專利名稱：:抗人心房鈉尿肽的單克隆抗體的制作方法本發(fā)明關(guān)系到一般的新雜交瘤細(xì)胞株，特別是產(chǎn)生對(duì)人和大鼠心房鈉尿肽(ANP)有特異性的單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞株，采用這種方法無論在體內(nèi)還是體外產(chǎn)生mAb，可以有助于診斷和用于研究目的。將骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行融合(Koehler和Milstein，自然，256，495-497(1975))，首次表明可以得到產(chǎn)生均一抗體(稱為“單克隆”抗體)的傳代細(xì)胞株。此后，科學(xué)工作者作了種種努力以制備多種雜交細(xì)胞(稱為“雜交瘤”)，并且利用形成的抗體進(jìn)行了許多科學(xué)研究(例如微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前課題，Vol.81-“淋巴細(xì)胞雜交瘤”，F(xiàn).Melchersetal.，SpringerVerlag，1978，附有參考文獻(xiàn);C.Barn-stable等，細(xì)胞14，9-20(1978);P.Parham，W.F.Bodmer，自然276，397-399，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，第三版，第2卷，D.M.Wier，編輯，Blackwell1978，25章;化學(xué)工程新聞，15-17(1979)9)。這些發(fā)表的文章敘述了利用雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體的主要技術(shù)。已經(jīng)得到了抗組織相容性抗原，抗半抗原，旦白質(zhì)和酶的單克隆抗體。但是還沒有高度選擇性的同哺乳動(dòng)物，例如人或大鼠心房鈉尿肽類反應(yīng)的單克隆抗體。心房鈉尿肽是一類具有不同鏈長(zhǎng)的肽類，它的最低限度活度序列由23種氨基酸組成。含有其他N-未端和C-未端的氨基酸的肽類活性也是相同的。這種肽是在心房中由一種大約152個(gè)氨基酸組成的前體分子通過酶的作用而形成的。編碼ANP的基因已進(jìn)行了克隆，DNA已進(jìn)行了序列分析。ANPs誘導(dǎo)持續(xù)期短，但有效的鈉尿作用至今尚不能表明這種物質(zhì)作用的精確管狀位點(diǎn)。此外，ANPs是有效的血管擴(kuò)張劑，換言之，它對(duì)正腎上腺素，血管緊張素Ⅱ，組織胺和5-羥色胺對(duì)血管的活性有拮抗作用。ANPs的作用不被消炎痛所抑制，關(guān)于其作用是通過內(nèi)源前列腺素合成進(jìn)行的看法似不可靠。對(duì)于ANP對(duì)two-clip低血壓大鼠和SH大鼠的降血壓作用已進(jìn)行了敘述。在分離的細(xì)胞中，對(duì)醛固酮和后葉加壓素分泌的抑制作用已進(jìn)行了測(cè)定。可以采用常規(guī)的抗體放射免疫學(xué)方法測(cè)定ANP的血漿水平，這取決于特定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體積大小，采用磺125標(biāo)記的ANP衍生物可以測(cè)定對(duì)分離層血管球細(xì)胞的特異結(jié)合。最初的實(shí)驗(yàn)表明，在腎中，ANP可以誘導(dǎo)激肽釋放酶的釋放。在一定情況下，這種肽對(duì)腎的活性可以由于用氟丁苯(haloperidol)予處理而失效(見Segn-ella和MacGregor，自然399，666-668，1984)。ANP的活性譜表明，這些肽可能與循環(huán)失調(diào)(高血壓、低血壓、動(dòng)脈硬化)，心臟功能失調(diào)(急性和亞急性心臟功能不全，心肌梗塞、心律不齊、冠心病)以及腎功能失調(diào)(各種基礎(chǔ)紊亂過程中的急性和亞急性腎功能不全，尿毒癥)是相關(guān)的，因此，定量測(cè)定不同生物體液中的ANP(例如，血液、血漿、血清、尿、淋巴液或腦脊髓液)對(duì)于上述各種癥狀是十分重要的。采用常規(guī)抗血清測(cè)定某些ANP在血漿中的水平是十分高的，這可以通過這些抗體的交叉反應(yīng)或缺少特異性來予以解釋。利用高特異性的(單克隆)抗體可以避免心房鈉尿肽在血漿中錯(cuò)誤高水平的冒險(xiǎn)測(cè)定。因此，這種類型的抗體適用于診斷與ANP水平變化有關(guān)的所有失調(diào)癥。本發(fā)明關(guān)系到制備能夠合成和分泌抗心房鈉尿肽的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明還關(guān)系到能夠合成和分泌抗哺乳動(dòng)物特別是抗人或大鼠的那些心房鈉尿肽的特異單克隆抗體的雜交瘤系。采用介紹部分Koehler和Milstein所敘述的方法制備雜交瘤。用結(jié)合于一種免疫載體例如旦白質(zhì)的心房鈉尿肽免疫小鼠后，將這些鼠的脾細(xì)胞同一種鼠骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合。對(duì)這樣產(chǎn)生的雜交瘤系統(tǒng)地檢驗(yàn)了選擇性同心房鈉尿肽反應(yīng)的抗體。采用這種方法分離了產(chǎn)生抗心房鈉尿肽抗體的雜交瘤，本發(fā)明也與這些抗體有關(guān)。產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤已儲(chǔ)于國(guó)立動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)收集中心和英國(guó)PortonDown，SalisburySP4OJG應(yīng)用微生物和研究PHLS中心，保存號(hào)為850314/1(產(chǎn)生mAb11A-A11的雜交瘤細(xì)胞系)和850314/2(產(chǎn)生mAb23M-09的雜交瘤細(xì)胞系)。根據(jù)本發(fā)明，這些抗體可以用于例如測(cè)定心房鈉尿肽在生物體液如血，血漿、血清、尿，淋巴液或腦脊髓液中的含量水平。按照本發(fā)明，這些抗體特別適于進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，而且，利用免疫吸附層析法，它們也可以用于分離心房鈉尿肽。對(duì)于深入研究在不同生理和病生理?xiàng)l件下，ANP的意義而言，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是絕對(duì)必須的。對(duì)于這些研究以及對(duì)于ANP，所有藥學(xué)研究的予定要求是進(jìn)行適宜于在體液定量測(cè)定的特異和敏感實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明，這些抗體可以用于例如測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的心房鈉尿肽水平以達(dá)到診斷目的。按照本發(fā)明，這些抗體也十分適用于生理學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。一般而言，制備雜交瘤包括步驟如下A)用例如結(jié)合于一種免疫載體，特別是結(jié)合于一種免疫載體旦白(例如主形血青旦白)(KLH-ANP)的人或大鼠的心房鈉尿肽免疫哺乳動(dòng)物。雌性BaLb/c小鼠適于這種實(shí)驗(yàn)?zāi)康模遣捎闷渌N鼠也是可能的。對(duì)于KLH-ANP的濃度和免疫方式需要進(jìn)行選擇，從而可以形成適當(dāng)數(shù)量的刺激淋巴細(xì)胞抗原。以14天為間隔，注射三次含100微克KLH-ANP的磷酸鹽生理緩沖液，對(duì)小鼠是有效的。B)得到免疫哺乳動(dòng)物的脾臟(例如小鼠)，并且在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中制備脾細(xì)胞懸液。一個(gè)脾臟，大約1毫升培養(yǎng)液就夠了。有關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是已知的。C)采用一種適當(dāng)?shù)娜诤洗龠M(jìn)劑，(例如聚乙二醇)將是浮的脾細(xì)胞和適當(dāng)細(xì)胞系的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合(例如小鼠骨髓瘤P×63Ag8)。采用的最好融合促進(jìn)劑是平均分子量1000和4000之間的聚乙二醇(例如商業(yè)提供PEG1000等)。但是也可以采用其他已知的融合劑。脾細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞的比例最好大約為10。對(duì)于108脾細(xì)胞總體積為0.5-1.0毫升融合培養(yǎng)基已足夠。已經(jīng)知道有多種小鼠骨髓瘤細(xì)胞，而且可以從研究所或細(xì)胞保存研究所得到。采用的細(xì)胞系最好具有一種遺傳缺陷，這樣一來，在選擇培養(yǎng)基中非融合骨髓瘤細(xì)胞死亡，而雜種存活。經(jīng)常利用的是抗8-吖烏嘌呤的細(xì)胞系，這種細(xì)胞系缺少次黃嘌呤，烏嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此不能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)(科學(xué)，145709，1964)。采用的細(xì)胞系最好也是非必泌類型的，這樣它本身便不會(huì)形成抗體或免疫球旦白的H或C-鏈。但是在某些情況下，采用分泌的骨髓瘤細(xì)胞也可能是有益的。D)將融合混合液(脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞)進(jìn)行稀釋，在單個(gè)容器的選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，這樣一來非融合的細(xì)胞則不會(huì)增殖，并且在1-2周內(nèi)死亡。通過調(diào)節(jié)稀釋液的體積可以分離得到單個(gè)的融合細(xì)胞，從而使得一定數(shù)目的細(xì)胞(大約1-4個(gè))可以置于每一容器中(例如一種微量滴定度平板的每一小孔)。E)測(cè)定每一小孔中抗心房鈉尿肽的抗體。F)選擇并克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤(例如采用有限的稀釋)。一旦選擇得到所需雜交瘤并進(jìn)行了克隆，則可能通過兩種不同的方法得到抗體。當(dāng)雜交瘤培養(yǎng)在適當(dāng)培養(yǎng)基中一定時(shí)間則可以得到十分高純度的單克隆抗體，這種抗體是從上清液中獲得的。為了測(cè)定，要采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和適宜的培養(yǎng)時(shí)間。這種體外技術(shù)提供的單克隆抗體只被少量異源血清來源的旦白所污染(例如胎牛血清)。為了制備一種純度略低，十分濃的單克隆抗體，有可能通過對(duì)小鼠腹腔注射選擇的雜交瘤來達(dá)到。這種小鼠最好是同源的或半同源的。經(jīng)過培養(yǎng)，一定時(shí)間后，導(dǎo)致小鼠形成一種腫瘤。這種瘤在宿主動(dòng)物血和腹膜滲出液(腹水)中，釋放出高濃度的抗體(5-20毫克/毫升)。甚至即或這些小鼠在血和腹水中具有正常的抗體，然而它們的濃度與mAb相比仍是十分低的。這樣得到的單克隆抗體滴定度很高(稀釋10-3或更低時(shí)，仍有活性)，特異和非特異免疫球旦白比為20∶1。例1制備抗人體和大鼠的心房鈉尿肽單克隆抗體制備用于免疫的抗原采用的抗原是人-α-ANP或大鼠artripeptinⅡ(Bachem提供)和主形血清蛋白的結(jié)合物(KLH，太平洋生物海洋供應(yīng)公司)。為了制備，將KLH和人-α-ANP或atriopeptineⅡ以克分子比1∶1混合，在磷酸鹽生理緩沖液中加入2毫克/毫升戊二醛。反應(yīng)混合液中戊二醛最終濃度為0.25%。室溫保溫1小時(shí)后，蛋白結(jié)合物對(duì)磷酸鹽生理緩沖液透析若干次，在4℃。Balb/C小鼠的免疫用溶在0.2毫升完全的Freund佐劑的100微克KLH-ANP結(jié)合物腹腔免疫雌性BaLb/C小鼠。14天后，再次用溶于不完全Freund佐劑的100微克抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。然后，以14天為間隔再進(jìn)行兩次靜脈免疫注射，每次注射每只動(dòng)物磷酸生理緩沖液100微克，其中含50微克抗原。在最后一次注射抗原3天后，摘除動(dòng)物的脾臟。制備脾臟細(xì)胞懸液使器管強(qiáng)行通過一種不銹鋼篩孔，可以從摘除的脾臟得到不同的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入Dulbecco最低必須培養(yǎng)基(DMEM)，這種培養(yǎng)基每升含有4.5克葡萄糖，100單位青霉素和每毫升100微克鏈霉素。用DMEM洗滌細(xì)胞3次，然后按所需濃度再懸浮于同樣培養(yǎng)基中。一般而言，從每一脾臟可以得到108細(xì)胞。制備骨髓瘤細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)用的骨髓瘤細(xì)胞系X63Ag8.653是不表達(dá)任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈的小鼠骨髓瘤系P3-X63-Ag8的亞克隆。(免疫學(xué)雜志1231543-1550(1980))。這種細(xì)胞對(duì)于20微克/毫升8-吖烏嘌呤敏感，并且在含有次黃嘌呤，氨基碟呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)(HAT)。將它們培養(yǎng)在補(bǔ)加有每升4.5克葡萄糖，20mM谷氨酸胺，每毫升1000單位青霉素，100微克鏈霉素和10%胎牛血清(完全培養(yǎng)基)的DMEM培養(yǎng)基中。在融合時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞正處于細(xì)胞增殖的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。細(xì)胞融合向不加血清的DMEM培養(yǎng)基中以與骨髓瘤10∶1的比例加入脾細(xì)胞，用園底離心杯以200g離心10分鐘。當(dāng)細(xì)胞沉降后，仔細(xì)地倒去上清液，將細(xì)胞與2毫升分子量2000聚乙二醇(用DMEM稀釋至30%(w/w)PH7.6)37℃，保溫1分鐘。然后加入20毫升DMEM，這樣再仔細(xì)地懸浮細(xì)胞若干分鐘。再以200g離心5分鐘，將細(xì)胞體再度以106細(xì)胞/毫升濃度懸浮于HAT培養(yǎng)基中，再將它們按每份1毫升分布于Costar平板上。雜交瘤的選擇和培養(yǎng)細(xì)胞融合后于37℃在含有5%二氧化碳的濕氣中，將細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)。幾周后，采用適當(dāng)?shù)拿笇W(xué)免疫實(shí)驗(yàn)(見后)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)得到的上清液中，存在的抗-ANP活性。挑選抗ANP實(shí)驗(yàn)陽性的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆。有必要對(duì)雜交瘤采用一種有限稀釋方法，利用這種方法按每孔平均0.5細(xì)胞分布在96個(gè)微滴定度孔中，作為“喂養(yǎng)細(xì)胞”，將105小鼠胸腺細(xì)胞加至每一孔中。將這種克隆過程后仍然產(chǎn)生抗ANP抗體的細(xì)胞在含有25%胎牛血清和7.5%。二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖，并在液氮中進(jìn)行冷凍保存。制備大量單克隆抗體為了在10-15天后能夠獲得含有抗體的腹水液，對(duì)已經(jīng)腹腔注射過0.5毫升鯊肝油烷的小鼠再腹腔注射克隆的雜交瘤。采用放射性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)，(見例3)，可以測(cè)定腹水液中抗體的活性。在培養(yǎng)懸液中測(cè)定抗ANP的活性將100微升培養(yǎng)懸液加至微滴定度平板上，平板上，一種牛血清清蛋白和人-α-ANP或大鼠artripeptinⅡ(5微克/毫升)的結(jié)合物已在室溫下吸附了3小時(shí)，然后用水洗滌5次。加入同過氧化物酶結(jié)合的免抗-鼠免疫球蛋白，然后在室溫下將平板保溫培養(yǎng)2小時(shí)。用蒸餾水洗滌5次后，加入一種對(duì)酶適合的底物，再采用適用于微滴定平板的分光光度法測(cè)定生成顏色產(chǎn)物的濃度。例2抗心房鈉尿肽單克隆抗體的定性單克隆抗體的類型分析本發(fā)明敘述的單克隆抗體分類及亞分類，從培養(yǎng)的上清液濃縮抗體，并采用硫酸銨(40%飽和)沉淀來部分進(jìn)行提純。采用專用于分類型的抗小鼠免疫球蛋白，抗血清進(jìn)行Ouchterlong凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，來確定免疫球蛋白的類型?？谷薃NP的單克隆抗體23M-D9屬于IgG1型。抗atriopeptinⅡ的單克隆抗體11A-A11也屬于IgG1型?？贵w同多種其它肽和激素的交叉反應(yīng)采用放射免疫結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)確定了抗人ANP的單克隆抗體同多種其它肽的交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)用一種特殊的實(shí)驗(yàn)緩沖液進(jìn)行(0.02M磷酸鈉，0.15氯化鈉，0.01%乙基汞硫代水楊酸鈉，0.1%明膠，0.01%牛血清清蛋白和0.1%曲拉通-X100，pH7.4)。在4℃，于合適的稀釋液中，將放射性標(biāo)記的碘125-α-人ANP(氨基酸1-28)，或大鼠的碘125-atriopeptinⅡ(AmershamBuch-ler)同抗體一起進(jìn)行保溫16-28小時(shí)?？傮w積為500微升。在進(jìn)行結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，在同樣體積條件下，實(shí)驗(yàn)混合液中還要加入不同濃度的非標(biāo)記抗原和多種抑制劑。保溫結(jié)束時(shí)，沒有同抗體結(jié)合的放射性標(biāo)記碘125-抗原(具有1-28氨基酸的人-α-ANP或大鼠的atriopeptinⅡ)可以通過加入活性炭懸液而被活性炭所吸附(0.2M磷酸鈉;2%樺木活性炭;0.02%葡聚糖60;0.1%牛血清清蛋白和10mM乙二胺四乙酸鈉，pH7.4)。然后，在冰中保溫20分鐘，3600g進(jìn)行離心10分鐘以沉降活性炭，測(cè)定上清液的放射活性。測(cè)定了多種肽的濃度，這些肽對(duì)于顯示出50%來自抗體的碘125-抗原是必要的。正如圖1和圖2所示，這些抗體同來源于人和大鼠的心房肽能夠十分特異地進(jìn)行反應(yīng)。沒有發(fā)現(xiàn)同包含于鹽-水平衡調(diào)節(jié)的介質(zhì)有交叉反應(yīng)。多種血管活性物質(zhì)也同樣失活(見表1和表2)。例3抗心房鈉尿肽單克隆抗體的應(yīng)用采用單克隆抗體測(cè)定生物液體和組織的ANP免疫活性采用放射免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)芏繙y(cè)定大量稀釋的抗原。這種實(shí)驗(yàn)需要特異性高的抗體和一種放射標(biāo)記抗原。放射活性標(biāo)記抗原同抗體的結(jié)合可以被非放射活性抗原以劑量依賴方式進(jìn)行抑制。如果不同濃度的非放射活性抗原同恒定濃度的抗體以及放射活性標(biāo)記的抗原一起保溫，采用這種方法則可以得到一條特征校準(zhǔn)曲線。圖1表示了這種類型的一條校準(zhǔn)曲線并顯示出采用不同atriopeptins或它們的衍生物，來自mAb23M-D9放射活性標(biāo)記抗原特異性(碘125-人-αANP，氨基酸1-28)。將抗體與放射活性抗原結(jié)合的百分比對(duì)非標(biāo)記抗原的濃度或其片段以8mol/ml進(jìn)行作圖。在本圖中-人-αANP符號(hào)(1-28)┅┅人-ANP片段符號(hào)(7-28)-ANP片段符號(hào)(18-28)如本文所敘，采用腹水，在最終稀釋濃度為1∶1，500，000的條件下，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用培養(yǎng)上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果，不過可采用的稀釋比例可以是500-1000或更低。實(shí)驗(yàn)清楚表明，ANP片段(18-28氨基酸)不能代替來源于抗體的放射活性標(biāo)記抗原。因此，抗體同這種片段沒有交叉反應(yīng)性。采用這種校準(zhǔn)曲線可以測(cè)出溶液中未知含量的抗原?；诖送馑鶖慰寺】贵w的放射免疫實(shí)驗(yàn)，以及用碘125-人-αANP(氨基酸1-28)作為示蹤物，則可以在濃度低至20pg/ml時(shí)仍可以在生物液體和組織提取物中進(jìn)行測(cè)定。這大約相當(dāng)于6fmol/ml數(shù)量。(見圖1)。圖2表明以同樣條件進(jìn)行的mAb11A-A11特異地與大鼠atr-iopeptin進(jìn)行反應(yīng)。在本圖中-□-atriopeptinⅠ符號(hào)-■-atriopeptinⅡ符號(hào)-△-atriopeptinⅢ符號(hào)-▲-ANP片段(13-28)給圖方式與圖1同。如本文所敘，用腹水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最終稀釋度為1∶1，250，000。利用培養(yǎng)上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果類似，但是可以采用的稀釋比例為500-1000或更低。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚表明，ANP片段(氨基酸13-28)不能代替來自抗體的放射性標(biāo)記抗原。因此，抗體和這種片段沒有交叉反應(yīng)。溶液中未知量的抗原可以利用校準(zhǔn)曲線來確定?；诒疚倪@里所敘述的單克隆抗體以及用碘125-atriopeptinⅢ作為示蹤物則使得有可能在生物體液和組織提取物中插測(cè)濃度可以低至20pg/ml，這大約相當(dāng)于6fmol/ml(見圖2)。除了這里所列出的放射免疫操作外，也可以利用所提到的這種單克隆抗體其他類型免疫實(shí)驗(yàn)(例如ELISA，化學(xué)發(fā)光，熒光)。例4大鼠atriopeptin體內(nèi)拮抗作用實(shí)驗(yàn)用雄性Wistar大鼠(體重240-270克)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前晚上開始禁食，但可以喂水。準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)在inaetin麻醉下進(jìn)行(100毫克/公升腹腔注射)。氣管切開后，腹腔注射1毫克/毫升阿托品，將一根塑料管插入股動(dòng)脈以測(cè)量血壓，一根塑料管插入頸靜脈以注射或輸入溶液，并且固定一根囊形管。當(dāng)準(zhǔn)備工作完成后，對(duì)大鼠注射5毫升/公斤0.9氯化鈉溶液，然后，在實(shí)驗(yàn)期間，輸入同樣的溶液(1.2毫升/小時(shí))。利用熱燈維持動(dòng)物直腸溫度在37℃±1℃。在1小時(shí)平衡后，用予先稱過重量的容器收集尿液，每10或20分鐘換一個(gè)容器。用火焰光度計(jì)測(cè)定尿中的鉀離子和鈉離子濃度。(實(shí)驗(yàn)儀器，Lixington，Mass/USA)。在1毫升0.9%氯化鈉抗體液體中含有100微升無菌過濾的腹水和0.1%牛血清清蛋白。注射的合成atriopeptinⅡ(Bachem提供)同樣溶在含有0.9%氯化鈉和0.1%牛血清清蛋白的水溶液中。在所有情況下，注射體積為1毫升/公斤體重。初步實(shí)驗(yàn)表明，以1毫升/公斤體重含有0.1%牛血清清蛋白的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行微丸注射，則對(duì)于尿體積和鈉排泄只有輕微影響。實(shí)驗(yàn)完成后，從每只大鼠取動(dòng)脈血樣品以檢查其酸堿性。在靜脈進(jìn)行微丸注射后，前10分鐘按每公斤10微克給動(dòng)物atriopeptinⅡ以增加尿和鈉排泄體積(見圖3和4)，導(dǎo)致在連續(xù)收集中，這種增加迅速變?yōu)闇p少，1小時(shí)后，再靜脈注射ANP每公斤10微克，則可以重新增加。在第二次注射ANP前5分鐘，微丸注入100微升/公斤體重含腹水的抗體(抗體11A-A11)，則幾乎可以完全抑制尿的體積和鈉的排泄。圖3和圖4表明了詳細(xì)的結(jié)果。以分表示的收集時(shí)間(收集期間)為縱坐標(biāo)，對(duì)以微升/分(圖3a和3b)表示的尿排泄量和以μM/分表示的鈉排泄量作圖。(圖4a和4b)。圖3a兩次微丸注入10微克/公斤atriopeptinⅡ(ANP)后尿的體積n＝4圖3b抗ANP的nAb對(duì)10微克/公斤atriopeptinⅡ的拮抗作用在第二次注射ANP5分鐘前，微丸注入含有腹水(Ab)的抗體100微升/公斤n＝4圖4a兩次微丸注入10微克/公斤atriopeptinⅡ(ANP)后，鈉的排泄n＝4圖4b抗ANP的mAb對(duì)20微克/公斤atriopeptinⅡ的拮抗作用在第二次注射ANP5分鐘前，微丸注入含有腹水(Ab)的抗體100微升/公斤，n＝4因此抗體在體內(nèi)拮抗atriopeptrinⅡ的鈉尿作用。表1mAb23M-D9同其他具有血管活性作用的內(nèi)源介質(zhì)或?qū)}-水平衡作用的交叉反應(yīng)研究物質(zhì)最大實(shí)驗(yàn)濃度交叉反應(yīng)(PM/ml)血管緊張素Ⅱ14-(人)leu-腦啡肽26-底物P10-醛固酮44-促腎上腺皮質(zhì)激素(豬)4-血管舒緩激肽13-μ-促黑激素10-胰島素(大鼠)3-后葉加壓素15-凝乳酶(豬)0.5-表2mAb11A-A11同其他具有血管活性的內(nèi)源介質(zhì)及同鹽-水平衡效應(yīng)交叉反應(yīng)的研究物質(zhì)最大實(shí)驗(yàn)濃度交叉反應(yīng)性(pmol/ml)血管緊張素Ⅱ14-(人)leu-腦啡肽26-底物P10-醛固酮44-促腎上腺及質(zhì)激素(豬)4-血管舒緩激肽13-μ-促黑激素10-胰島素(鼠)3-后葉加壓素15-凝乳酶(豬)0.5-權(quán)利要求1.單克隆抗體抗心房鈉尿肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1，單克隆抗體抗哺乳動(dòng)物的心房鈉尿肽。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2，單克隆抗體抗大鼠的心房鈉尿肽。4.根據(jù)權(quán)利要求1和2，單克隆抗體抗人的心房鈉尿肽。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4，雜交瘤系其特征是它們產(chǎn)生單克隆抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4，進(jìn)行制備單克隆抗體;根據(jù)權(quán)利要求5，其特征是雜交瘤系的被應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6，該過程特征是雜交瘤系培養(yǎng)在一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，并從上清液得到抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求6，該過程特征是對(duì)小鼠注射同源或半同源雜交瘤，而從血或腹腔滲出液中得到抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求5，進(jìn)行雜交瘤制備，其特征是骨髓瘤細(xì)胞同產(chǎn)生抗心房鈉尿肽抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合。10.根據(jù)權(quán)利要求9，該過程特征是免疫過的哺乳動(dòng)物抗心房鈉尿肽的脾細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合。11.根據(jù)權(quán)利要求9和10，該過程特征是免疫過的小鼠抗心房鈉尿肽脾細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合。12.根據(jù)權(quán)利要求9至11，該過程特征是小鼠骨髓瘤細(xì)胞被應(yīng)用。13.根據(jù)權(quán)利要求9至12，該過程特征是骨髓瘤細(xì)胞是非分分泌型的。14.根據(jù)權(quán)利要求9至13，該過程特征是采用同免疫載體相結(jié)合的心房鈉尿肽進(jìn)行免疫。15.根據(jù)權(quán)利要求9至14，該過程特征是免疫載體是一種蛋白質(zhì)。16.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體來測(cè)定生物體液的心房鈉尿肽。17.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體測(cè)定血液、血漿、血清、尿、淋巴液或腦脊液中的心房鈉尿肽。18.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。19.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體通過免疫吸附層析，來分離心房鈉尿肽。20.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。21.根據(jù)權(quán)利要求1-4，利用單克隆抗體進(jìn)行生理學(xué)和藥理學(xué)研究。專利摘要抗心房鈉尿肽的單克隆抗體是由保存號(hào)為850314/1和859314/2的雜交瘤系產(chǎn)生的。雜交瘤是通過同產(chǎn)生抗心房鈉尿肽抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合得到的。因此，這種抗體可以用于測(cè)定諸如血液、血漿、血清、尿、淋巴或腦脊髓液等生物樣品中的心房鈉尿肽水平。文檔編號(hào)C07K16/00GK86101671SQ86101671公開日1986年9月17日申請(qǐng)日期1986年3月15日發(fā)明者克勞迪婭·赫思,弗蘭克-喬基姆·莫里克,迪特爾·諾塞爾,約翰尼斯-彼得·斯塔殊申請(qǐng)人:拜爾公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan