-淀粉酶反應(yīng)，其中所用的是專門抑制唾液酶并對胰酶的抑制不會高于50%的單克隆抗體。
本發(fā)明的方法是建立在對抑制唾液酶而并不抑制胰酶的單克隆抗體這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)之上。這一點(diǎn)在以往是沒有料想到的，因?yàn)橐阎僖好负鸵让冈诿庖邔W(xué)上相同(見Gerhard Pfleiderer，Lab.Med.，I，189-193，K.Lorentz，loc.cit.)。M.K.Schwarz在“Immunoassay of Enzymes-an Overview”pp.4-9，1983，中述及，抗唾液α-淀粉酶的抗體對唾液型酶的抑制達(dá)78%并對胰型酶抑制達(dá)75%。因此，以往無法預(yù)見到可以創(chuàng)出這樣的單克隆抗體，即由于選擇性地，高度特異性地抑制從而可能實(shí)際上定量地區(qū)別這兩種酶的單克隆抗體。用優(yōu)選的抗體則獲得了對唾液酶抑制達(dá)95%或更高的結(jié)果。
本發(fā)明的方法中所用的新型單克隆抗體已經(jīng)儲存于NCACC儲存號為(99 D12)84122003和(89 E2)84122004(National Collection of Animal Cell Cultures，Porton Down，Great Britain)。
根據(jù)本發(fā)明，所述的抗體可以這樣獲得，即用天然的或修飾過的唾液α-淀粉酶對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行免疫，用轉(zhuǎn)化劑對所獲的免疫動物進(jìn)行B淋巴細(xì)胞融合，再對所獲的能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交細(xì)胞克隆化并培養(yǎng)，然后再從培養(yǎng)物中將其分離出來。特別適合用來生產(chǎn)唾液α-淀粉酶抗體的動物是大鼠和小鼠。免疫可用天然的或修飾過的人唾液α-淀粉酶。如果用天然的酶，就可以使用商品化的，電泳性為均質(zhì)性的制劑?；瘜W(xué)修飾的唾液α-淀粉酶可用已知的酶修飾方法獲得，例如，詳見聯(lián)邦德國專利申請第2543994號。適宜的修飾劑包括有，例如，蛋白上的色氨酸基被氧化的N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)，(BBA，143，462-472/1967)，被碘乙酸(IAA)羧甲基化，其主要作用于組氨酸，或用四硝基甲烷(TNM)硝化(J.Biol.Chem.238，3307/1963)，以及用重氮化苯磺酸的重氮化(Meth.Enzymel.，25，515-531/1972)。當(dāng)用Balb/c小鼠時，已證明使用被RNM修飾的酶最為適宜，而當(dāng)使用AJ小鼠時，以使用天然的酶最好。
免疫按常規(guī)使用天然的或修飾的酶進(jìn)行，但優(yōu)選的是與佐劑相結(jié)合。作為佐劑，優(yōu)先選用氫氧化鋁，同時伴以百日咳博代氏桿菌(Bordetella Pertusis)。
就免疫而言，當(dāng)對AJ小鼠使用天然唾液α-淀粉酶，或?qū)alb/c小鼠使用TNM-修飾的唾液α-淀粉酶時，則免疫以歷時9個月，其間至少進(jìn)行7次免疫(腹膜內(nèi)注射)為好。
免疫后，被免疫動物的B淋巴細(xì)胞用轉(zhuǎn)化因素按照常規(guī)方法進(jìn)行融合。本發(fā)明范圍內(nèi)可用的轉(zhuǎn)化因素舉例有，骨髓瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)化病毒，例如Epstein-Barr病毒，或在聯(lián)邦得國專利申請第3245665號中所述的轉(zhuǎn)化因素。融合按Koehler和Milstein(Nature，256，495-497/1975)的已知方法進(jìn)行。這樣所形成的雜交細(xì)胞按常規(guī)方式克隆化，例如使用常規(guī)的細(xì)胞分類機(jī)，對所獲的能產(chǎn)生預(yù)期單克隆抗體的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。由于雜交細(xì)胞的生長為類似癌細(xì)胞的生長類型，所以它們能被無限地培養(yǎng)，并取得任意所預(yù)期的產(chǎn)量。用這樣所獲的單克隆抗體，從體液中來的唾液α-淀粉酶可被定量地抑制，所以，剩下的淀粉酶活性均屬胰α淀粉酶。
對本發(fā)明的測定方法而言，可以使用單克隆抗體本身，也可使用它們的顯示出相應(yīng)的免疫學(xué)性質(zhì)的片段(Fc片段)。因而，“單克隆抗體”這一術(shù)語，也可理解為這些片段。不僅完整的抗體，而且它們的片段也可用固定化的形式。
令人驚奇地是，根據(jù)本發(fā)明所用的單克隆抗體，對胰α-淀粉酶的抑制為5%更低，在很多情況下，其抑制率為1%，甚至低于可測量的限度。因而，用其代替以前從麥胚中獲取的已知抑制材料，或是上述專門測定體液中胰α-淀粉酶的在先專利申請中的結(jié)合性單克隆抗體，均為適宜的。
這樣的對α-淀粉酶的測定是根據(jù)已知的這類方法進(jìn)行。由于根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體選擇性地抑制唾液型α-淀粉酶并且因此將其從酶活性測定中去除，所以在有單克隆抗體存在時，對α-淀粉酶的測定所獲的數(shù)值就只是胰酶的活性。
根據(jù)本發(fā)明的方法，以配有檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)為好，該系統(tǒng)含有在分子中具4-7個葡萄糖殘基的麥芽多糖麥芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖變位酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶和NAD。
本發(fā)明范圍內(nèi)另一優(yōu)選的測定α-淀粉酶的系統(tǒng)，含有在分子中有4-7個葡糖殘基的硝基苯基麥芽多糖的α-葡糖苷酶。
再者，優(yōu)選的對α-淀粉酶的測定系統(tǒng)含有被可識別基團(tuán)修飾的淀粉。術(shù)語“修飾的淀粉”包括，例如Pharmacia，Sweden的產(chǎn)品，其在“Phadebas”定名下是商品化的，還有聯(lián)邦德國專利申請第2812154號中所述的產(chǎn)品，以及按淀粉斷裂習(xí)性被修飾的淀粉，例如，羧甲基淀粉和邊界糊精。所有這些系統(tǒng)約為已知的，因此也不用更詳細(xì)地說明。
要進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，樣品液最好用根據(jù)本發(fā)明的抗體培養(yǎng)，然后直接用于常規(guī)的淀粉酶測試中。培養(yǎng)的時間根據(jù)所用抗體的活性而定，并且以15～30分鐘為好。
就對唾液α-淀粉酶的分離達(dá)到理象的程度而言，不僅可用完整形式的單克隆抗體，而且也可用其片段，以及固著于固體載體的形式，例如，固著于免疫吸附紙上或合成樹脂軟管或管子的表面。以這種方式，唾液型α-淀粉酶就聯(lián)到載體上，即聯(lián)于固相上。
也可用這樣的單克隆抗體制劑，即由幾種根據(jù)本發(fā)明的抑制性單克隆抗體混合而成，這些單克隆抗體由幾種不同的克隆所產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種在有唾液α-淀粉酶存在時，于體液中，特別是血清，十二指腸液，血漿或尿漿中專門測定胰α-淀粉酶的試劑，其包括檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)和抗唾液α-淀粉酶的單克隆抗體，其中含有專門抑制唾液酶但對胰酶的抑制不超過50%(交叉反應(yīng)活性≤50%)的單克隆抗體。
考慮到根據(jù)本發(fā)明的試劑中所含的檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)以及其它條件，則以上所述應(yīng)同方法相應(yīng)地結(jié)合起來使用。
本發(fā)明使得在有唾液型α-淀粉酶存在時，于體液中對胰α-淀粉酶進(jìn)行簡便，快速的測定成為可能，并且具有高度特異性，因此改善了臨床診斷的可能性。
以下給出的實(shí)施例用于解釋本發(fā)明A)用100微克人唾液淀粉酶存在于氫氧化鋁中以及百日咳博代氏桿菌(Bordetella Pertussis)對AJ小鼠免疫。以約8周為節(jié)律，對動物再進(jìn)一步免疫叁或四次，每次使用存在于同樣佐劑中的人唾液淀粉酶50微克。融合前節(jié)4天，進(jìn)行最后一次免疫，用存在于生理鹽水中的唾液淀粉酶50微克靜脈注射。
B)用100微克人TNM-修飾的唾液淀粉酶存在于氫氧化鋁中和百日咳博代氏桿菌(Bordelella Pertussis)對Balb/c小鼠免疫。以約8周為節(jié)律，進(jìn)一步免疫三或四次，每次用50微克存在于同樣佐劑中的人TNM唾液淀粉酶。融合前4天，靜脈內(nèi)進(jìn)行最后一次免疫，用50微克存在于生理鹽水中的唾液淀粉酶。
C)腺細(xì)胞與Ag 8.653(ATCC CRL 1580)或SP2/0(ATCC CRL 1581)骨髓瘤細(xì)胞的融合，按在J.of Imm.Meth，39，285-308所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合比率為5∶1。融合產(chǎn)物接種于20-24個培養(yǎng)器(Costar)中，并給每個培養(yǎng)杯中喂以5×104個腹膜滲出細(xì)胞。融合后3-4周，陽性初級培養(yǎng)物(見實(shí)施例3)，在有熒光活化的細(xì)胞分類器的幫助下克隆化。各細(xì)胞以單個放入96-Costar板中，并喂以2×104個腹膜滲出細(xì)胞。作為培養(yǎng)基，使用商品化的RPM I1640培養(yǎng)基并配以10%牛胎兒血清(描述于J.A.M.A，199，519/1957)。
實(shí)施例2用四硝基甲烷(TNM)對α-淀粉酶的修飾5.2毫克人唾液淀粉酶(Sigma)溶于1.6毫升tris緩沖液(90mMtris HCl，1mM氯化鈣，PH8.0)。在攪拌條件下，向其中加入10微升10%(v/v)四硝基甲烷(Roth)于無水乙醇中的溶液?；旌衔镌谑覝貤l件下靜置12小時。對上述緩沖液透析過夜將蛋白質(zhì)從過量的四硝基甲烷中游離出來。在381毫微密處進(jìn)行區(qū)別測定，表明每個α-淀粉酶分子有2.6個硝基。
實(shí)施例3要對免疫小鼠血清中，或雜交細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中或腹水中淀粉酶抑制抗體的濃度和特異性進(jìn)行確定的話，使用了一種淀粉酶抑制試驗(yàn)作為篩選檢測。
為此目的，在96-Elisa板(Nunc)中，放入50微升胰酶和存在于緩沖液(50mMtris，1%牛血清白蛋白，0，1M氯化鈉，PH7.5)的唾液淀粉酶(約400mμ/ml)，并用50微升用于檢測的溶液(例如培養(yǎng)上清液)預(yù)溫育20分鐘。
然后，以50微升淀粉酶底物(4-硝基苯基麥芽庚糖苷，BoehringerMannheim Gm6H，序列號568589)開始酶反應(yīng)。在室溫下約20-60分鐘后，用光度計(jì)于405毫微米處測定差別(Elisa-Reader，Kontron，Switzerland)。
同樣測定了以下的對照1.新鮮培養(yǎng)基(參見實(shí)施例1C);
2.歐洲專利申請第84114172.4的克隆的培養(yǎng)上清液;
3.麥胚抑制子(歐洲專利申請第0079793)，濃度2微克/毫升和0.2微克/毫升。
以下的結(jié)果得自上述試驗(yàn)抑制百分率(%)克隆 麥胚抑制子 99D12 99Cl 88E8 89E279 2μg/ml 0.2μg/ml唾液淀粉酶 0 75 40 58 .65 67 65胰淀粉酶 0 17 6.2 1.8 4.6 0.5 0在全部初級培養(yǎng)物的4%中，發(fā)現(xiàn)了特異性唾液淀粉酶抑制活性，其交叉反應(yīng)活性低于10%。
實(shí)施例4生產(chǎn)腹水和其活性的測定對已用每次0.5毫升Pristan(Sigma，No.T7640)預(yù)處理過一次或二次的小鼠，靜脈注射1-2×106個雜交細(xì)胞(按實(shí)施例1生產(chǎn))。大約15～20天后，每只小鼠取腹水3-5毫升，其中約含10mg·Ig G/ml。
用200微克/毫升的濃度，單克隆抗體89E2抑制人唾液α-淀粉酶(800mμ/ml)高于95%，但對胰α-淀粉酶的抑制低于2%(方法與實(shí)施例3中所述的類似)。
權(quán)利要求
1.專門測定胰α-淀粉酶的方法，在有唾液α-淀粉酶存在的體液中，特別是血清，血漿，十二指腸液或尿中，與用于檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)在有與唾液α-淀粉酶反應(yīng)的單克隆存在時相反應(yīng)，其中所用的單克隆抗體專門抑制唾液，但對胰酶的抑制不超過50%。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所用的單克隆抗體，是用天然的或修飾過的唾液α-淀粉酶對AJ小鼠免疫，用轉(zhuǎn)化劑對免疫過的動物進(jìn)行B淋巴細(xì)胞融合，對所形成的雜交細(xì)胞克隆化并培養(yǎng)，再從培養(yǎng)物中分離單克隆而得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所用的單克隆抗體，是用被四硝基甲烷，N-溴代琥珀酰亞胺，碘乙酸或重氮化苯磺酸修飾過的唾液α-淀粉酶對Balb/c小鼠免疫，用轉(zhuǎn)化劑對免疫過的動物進(jìn)行B淋巴細(xì)胞融合，對這樣形成的雜交細(xì)胞單克隆化并培養(yǎng)，再從培養(yǎng)物中分離而得到的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所用的單克隆抗體是NCACC84122003號和NCACC第84122004號。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述的方法，其中進(jìn)行免疫時，使用了氫氧化鋁和百日咳博代氏桿菌(Bordetella pertussis)作為佐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2-5中任何一項(xiàng)所述的方法，其中以骨髓瘤細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化劑。
7.根據(jù)前述任何一個權(quán)項(xiàng)所述的方法，其中所用的單克隆抗體為固定化形式的。
8.根據(jù)前述任何一個權(quán)項(xiàng)所述的方法，其中所用的檢測胰α-淀粉酶的系統(tǒng)包括，分子中有4-7個葡糖殘基的麥芽多糖，麥芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖變位酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶和NAD。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-7中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所用的檢測胰α-淀粉酶的系統(tǒng)包括，分子中有4-7個葡糖殘基的硝基苯基麥芽多糖，同時還有α-葡糖苷酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-7中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所用的檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)包括，被可識別基團(tuán)修飾的淀粉。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，在有唾液α-淀粉酶存在時測定胰α-淀粉酶，基本上如前所述和所舉例。
12.用于在有唾液α-淀粉酶存在的體液中，特別是血清，血漿，十二指腸液或尿中專門測定胰α-淀粉酶的試劑，包括檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)和抗唾液α-淀粉酶的單克隆抗體，其中含有專門抑制唾液酶，但對胰酶的抑制不超過50%的單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的試劑，其中用于檢測胰α-淀粉酶的系統(tǒng)包括，分子中含4-7個葡糖殘基的麥芽多糖，麥芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖變位酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶和NAD。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的試劑，其中用于檢測胰α-淀粉酶的系統(tǒng)包括，分子中有4-7個葡糖殘基的硝基苯基麥芽多糖和α-葡糖苷酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的試劑，其中用于檢測胰α-淀粉酶的系統(tǒng)包括被可識別基團(tuán)修飾過的淀粉。
16.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的在有唾液α-淀粉酶存在的體液中測定胰α-淀粉酶的方法，基本如前述和所舉例。
專利摘要
本發(fā)明涉及在有唾液α-淀粉酶的體液中，特別是血清，血漿，十二指腸液和尿中專門測定胰α-淀粉酶的方法，在有與唾液α-淀粉酶反應(yīng)的單克隆抗體存在時與用于檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)反應(yīng)，其中所用的單克隆抗體專門抑制唾液酶但對胰酶的抑制不超過50％。以及用于在有唾液α-淀粉酶存在的體液，特別是血清，血漿，十二指腸液和尿中專門測定胰α-淀粉酶的試劑，它包括檢測α-淀粉酶的系統(tǒng)和唾液α-淀粉酶的單克隆抗體，其中含有的單克隆抗體專門抑制唾液酶但對胰酶的抑制不超過50％。
文檔編號G01N33/573GK86100747SQ86100747
公開日1986年7月9日 申請日期1986年1月8日
發(fā)明者科特·諾約克斯, 卡爾·伍爾夫, 馬丁·格伯 申請人:伯倫格·曼海姆有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan