專利名稱:促生長(zhǎng)素的溶解和復(fù)性方法
重組DNA技術(shù)已使異源蛋白質(zhì)能在一些宿主細(xì)胞如大腸桿菌(E.CoLi)中得以表達(dá)，但已有報(bào)道指出，有些異源蛋白質(zhì)，如促生長(zhǎng)素，往往在表達(dá)后仍不同程度地被封閉于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)折射體內(nèi)。
一些促溶劑，如鹽酸胍、硫氰化鈉、尿素和不同的去污劑，已被用來破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的非共價(jià)聯(lián)系。例如已有實(shí)驗(yàn)表明，在促溶劑的作用下，蛋白即“展開”，見Stryer，Biochemistry，《生物化學(xué)》(1981年第二版)34-35頁，W.H.Freeman和Cempany。同樣地，促溶劑還能使多亞基蛋白質(zhì)解離，形成其各個(gè)亞基。
最近歐洲專利申請(qǐng)114，506A號(hào)公布，異源蛋白質(zhì)能用某種烈性促溶劑如鹽酸胍、去污劑如十二烷基硫酸鈉和硫氰酸鹽從折射體內(nèi)溶解出來。而尿素這種較弱的促溶劑則對(duì)折射體無溶解作用。但鹽酸胍這樣的強(qiáng)變性劑是很昂貴的。此外，異源蛋白質(zhì)一經(jīng)溶于強(qiáng)變性劑，還必須把它移入不會(huì)干擾以后的離子交換純化步驟的弱變性劑中。
因此，本發(fā)明的目的是提供一能從宿主細(xì)胞的折射體中溶解出異源促生長(zhǎng)素蛋白，并使其復(fù)性的改良方法。
提供應(yīng)用既容易得到，又相對(duì)便宜的試劑的方法，是本發(fā)明的目的之一。
在相當(dāng)高的促生長(zhǎng)素濃度下進(jìn)行復(fù)性也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
使促生長(zhǎng)素蛋白的溶解和/或復(fù)性在有或無還原劑存在的情況下都能進(jìn)行則是本發(fā)明的另一目的。
另外，采用一種在生態(tài)學(xué)意義上較以往所用試劑更為安全的試劑也是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的所有這些目的和優(yōu)越性對(duì)于那些熟悉以下敘述和例證的人來說將是顯而易見的。
簡(jiǎn)言之，本發(fā)明提供了一種從宿主細(xì)胞的折射體內(nèi)溶解出促生長(zhǎng)素蛋白并使之復(fù)性的方法。特別是本方法還包括這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即觀察到一種尿素或二甲砜的水溶液能用來有效地溶解含有促生長(zhǎng)素這類蛋白質(zhì)的折射體。令人驚奇的是，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)促生長(zhǎng)素蛋白一經(jīng)溶解，在尿素或二甲砜的溶液中與溫和氧化劑接觸的時(shí)間足以使蛋白質(zhì)天然構(gòu)象中的二硫鍵得以形成，促生長(zhǎng)素蛋白即可復(fù)性。同時(shí)，這種復(fù)性過程即使在高蛋白濃度，制品不純甚至不用還原劑的情況下都能高效率地發(fā)生。
為了說明本發(fā)明的目的，似乎應(yīng)考慮對(duì)一些術(shù)語作如下定義“促生長(zhǎng)素”指包括但并不只限于哺乳動(dòng)物的促生長(zhǎng)素，如人、羊、豬和牛的促生長(zhǎng)素，和鳥類的促生長(zhǎng)素。除了適用于上述具有天然順序的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明同樣適用于一系列與天然存在的蛋白有關(guān)，且具有促生長(zhǎng)素樣活性的類似物和同源物。對(duì)本方面熟悉的人們將明白其它具有促生長(zhǎng)素相似化學(xué)性質(zhì)的促生長(zhǎng)素類的蛋白，如催乳素和胎盤催乳素，從純化上考慮實(shí)際上是與促生長(zhǎng)素等同的。有鑒于此本發(fā)明亦包括這樣一些蛋白質(zhì)。
“異源”蛋白質(zhì)是指宿主細(xì)胞正常情況下不產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。重組DNA技術(shù)已使大量異源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中得到表達(dá)，但尚不十分了解的是，這些蛋白質(zhì)常會(huì)被隔離在宿主細(xì)胞胞質(zhì)的不溶性光折射體中。
“折射體”指這樣的包含體或胞質(zhì)內(nèi)凝聚物，它們，至少其中一部分，含有被提取的異源促生長(zhǎng)素。這些凝聚物在相差顯微鏡下看上去象一些明亮的斑點(diǎn)。
“宿主細(xì)胞”指一種微生物細(xì)胞，如細(xì)菌和酵母或其他適宜的細(xì)胞，如動(dòng)、植物細(xì)胞，它們已被轉(zhuǎn)化用以表達(dá)異源促生長(zhǎng)素。宿主細(xì)胞在本發(fā)明中被看作是那些表達(dá)了外源促生長(zhǎng)素然后將此激素封閉進(jìn)折射體的細(xì)胞。一種典型的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.CoLi)K12(W3110/PBGH-1株)，該細(xì)胞已被轉(zhuǎn)化來表達(dá)牛促生長(zhǎng)素。
“復(fù)性”是指促生長(zhǎng)素蛋白折迭和氧化形成具有其生物活性的天然構(gòu)型。
“折迭”是指蛋白質(zhì)整體構(gòu)型的恢復(fù)足以使之適當(dāng)?shù)难趸Ｕ鄣峭ㄟ^降低尿素的變性效應(yīng)來完成的，如有必要，將尿素濃度調(diào)節(jié)到一適當(dāng)水平，從而保證蛋白質(zhì)中氨基酸的相互作用以呈現(xiàn)其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。
“氧化”是指分子內(nèi)二硫鍵的形成，以獲得穩(wěn)定的天然構(gòu)型，從而保證其生物活性。
“溫和氧化劑”指一種促使巰基氧化，使其形成分子內(nèi)二硫鍵，但不氧化蛋白中其它取代基團(tuán)的試劑。在采用溫和氧化劑如過氧化氫的同時(shí)，暴露于空氣的方法也是完全可接受的并且更為可取。
“生物活性”是指促生長(zhǎng)素能夠產(chǎn)生其應(yīng)產(chǎn)生的體內(nèi)生理反應(yīng)。此生物活性能通過已去除內(nèi)源性促生長(zhǎng)素的特定物種的適宜的體內(nèi)生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)來鑒定。本發(fā)明采用一種適用的促生長(zhǎng)素生物測(cè)定法，稱之為“大鼠增重生物測(cè)定法”。該方法中，促生長(zhǎng)素制品的生物活力是相對(duì)一已知制品(如提取的天然促生長(zhǎng)素)來估價(jià)的。系通過比較不同的制品劑量與對(duì)去垂體大鼠體重的增長(zhǎng)量的關(guān)系來確定。
促生長(zhǎng)素是由腺垂體(垂體前葉)分泌的激素，已知該激素能對(duì)骨骼生長(zhǎng)率和體重增加率產(chǎn)生影響，并已表明給予促生長(zhǎng)素能使泌乳動(dòng)物如奶牛和山羊的產(chǎn)乳量增加。典型的促生長(zhǎng)素大約191個(gè)氨基酸組成，分子量約為22，000道爾頓。好幾個(gè)物種的促生長(zhǎng)素的整個(gè)氨基酸序列現(xiàn)已發(fā)表，這些物種包括人和動(dòng)物中的鳥類、綿羊、豬和牛。在考慮“保守”氨基酸的替換時(shí)，曾將幾個(gè)物種的促生長(zhǎng)素的氨基酸序列作了比較，結(jié)果表明這些激素有相當(dāng)高的同一性。概括講，某些“保守的”氨基酸替換能夠在不致使蛋白質(zhì)總的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生根本變化的情況下發(fā)生。例如脂性疏水殘基(異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸，蛋氨酸)之間的替換，極性殘基之間的替換(如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天門冬氨酰胺之間以及谷氨酸和天門冬氨酸之間的互換)。相反電荷的離子殘基之間的替換也已被證實(shí)，如天門冬氨酸或谷氨酸和賴氨酸之間的互換。此外，一些“激烈的”替換(即導(dǎo)致側(cè)鏈類型發(fā)生變化的替換)也能在不致使蛋白質(zhì)功能和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生根本改變的情況下發(fā)生，只要這些替換發(fā)生的位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象不產(chǎn)生關(guān)鍵性影響以及這種替換的程度還不算太大。
下面的表一列出已報(bào)道的幾個(gè)物種的生長(zhǎng)激素的一級(jí)結(jié)構(gòu)。以下的縮略字用于表一中BGH(牛生長(zhǎng)激素);PGH(豬生長(zhǎng)激素，即家豬);OGH(羊生長(zhǎng)激素，即綿羊);AGH(鳥生長(zhǎng)激素，即家禽);HGH(人生長(zhǎng)激素)。符號(hào)“X”表示氨基酸序列中的一個(gè)空位，它在序列中只用來表示一些代表性的生長(zhǎng)激素的排列。如果在某一特定序列中標(biāo)上數(shù)字，則允許不再插入這種“X”符號(hào)，例如BGH序列中第126位亮氨酸(或象例10中所用的等位變化一樣，為纈氨酸)。
根據(jù)已報(bào)道的序列，在下面的表二中提供出各種特殊氨基酸的相應(yīng)含量。
表二幾種有代表性的促生長(zhǎng)素的氨基酸組成氨基酸 人 牛 羊 豬 鳥門冬氨酸 11 10 10 10 11門冬氨酰胺 9 6 6 5 9蘇氨酸 10 12 12 8 11絲氨酸 18 13 13 15 11谷氨酸 14 13 13 13 12谷酰胺 13 11 11 12 10脯氨酸 8 6 6 7 9甘氨酸 8 10 9 8 7丙氨酸 7 14 14 17 12纈氨酸 7 6 7 7 8蛋氨酸 3 4 4 3 4異亮氨酸 8 7 7 6 6亮氨酸 26 27 27 26 26色氨酸 8 6 6 7 8苯丙氨酸 13 13 13 13 11組氨酸 3 3 3 3 4賴氨酸 9 11 11 11 14精氨酸 11 13 13 12 12酪氨酸 1 1 1 1 1半胱氨酸 4 4 4 4 4
已有文獻(xiàn)報(bào)道促生長(zhǎng)素蛋白同源性地具有二硫橋，并進(jìn)一步證實(shí)哺乳動(dòng)物的促生長(zhǎng)素組成了一個(gè)同源的蛋白質(zhì)家族。
現(xiàn)已知道大多數(shù)異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)后，都不同程度地被封閉進(jìn)細(xì)菌胞質(zhì)中的折射體內(nèi)。這一點(diǎn)雖還不十分了解，但認(rèn)為至少部分是由于宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量過高的緣故。據(jù)認(rèn)為大腸桿菌內(nèi)有相當(dāng)高的氧化還原電位，因而致使異源促生長(zhǎng)素基本上是以還原態(tài)(即無二硫鍵聯(lián)結(jié)的)存在于折射體內(nèi)。
已有若干種促生長(zhǎng)素在大腸桿菌中被表達(dá)。例如人促生長(zhǎng)素(在E.CoLi K12，W3110/P107株中表達(dá))，公布于美國(guó)4，342，832號(hào)專利中;牛促生長(zhǎng)激素，公布于歐洲專利申報(bào)表第75，444A號(hào)(美國(guó)申請(qǐng)系列第303，689號(hào)，1981年9月18日歸檔，由E.COLi k12，W3110/PBGH-1株表達(dá));豬促生長(zhǎng)素公布于歐洲專利申報(bào)表第111，389A號(hào)(美國(guó)申請(qǐng)系列439，977號(hào)，1982年11月8日歸檔);以及鳥類促生長(zhǎng)素，公布于1983年9月13日歸檔的PCT申報(bào)表W084/01150號(hào)。
為達(dá)本發(fā)明的目的，用標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)即能獲得折射體。例如預(yù)先用0.25%重量百分比的甲苯和酚殺死的宿主細(xì)胞即能被常規(guī)的機(jī)械方法如Manton-GauLin勻漿器或法蘭西壓力機(jī)(French Press)破碎。破碎步驟最好到這樣的程度，即宿主機(jī)體的細(xì)胞碎片被充分打碎到不致在低速離心時(shí)從勻漿液中沉淀出來。而折射體能在低速離心時(shí)從勻漿中沉淀出來。最好將折射體再懸浮、洗滌和離心一次，然后棄去上清，留下的沉淀就基本上成為純制品。雖然對(duì)本發(fā)明無關(guān)緊要，但最好還是將折射體制品再勻漿一下，以避免折射體集聚，從而保證制品中的折射體能自由分散。制品最好用每平方吋3，000至5，000磅(表壓)在Manton-GauLin勻漿器中勻漿。
盡管前已報(bào)道尿素在用來使蛋白質(zhì)展開，以及將多亞單位蛋白質(zhì)解離成它們各自的亞基時(shí)是一種有效的試劑，但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，與以前的看法相反，只要把宿主細(xì)胞的折射體用一有效劑量和濃度的尿素來處理，就可把促生長(zhǎng)素從折射體內(nèi)充分溶解出來。從下面的討論可知道尿素在特定的濃度和PH值時(shí)，就成為一有效溶解試劑。另外，堿性二甲砜的水溶液也被發(fā)現(xiàn)是一種把促生長(zhǎng)素從折射體中提取出來的有效溶劑系統(tǒng)。雖然在多數(shù)情況下會(huì)將尿素或二甲砜單獨(dú)使用，但某些情況下將這兩種試劑合用還是可取的。
所需的尿素或二甲砜濃度和絕對(duì)量取決于PH值，以及特定的促生長(zhǎng)素和將被溶解的蛋白質(zhì)含量。由于尿素或二甲砜都容易獲得，且相當(dāng)便宜，在生態(tài)學(xué)意義上又比其他烈性解離試劑安全，同時(shí)又基本上不干擾以后的純化步驟，因此采用這兩種試劑在經(jīng)濟(jì)上是有利的。
為了使說明更簡(jiǎn)潔明了，下面的敘述將著重說明尿素的用法。對(duì)本文理解深入者亦會(huì)認(rèn)識(shí)到類似的作用參數(shù)(如濃度、絕對(duì)量，PH值、溫度等)也會(huì)影響采用二甲砜所獲得的結(jié)果。參見例13。
含促生長(zhǎng)素蛋白的大腸桿菌折射體曾被程度不同地溶解于PH為中性，濃度從8摩爾到10摩爾的尿素水溶液中，對(duì)一基本純的折射體制品，如果用接近中性PH的尿素處理一短時(shí)期，就只能有相對(duì)少量被部分地溶解。隨著尿素濃度的降低，溶解度也下降。在中性PH條件下，如果尿素濃度低于8摩爾太多，就幾乎測(cè)不到溶解過程的發(fā)生。
疏水蛋白質(zhì)總的說來在低溫下較多地溶于水溶液。本發(fā)明觀察到尿素對(duì)促生長(zhǎng)素蛋白的溶解，在低溫如4℃時(shí)比室溫，如20至25℃時(shí)更大。除了較高的溶解性，低溫溶解還增強(qiáng)尿素溶液的穩(wěn)定性，并抑制有可能存在于折射體制品中的蛋白酶活性。雖上述優(yōu)越性已表明是低溫下操作的結(jié)果，但對(duì)本發(fā)明來說這并不緊要。相反，只要蛋白質(zhì)并未發(fā)生不可逆的變性，就可以選擇其它操作溫度。但在多數(shù)情況下，把操作溫度定于25℃和溶劑冰點(diǎn)之間將是非常優(yōu)越和可取的。
本發(fā)明中，大劑量促生長(zhǎng)素蛋白的溶解通過調(diào)節(jié)尿素溶劑的PH值的高低來達(dá)到。下述實(shí)例雖可證實(shí)溶劑的PH被調(diào)到較酸或較堿時(shí)會(huì)導(dǎo)致不能預(yù)料的效果，但調(diào)到堿性還是可取的，因?yàn)橹泻筒襟E，特別是還原單體的氧化步驟是一種堿催化過程。溶劑PH可通過加入一種適宜的堿如氫氧化鈉而調(diào)節(jié)得更具堿性。折射體溶解后，溶劑的PH則可能下降，因此需定期加堿以維持其堿性。折射體在尿素濃度達(dá)到或超過每毫升60毫克時(shí)即被完全溶解，但其濃度低至1摩爾時(shí)，溶解也是成功的。溶解所需條件(即尿素濃度，相應(yīng)于折射體含量的溶液劑量和溶液的PH值)將取決于特定的折射體成分和待溶解折射體的量。
使用適宜的非干擾性的緩沖液以阻止溶液PH在溶解過程中的漂移將是可取的，盡管在本發(fā)明中并不絕對(duì)必要。適宜的緩沖液包括但不只限于三羥甲基氨甲烷和乙醇胺。用三羥甲基氨甲烷，以下稱為“Tris”，是可取的，因它價(jià)格便宜，容易獲得。濃度在10至90毫摩爾之間的Tris看來不會(huì)對(duì)促生長(zhǎng)素的產(chǎn)量有顯著影響。新鮮配制的50毫摩爾的Tris溶液其PH約為11.5。但是在4℃時(shí)Pk值為8.8的Tris在這種高PH值情況下只有弱的緩沖能力。濃度在約40到60毫摩爾的Tris較為合用，一方面可減少Tris的用量，而且能維持其一定的緩沖能力。
假如促生長(zhǎng)素是以多聚和/或氧化形式存在于折射體內(nèi)，那就適宜于用一種外源性還原劑如β-巰基乙醇或1，4-二硫基蘇糖醇的水溶液，以促使分子內(nèi)和分子間的二硫鍵斷裂。假如這種不正確的折迭單體或聚合體促生長(zhǎng)素存在，那么用還原劑處理就會(huì)提高促生長(zhǎng)素生物活性的恢復(fù)程度。已發(fā)現(xiàn)還原劑和巰基基團(tuán)能在尿素溶液中在生成高產(chǎn)量的正確氧化的促生長(zhǎng)素單體的同時(shí)伴隨性地氧化，因此也就無須在氧化促生長(zhǎng)素前將它們分離除去。在N-甲硫氨酰牛促生長(zhǎng)素(以下簡(jiǎn)稱MBS)和N-甲硫氨酰豬促生長(zhǎng)素(MPS)被大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)，這些激素蛋白被發(fā)現(xiàn)基本上是以還原(無二硫鍵聯(lián)結(jié))的形式存在于折射體中的。因此，對(duì)這些制品就不必再用還原劑。
本方法還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一旦促生長(zhǎng)素被溶解，就很容易轉(zhuǎn)變成它們所應(yīng)有的天然狀態(tài)。在其天然狀態(tài)，促生長(zhǎng)素含有兩個(gè)由四個(gè)半胱氨酸殘基形成的分子內(nèi)二硫鍵。不幸的是，這些半胱氨酸殘基在還原態(tài)下被氧化時(shí)，可以三種方式中的任意一種方式形成兩個(gè)分子內(nèi)鍵，而這三種方式中只有一種能形成確定的天然形態(tài)。同樣，一些促生長(zhǎng)素分子間的半胱氨酸殘基也可形成二硫鍵，從而出現(xiàn)二體、三體甚至多聚體。使促生長(zhǎng)素蛋白產(chǎn)生折迭和氧化的條件也對(duì)單體和多聚體的正確與錯(cuò)誤形態(tài)之間的比例產(chǎn)生影響。
在本發(fā)明之前，已有使蛋白質(zhì)復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)生化方法，即把蛋白質(zhì)從變性劑(即促溶劑)中移進(jìn)合適的緩沖液，例如移入含有某種還原劑，且PH又適宜于特定蛋白質(zhì)的碳酸氫鈉溶液，見Stryer，《生物化學(xué)》(1981年，第二版)第32至35頁，W.H.Freeman和Company，BowLey等人“人垂體生長(zhǎng)激素-激素的還原和再氧化”，ArChives of BioChemistry and Biephysics，1970年，138卷，338至346頁。所用的緩沖液體積以能使蛋白質(zhì)含量變得很低，通常應(yīng)使蛋白含量在每毫升1.5毫克以下。這樣，將試劑暴露于空氣，蛋白質(zhì)即被氧化。
蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成的機(jī)制被認(rèn)為是一種堿催化的自由基反應(yīng)，如March的著作“高等有機(jī)化學(xué)的進(jìn)展”Mc Graw Hill(1977)中所述，作為堿催化反應(yīng)，將氧化步驟置于堿性PH下進(jìn)行是可取的。雖然形成二硫鍵的氧化反應(yīng)在PH高于7的情況下也可進(jìn)行，但使工作PH高于蛋白質(zhì)中巰基的PK值(約為8.4)是可取的，尤其是在工作PH值處于9至12時(shí)為好，緩沖液以選用Tris為好。
和以往事實(shí)相反，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在尿素或二甲砜溶液中處于溶解狀態(tài)的促生長(zhǎng)素通過加入溫和氧化劑如過氧化氫或在空氣中暴露足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使巰基氧化成分子內(nèi)的二硫鍵，即可有效地復(fù)性。進(jìn)一步又發(fā)現(xiàn)復(fù)性可在促生長(zhǎng)素的含量高達(dá)每毫升30毫克或更多時(shí)進(jìn)行，但每毫升少于30毫克甚至少于20毫克時(shí)更可取。不論還原劑是否存在，復(fù)性都能以一種有效的方式在雜有宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行。促生長(zhǎng)素單體含量可通過任何一種適宜的生化技術(shù)如放免測(cè)定(RIA)，限外層折(分子篩)和高性能液相層析(HPLC)來確定。
無外源還原劑如β-巰基乙醇或1，4-二巰基蘇糖醇時(shí)，或小心除去氧氣之后，促生長(zhǎng)素分子的氧化便取決于蛋白質(zhì)的溶解程度。對(duì)具有生物活性的促生長(zhǎng)素單體的產(chǎn)量來說，尿素的濃度看來是一個(gè)最具影響力的參數(shù)。確實(shí)，氧化過程實(shí)質(zhì)上會(huì)在任何使促生長(zhǎng)素總保持著溶解狀態(tài)的尿素濃度時(shí)進(jìn)行，應(yīng)知道促生長(zhǎng)素一旦被溶解，便能在低溫和1摩爾乃至更低濃度的尿素溶液中保持其溶解狀態(tài)。因此，為提高促生長(zhǎng)素單體的產(chǎn)量，就應(yīng)把尿素從溶解步驟使用的濃度調(diào)至為復(fù)性所需的最適濃度。特定的最適濃度需視特定的生長(zhǎng)激素而定。當(dāng)溶解后需要降低尿素濃度時(shí)，可加入蒸餾水和緩沖液將尿素溶液稀釋。采用還原劑，就不需要立即對(duì)尿素濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。無還原劑會(huì)導(dǎo)致單體產(chǎn)量下降。7.5摩爾的尿素用作溶劑時(shí)，在尿素稀釋前MBS會(huì)每小時(shí)丟失大約5%(重量百分比)。
對(duì)MBS來講，復(fù)性時(shí)尿素濃度在4至5摩爾之間為好。在4.5摩爾時(shí)，復(fù)性看來是理想的，高或低于此濃度都使促生長(zhǎng)素單體的產(chǎn)量降低，形成更多的多聚體。因此，假如以濃度為7.5摩爾的尿素作為溶劑，但又不加還原劑的情況時(shí)，最好在溶解后迅速加入蒸餾水和適宜的緩沖液如Tris，以便將尿素濃度稀釋到4.5摩爾，從而降低在較高的非最適尿素濃度下的氧化反應(yīng)。
MPS有18個(gè)氨基酸與MBS不同，其適宜的尿素濃度在2.5至3.5摩爾之間，而其理想的復(fù)性尿素濃度大約為3摩爾，而在較高和較低尿素濃度時(shí)都使單體回收下降及聚集體的生成增加。同樣地，將尿素濃度在很好混合的情況下迅速從7.5摩爾稀釋成3摩爾時(shí)，為在無還原劑存在下減少較高的非最適濃度尿素中的復(fù)性，采用一種適宜的緩沖液如Tris是可取的。
將上述方法中溶解和復(fù)性的生長(zhǎng)激素進(jìn)一步用標(biāo)準(zhǔn)的層析技術(shù)純化。其生物活性則通過對(duì)大鼠增重生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)的陽性反應(yīng)來確定。此測(cè)定中，異源生長(zhǎng)激素的生物活性要參考相應(yīng)的一系列已知生長(zhǎng)激素制品(即牛和豬的垂體生長(zhǎng)激素)的不同劑量對(duì)去垂體大鼠相應(yīng)的增重量來評(píng)價(jià)。將大鼠增重量對(duì)特定的生長(zhǎng)激素制品和已知標(biāo)準(zhǔn)品(即垂體制品)的用量作圖，得到同一座標(biāo)系中的兩條劑量反應(yīng)曲線，比較兩曲線的迴歸斜率，即可以不同量標(biāo)準(zhǔn)品所代表的相對(duì)活性，以每毫克的單位數(shù)計(jì)算出異源生長(zhǎng)激素制品的相應(yīng)活性。
MBS用本發(fā)明的方法來溶解和復(fù)性，其制品被進(jìn)一步純化，然后用于泌乳期奶牛，結(jié)果使實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的產(chǎn)乳量(重量)比對(duì)照組動(dòng)物的產(chǎn)量高10到40%，見EpPard等人發(fā)表在1984年康奈爾營(yíng)養(yǎng)會(huì)議記錄中的文章，“長(zhǎng)期使用生長(zhǎng)激素對(duì)泌乳期奶牛產(chǎn)乳行為的影響”。
下面的例子主要用來更好地闡明本發(fā)明的實(shí)施。這里舉例的目的應(yīng)被理解為僅僅是為了解釋本發(fā)明的應(yīng)用方法，而決不是對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用范圍加以一種限制。
例1本發(fā)明已被證明能溶解大腸桿菌表達(dá)的N-甲硫氨酰牛促生長(zhǎng)素(MBS)，Seeburg等人對(duì)此已有概述，見DNA1983年二卷1期37至45頁，每一步驟的詳情可在以下作者的文章中查到，Goeddel等人，Nature281卷(1979年10月);Deboert等人，起動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能，462-481頁，Praeger Seientific Publishing CO，(1982年);MiOzzari等人，J.BaCteriology，133卷，1457至1466頁，(1978年)。將收集的細(xì)胞在Manton-GuaLin勻漿器中勻漿兩次，使細(xì)胞破碎，然后低速離心使含有MBS的折射體沉淀，棄去上清，懸浮折射體，并洗滌、離心，棄去上清后，即留下基本上純的折射體制品。
將上述方法制備的折射體制品在25℃時(shí)加入不同濃度和不同PH的尿素溶液。所有緩沖液都含100毫摩爾Tris堿，其pH用鹽酸調(diào)節(jié)，折射體的最終濃度約為每毫升溶液中含4毫克。折射體的溶解度由分光光度學(xué)方法確定。假定折射體整個(gè)是由蛋白質(zhì)組成，在277毫微米，光通徑為1厘米時(shí)，采用消光系數(shù)0.68表示每毫升1毫克的蛋白濃度。起始濃度用分光光度學(xué)方法定為完全溶解的樣品。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖1中表示。該資料支持一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即將PH調(diào)至堿性范圍時(shí)溶解度會(huì)大大地增強(qiáng)。
例2基本上參照例1的方法，只是將溫度保持在4℃，PH往酸、堿兩個(gè)方向調(diào)節(jié)。與例1相同，緩沖液都含有100毫摩爾Tris堿，PH調(diào)向酸性時(shí)要用乙酸。該結(jié)果在圖2中表示。比較圖1和圖2的結(jié)果可看出，在一定的尿素濃度和PH條件下，低溫(4℃)比室溫(25℃)能明顯提高溶解度。
比較實(shí)例A按例1方法制備含MBS的折射體，將其與10摩爾的尿素混合，不調(diào)節(jié)PH，混合后的折射體濃度約為每毫升5毫克。使溶液混勻，并在4℃平衡過夜。按上述分光光度法測(cè)定溶解度，其值為每毫升僅約2.9毫克。確定折射體的起始濃度時(shí)加入足夠的尿素溶液使折射體完全溶解，用分光光度計(jì)測(cè)定完全溶解溶液的濃度并調(diào)節(jié)稀釋。
比較實(shí)例B按例1方法制備含MBS的折射體，使之與8摩爾的尿素混合，不調(diào)PH，使折射體的最終濃度為每毫升大約5毫克，將溶液混勻后4℃平衡過夜，在分光光度計(jì)上測(cè)得的溶解度為每毫升2.4毫克，確定折射體起始濃度時(shí)加入足夠的尿素溶液使折射體完全溶解，用分光光度計(jì)測(cè)定完全溶解溶液的濃度并調(diào)節(jié)稀釋。
例3按例1方法制備含MBS的折射體，與4.5摩爾無緩沖能力的尿素水溶液混合，使折射體濃度約為每毫升66毫克，加入氫氧化鈉液使PH從7升到11，溶液即被認(rèn)定為完全溶解液。折射體的濃度按例1所述的方法確定為每毫升66毫克。
例4按例1方法制備含MBS的折射體，溶于含100毫摩爾Tris，PH10.5，濃度為7.5摩爾的尿素水溶液，加入100毫摩爾的Tris將尿素濃度調(diào)至不同水平，同時(shí)加入一定量的適宜尿素溶液將總蛋白濃度調(diào)至每毫升大約1毫克(通過完全溶解樣品的分光光度學(xué)分析方法確定)。將溶液與空氣接觸并攪拌24小時(shí)，使之氧化。該結(jié)果在圖3中表示，MBS單體產(chǎn)量以占總MBS含量的重量百分?jǐn)?shù)表示。如圖3所示，最佳的復(fù)性效率在尿素濃度約為4.5摩爾時(shí)得到。
例5下述操作方法已在例4中述及。將含MBS的折射體溶解于PH10.5，含100毫摩爾Tris的7.5摩爾尿素溶液，然后用100毫摩爾的Tris將溶解液稀釋到4.5摩爾，PH調(diào)在10.5至8.5之間。這些個(gè)別的試驗(yàn)是在暴露于空氣及攪拌24小時(shí)的條件下進(jìn)行氧化的。MBS單體和寡聚體含量通過HPLC確定。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出在氧化過程中復(fù)性效率對(duì)溶液PH有著相當(dāng)平伏的反應(yīng)，但在較高PH時(shí)，復(fù)性效率仍具有上升趨勢(shì)。此外，這種堿催化的氧化在較堿性PH水平時(shí)反應(yīng)較快。
例6按例1方法制備折射體制品，從中取出大約150毫升，在4℃與850毫升5.3摩爾的尿素混合，由此得到4.5摩爾的尿素，然后用50%重量百分比的氫氧化鈉液將其PH調(diào)至11。完全溶解的折射體使MBS的總濃度約為每毫升12.4毫克。將溶液在4℃攪拌過夜從而使MBS氧化。氧化液的HPLC分析結(jié)果表明MBS單體產(chǎn)率約為80%(重量百分比)。
例7MPS用例1列出的參考文獻(xiàn)中所敘述的常規(guī)技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)。然后用前述方法收集含MPS的折射體，在4℃將其溶于PH11.0，含90毫摩爾的Tris，濃度為7.5摩爾的尿素中。每毫升上述尿素溶液溶有113毫克(濕重)折射體顆粒。用90毫摩爾Tris和/或尿素將樣品稀釋，以得到濃度分別為4.5摩爾，3摩爾和2摩爾的尿素溶液而其中MPS的濃度均為每毫升4毫克(濕重)折射體顆粒。樣品在攪拌情況下暴露于空氣過夜進(jìn)行氧化。HPLC測(cè)定結(jié)果指出在尿素濃度為3摩爾時(shí)MPS單體產(chǎn)量最佳。
例8操作同例7的方法，MPS在4℃分別以三種濃度(每毫升前述尿素溶液中含20、40和80毫克沉淀(濕重)溶于含90毫摩爾，PH為11，濃度為7.5摩爾的尿素溶液。所有樣品液用90毫摩爾Tris和/或尿素稀釋到尿素濃度為3摩爾，MPS濃度為每毫升1毫克，然后暴露于空氣，4℃攪拌56小時(shí)，HPLC測(cè)定結(jié)果指出MPS單體的平均產(chǎn)量為69%(重量百分比)。
例9操作基本上參照例8方法進(jìn)行，但溶解和復(fù)性在0.1毫摩爾的1，4-二巰基蘇糖醇存在下進(jìn)行，HLPC測(cè)定結(jié)果指出MPS單體的平均產(chǎn)量為66%(重量百分比)。
例10BGH的三種變體，Ala-1，Ala-1Val126，和Met-1Val126，已在大腸桿菌中表達(dá)，其操作方法已由G.G.krivi在“原核細(xì)胞蛋白質(zhì)的生產(chǎn)”一文中闡述，且在文獻(xiàn)中特別提到。該文章的方法同時(shí)也記錄在美國(guó)專利申請(qǐng)系列704，362號(hào)，于1985年2月22日歸檔。參照例1的常規(guī)方使BGH的變體進(jìn)行溶解和復(fù)性。
含有不同BGH變體的折射體按例1方法制備，將近300克濕重的折射體用水懸浮后得到1升漿液，然后將其與大約5升9摩爾的尿素及108毫摩爾Tris混合，使不同BGH變體的溶解液由7.5摩爾的尿素和90毫摩爾的Tris組成，其PH為10.5，溫度為4℃。攪拌幾分鐘后得到完全溶解液。緩慢加入4升冷水以便得到復(fù)性溶劑，從而使不同BGH變體存在于4.5摩爾濃度的尿素中，其中Tris濃度為54毫摩爾，PH10.5，溫度4℃。讓溶液與空氣接觸，并攪拌48小時(shí)，不同的BGH變體即被氧化。用HPLC測(cè)定，表明三種變體的單體產(chǎn)量幾乎都達(dá)到60%至70%(重量百分比)。
例11參照前述方法制備結(jié)構(gòu)上均一的促生長(zhǎng)素蛋白，并按已敘述的圓二色性法確定天然垂體促生長(zhǎng)素的結(jié)構(gòu)。(見Bewley，激素研究的近期進(jìn)展，35卷，155-210頁，科學(xué)出版社。)另外還特別將MBS和BGH的Ala-1變體與牛垂體促生長(zhǎng)素作了比較。樣品溶于PH9.5，濃度50毫摩爾的碳酸氫鈉，并用上述技術(shù)分析，結(jié)果表明按本方法制備的重組促生長(zhǎng)素在復(fù)性后獲得了天然構(gòu)型。
例12按例1方法制備含MBS的折射體，在4℃與1摩爾的無緩沖能力尿素混合，用氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)維持在12.1。該溶液即定為完全溶解液。折射體濃度按例1所述方法分析，確定為每毫升大約10毫克。
例13按例1方法制備含MBS的折射體，在28℃溶于3摩爾的二甲砜，PH為11.8。此時(shí)MBS濃度為每毫升2毫克。溶解的MBS經(jīng)空氣氧化后，其氧化產(chǎn)物與用4.5摩爾尿素，在PH11.3(50毫摩爾Tris)，5℃時(shí)獲得的氧化產(chǎn)物在分子間成鍵程度上沒有顯著差別。
權(quán)利要求
1.一種從宿主細(xì)胞的折射體內(nèi)溶解得到促生長(zhǎng)素蛋白并使之復(fù)性的方法，其特征在于，宿主細(xì)胞含所指的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)參與構(gòu)成與其接觸的所謂折射體，將折射體與一有效劑量和濃度的尿素或二甲砜的水溶液混合，并處于有效的PH條件下，就可完成對(duì)折射體的溶解，爾后，將含有所說蛋白質(zhì)的溶液與一溫和氧化試劑接觸充分的時(shí)間，以使存在于所說蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)的二硫鍵。
2.一種將促生長(zhǎng)素蛋白從一種含有該蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的折射體中溶出的方法，包括采用有效劑量和濃度的尿素或二甲砜，在有效PH水平與折射體接觸而實(shí)現(xiàn)的對(duì)該蛋白的溶解。
3.在權(quán)利要求
2的方法中，折射體是被溶解于尿素的水溶液中。
4.在權(quán)利要求
3的方法中，溶解過程是在一種低于25℃、高于溶液冰點(diǎn)的溫度中進(jìn)行。
5.在權(quán)利要求
3的方法中，溶解是在PH大于9以上進(jìn)行。
6.權(quán)利要求
3的方法中，溶解在PH大致為9到12之間進(jìn)行。
7.在權(quán)利要求
3的方法中，溶解是在PH大致為9到12之間，同時(shí)溫度約為4℃時(shí)進(jìn)行。
8.在權(quán)利要求
3的方法中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌大腸桿菌Escher-ichia CoLi的一個(gè)株系。
9.在權(quán)利要求
3的方法中，溶解是在不用還原劑的情況下進(jìn)行。
10.在權(quán)利要求
3的方法中，溶解是在還原劑參與下進(jìn)行。
11.在權(quán)利要求
3的方法中，促生長(zhǎng)素是牛促生長(zhǎng)素或豬促生長(zhǎng)素。
12.在權(quán)利要求
11的方法中，宿主細(xì)胞是菌種Escherich-ia CoLi的一個(gè)株系。
13.在權(quán)利要求
12的方法中，尿素濃度在約1摩爾到10摩爾之間，PH維持在約9到12之間，溫度在溶液的冰點(diǎn)之上，25℃以下。
14.權(quán)利要求
13的方法中，PH值用有效劑量的三羥甲基氨甲烷來維持在所說的PH范圍內(nèi)。
15.使促生長(zhǎng)素蛋白復(fù)性的方法中，促生長(zhǎng)素蛋白與尿素或二甲砜試劑接觸，同時(shí)還要與溫和氧化試劑接觸一段時(shí)間，足以使其所含的半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)的二硫鍵。
16.權(quán)利要求
15的方法中，促生長(zhǎng)素蛋白在尿素的水溶液中復(fù)性。
17.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性是在濃度為3到5摩爾的尿素中進(jìn)行的。
18.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性是在PH大于9以上時(shí)進(jìn)行的。
19.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性在PH大致為9到12時(shí)進(jìn)行。
20.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性在溫度高于溶劑冰點(diǎn)，低于25℃時(shí)進(jìn)行。
21.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性過程中有還原劑參與。
22.權(quán)利要求
16的方法中，復(fù)性過程中無還原劑的參與。
23.權(quán)利要求
11的方法中，生長(zhǎng)激素是?；蜇i的生長(zhǎng)激素。
24.權(quán)利要求
23的方法中，復(fù)性是在濃度約為2和5摩爾的尿素中進(jìn)行;溫度高于溶液冰點(diǎn)，低于25℃左右;PH大致在9至12之間。
25.權(quán)利要求
2的方法中，折射體是溶解在二甲砜水溶液里。
26.權(quán)利要求
15的方法中，促生長(zhǎng)素蛋白的復(fù)性在二甲砜的水溶液中進(jìn)行。
專利摘要
公開一種從宿主細(xì)胞的折射體中溶解出促生長(zhǎng)素蛋白并使其獲得天然性狀的方法。該方法包括這一發(fā)現(xiàn)，即尿素或二甲砜的水溶液能用來有效地溶解含有促生長(zhǎng)素蛋白的折射體。一經(jīng)溶解，促生長(zhǎng)素在尿素或二甲砜溶液中，與溫和氧化劑接觸長(zhǎng)到足以形成二硫鍵的時(shí)間，即可被復(fù)性。這種復(fù)性即使在高蛋白濃度、制品不純和不存在還原劑的情況下，亦能有效地產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07K1/113GK86100915SQ86100915
公開日1986年8月20日 申請(qǐng)日期1986年2月21日
發(fā)明者拉里·安德魯·本特爾, 詹姆斯·威廉·米切爾, 斯蒂芬·布雷德利·斯托爾斯, 格蘭特·強(qiáng)島本 申請(qǐng)人:孟山都公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan