專利名稱:用重組dna技術(shù)制備dna、rna、肽、多肽或蛋白質(zhì)的方法
本發(fā)明的目的是一種獲得DNA、RNA、肽、多肽或蛋白質(zhì)的程序，用含有能夠表達(dá)這些RNA、肽、多肽或蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，即利用重組DNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的在于以一種可以同時(shí)獲得的方式產(chǎn)生隨機(jī)基因或隨機(jī)基因碎片，這些基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯之后，大量(至少約為10，000)全新蛋白質(zhì)或與已知蛋白質(zhì)的雜化物在含有能夠表達(dá)這些蛋白質(zhì)的基因的宿主細(xì)胞(細(xì)菌或真核的)的存在下產(chǎn)生，并且為了確定它們中的哪一種產(chǎn)生具有新要求特性的蛋白質(zhì)，隨后在上述無(wú)性繁殖系中進(jìn)行篩選，其性質(zhì)有如結(jié)構(gòu)的，酶的、催化的、抗原的、藥理的或配體的特性，以及更一般的化學(xué)、生化、生物學(xué)等特性。其次本發(fā)明的目的在于通過修飾上述隨機(jī)因或其產(chǎn)物而改進(jìn)所要求的功能。
同樣，本發(fā)明的目的表明了獲得且隨之改進(jìn)具有可利用的顯著的化學(xué)、生化或生物學(xué)特性的DNA或RNA序列的方法。
因此，本發(fā)明顯然可供科學(xué)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)上的許多方面的大量應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，肽或多肽的制備方法的特征是它在同一培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生了至少部分是由合成隨機(jī)多聚核苷酸的構(gòu)成的基因，它將這樣獲得的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)了含有如此基因的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性系，因而無(wú)性繁殖了隨機(jī)基因并獲得了通過這些隨機(jī)基因的每一個(gè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它以鑒別那些產(chǎn)生了具有至少一種所要求特性的肽或多肽的無(wú)性系的方式選擇和/或篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞無(wú)性系，隨之將這樣鑒定出的無(wú)性系分離出來(lái)并培養(yǎng)之，使它們產(chǎn)生至少一種具有所述特性的肽或多肽。當(dāng)所要求特性需要改進(jìn)時(shí)，該方法包括對(duì)產(chǎn)生已確定肽的基因的修飾，繼之以上述基因的再次無(wú)性繁殖，并選擇或篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞以確定那些產(chǎn)生至少一種具有改進(jìn)功能的肽或多肽的細(xì)胞。它也包括蛋白質(zhì)生產(chǎn)物本身的修飾。
利用本技術(shù)的首要的方法為，通過四種脫氧磷酸核苷酸A、C、G和T從一個(gè)起始線性表達(dá)載體的兩端的隨機(jī)共聚產(chǎn)生隨機(jī)基因，隨后以這樣的方式合成粘性末端以便形成由一分子具有兩個(gè)3′末端是互補(bǔ)的隨機(jī)序列的表達(dá)載體所構(gòu)成的隨機(jī)起始單鏈DNA，隨之合成隨機(jī)DNA的副鏈。
利用本技術(shù)的另一方式為，通過沒有粘性末端的寡核苷酸的共聚產(chǎn)生隨機(jī)基因，采用合成隨機(jī)DNA碎片的方式，然后將這些碎片連到預(yù)先線性化的表達(dá)載體上。
表達(dá)載體可以是一個(gè)質(zhì)粒，顯著的是細(xì)菌質(zhì)粒。應(yīng)用pUC8質(zhì)粒作為表達(dá)載體已經(jīng)獲得了極好的結(jié)果。
表達(dá)載體也可以是病毒DNA或者質(zhì)粒與病毒DNA的雜化物。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如HB101和C600，或者是真核細(xì)胞。
當(dāng)應(yīng)用上述第二種方式的技術(shù)時(shí)，能夠利用形成了一組回文八聚體的寡核苷酸。
利用下述回文八聚體取得了極好的結(jié)果5′GGAATTCC 3′5′GGTCGACC 3′5′CAAGCTTG 3′5′CCATATGG 3′5′CATCGATG 3′還能夠應(yīng)用形成一組回文七聚體的寡核苷酸。
應(yīng)用下列回文七聚體取得了好結(jié)果5′XTCGCGA 3′
5′XCTGCAG 3′5′RGGTACC 3′此處X＝A、G、C或T、R＝A或T按照利用這些特別有利的技術(shù)的方法，可以從一轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性系培養(yǎng)物中分離并提純質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化DNA，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞按上述方法獲得，經(jīng)后用至少一種對(duì)應(yīng)于在回文八聚體或七聚體上所表現(xiàn)出來(lái)的而在所用表達(dá)載體上所沒有的特異限制切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶切割這些質(zhì)粒;切割后將限制性內(nèi)切酶鈍化，然后同時(shí)用T4DNA連接酶處理這樣獲得的線性隨機(jī)DNA碎片的群體，以這樣的方式得到了含有隨機(jī)序列的新的一套DNA，由此這個(gè)新群體含有比在起始群體中的基因數(shù)量更大的隨機(jī)基因量。然后用這批新的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并無(wú)性繁殖這些基因，最后選擇和(或)篩選并分離轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的新無(wú)性系并培養(yǎng)之以生產(chǎn)至少一種肽或多肽，例如，一種新型的具有所要求特性的蛋白質(zhì)。
任何其它的用以產(chǎn)生并無(wú)性繁殖隨機(jī)DNA序列以使其表達(dá)為新肽、多肽或蛋白質(zhì)，或表達(dá)為融合蛋白質(zhì)的新部分，繼之以篩選或?qū)ふ宜筇匦圆@得至少一種產(chǎn)生具有所要求特性的肽的無(wú)性系的方法，都能夠根據(jù)本發(fā)明而應(yīng)用。
作為選擇宿主細(xì)胞無(wú)性系標(biāo)準(zhǔn)的特性可為由給定無(wú)性系所產(chǎn)生的肽或多肽催化給定化學(xué)反應(yīng)的能力。
進(jìn)而，對(duì)于幾種肽和(或)多肽的生產(chǎn)來(lái)說，上述性質(zhì)可為催化一系列反應(yīng)的能力，這些反應(yīng)將一組起始化合物變成至少一種目標(biāo)化合物。
為了生產(chǎn)由幾種或許多種反身自催化的肽和(或)多肽所構(gòu)成的群體，上述特性可為在適宜環(huán)境中由氨基酸和(或)寡肽催化合成該群體的能力。
上述特性也可以是選擇性地修飾給定化合物的生物學(xué)或化學(xué)性質(zhì)的能力，例如，選擇性修飾一個(gè)多肽的催化活性的能力。
上述特性還可以是模擬、抑制、或修飾至少一種生物活性化合物的至少一種生物功能的能力，例如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、附著因子、生長(zhǎng)因子以及DNA復(fù)制和(或)轉(zhuǎn)錄和(或)RNA的轉(zhuǎn)譯的特異調(diào)節(jié)因子。
上述特性亦可為肽或多肽結(jié)合于一給定配體上的能力。
本發(fā)明的目的還在于，將通過上述技術(shù)得到的肽或多肽用于配體的檢測(cè)和(或)滴定的用法。
按照應(yīng)用的特別有利的方式，選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系的標(biāo)準(zhǔn)是這些肽或多肽模擬或改變一生物活性分子例如一種蛋白質(zhì)的作用的能力;產(chǎn)生至少一種具有如此特性的肽或多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系的篩選和(或)選擇通過制備或獲得對(duì)抗活性分子的抗體進(jìn)行，隨之在將它們提純之后利用這些抗體鑒別含有那些結(jié)合有上述對(duì)抗活性分子的抗體的肽或多肽的無(wú)性系，然后通過培養(yǎng)已經(jīng)鑒別了的無(wú)性系分離并提純由這些無(wú)性系所產(chǎn)生的肽或多肽，最后對(duì)肽或多肽進(jìn)行體外檢測(cè)，證實(shí)它具有模擬或修飾上述分子的作用的能力。隨機(jī)肽模擬或修飾上述分子作用的能力，能夠通過修飾給該肽編碼的基因，用修飾了的基因重新轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并對(duì)那些改進(jìn)了所要求功能的修飾進(jìn)行選擇或篩選而得到改善。此外，上述肽可被化學(xué)修飾，或誘導(dǎo)從而改善其功能。
根據(jù)這種方法應(yīng)用本發(fā)明的此項(xiàng)技術(shù)，作為選擇標(biāo)準(zhǔn)的特性是具有至少一種與給定抗原的抗原決定部位之一相似的抗原決定基的性質(zhì)。
本發(fā)明繼續(xù)下去可由前述方法得到多肽并用作化療活性物質(zhì)。
尤其在上述抗原是EGF的情況下，本發(fā)明可獲得用于上皮癌化療的多肽。
本發(fā)明還適用于應(yīng)用前述技術(shù)制備疫苗，其特征為分離抗致病作用的抗體，例如在給一能夠產(chǎn)生抗此作用物的抗體的動(dòng)物體內(nèi)注射進(jìn)致病作用物之后產(chǎn)生了抗體，這些抗體可用于鑒別產(chǎn)生至少一種最低限度具有類似于致病作用物抗原決定部位之一的抗原決定基蛋白質(zhì)的無(wú)性系，對(duì)應(yīng)于這些無(wú)性系的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)，從細(xì)胞無(wú)性系中分離純化該蛋白質(zhì)，然后用此蛋白質(zhì)制備抗致病作用物的疫苗。如上所述，純化了的蛋白質(zhì)可經(jīng)編碼該蛋白質(zhì)的隨機(jī)基因修飾(例如，致突變)而改進(jìn)，將這些基因再次轉(zhuǎn)化進(jìn)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)修飾蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，再次篩選或選擇那些將結(jié)合于抗起始抗原作用物的抗體的并具有改進(jìn)功能蛋白質(zhì)，并利用這些改良蛋白質(zhì)生產(chǎn)疫苗。
例如，為制備抗HVB疫苗，可提取并純化HVB病毒的至少一種衣殼蛋白，將該蛋白注射進(jìn)一種能夠產(chǎn)生抗這種蛋白質(zhì)的抗體的動(dòng)物體內(nèi)，回收并純化這樣形成的抗體，利用這些抗體去鑒別產(chǎn)生至少一種蛋白質(zhì)的無(wú)性系，該蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)類似于HVB病毒的抗原決定部位之一的抗原決定基，隨后培養(yǎng)在某種程度上與這些無(wú)性系相稱的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系以產(chǎn)生該種蛋白質(zhì)，從這些細(xì)胞的無(wú)性系培養(yǎng)基中分離并純化該蛋白質(zhì)并用它制備抗HVB疫苗。
根據(jù)這項(xiàng)技術(shù)的改變，通過用對(duì)應(yīng)于DNA雜化物天然部位所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗體的親和層析可鑒別并分離產(chǎn)生具有所要求特性的肽或多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系。
例如，在雜種DNA的天然部位含有一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的情況下，通過用β半乳糖苷酶抗體的親和層析技術(shù)可有利于鑒別并分離上述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系。
雜種肽或多肽的表達(dá)和純化后即可區(qū)分并分離它們的新部位。
根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)手段是篩選新的肽、多肽或催化一給定化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
根據(jù)利用本發(fā)明的技術(shù)的先進(jìn)手段，宿主細(xì)胞是大腸桿菌一類的細(xì)菌，其基因組既不含有表達(dá)β半乳糖苷酶的天然基因，也沒有EBG基因，也就是說是Z-，EBG-Ecoli。轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)于含有X半乳糖及指示劑IPTG的培養(yǎng)基中。并檢測(cè)到了對(duì)β半乳糖苷酶功能陽(yáng)性的細(xì)胞;隨后將轉(zhuǎn)化DNA移植于一適宜的宿主細(xì)胞無(wú)性系中以大規(guī)模培養(yǎng)之，從而產(chǎn)生至少一種具有β半乳糖苷酶活性的肽或多肽。
作為選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)的特性也可以是通過培養(yǎng)這些無(wú)性系而產(chǎn)生的肽或多肽結(jié)合給定化合物的能力。
該化合物優(yōu)先選自肽、多肽和蛋白質(zhì)中，特別是那些調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的還在于，具有那些在作為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系的選擇標(biāo)準(zhǔn)的特性是這些蛋白質(zhì)結(jié)合控制DNA轉(zhuǎn)錄活性或復(fù)制的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的能力的情況下獲得的蛋白質(zhì)。
另一方面，上述被結(jié)合的化合物也能從DNA和RNA序列中選出。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，獲得了一種能結(jié)合DNA序列的蛋白質(zhì)，該序列起控制鄰近DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)節(jié)的作用，并通過結(jié)合限制鄰近DNA序列的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。同樣，本發(fā)明的另一個(gè)目的是獲得一種可結(jié)合RNA序列的蛋白質(zhì)并因此控制了該RNA的轉(zhuǎn)譯作用或RNA的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的目的包括利用由前述第二種情況下得到的蛋白質(zhì)修飾含在細(xì)胞內(nèi)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制特性，并表達(dá)該蛋白質(zhì)。
作為其目的本發(fā)明亦表明了一種產(chǎn)生DNA的方法，其特征為在同一培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生，該基因至少部分由隨機(jī)合成多聚核苷酸構(gòu)成，如此獲得的基因被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞群體，對(duì)該群體進(jìn)行篩選和(或)選擇以鑒別那些含有DNA隨機(jī)序列的宿主細(xì)胞，其DNA具有至少一種所要求的特性，最后從如此鑒別的宿主細(xì)胞無(wú)性系中分離出DNA。被鑒別的DNA的特性可通過隨機(jī)基因的修飾而改善，例如通過各種已知的或?qū)⑾率龅闹峦蛔兗夹g(shù)，再克隆到適宜的載體上，轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞，隨即篩選或選擇出所要求特性的改進(jìn)水平。
本發(fā)明的目的還在于一種產(chǎn)生RNA的方法，特征是在同一培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生至少部分是由隨機(jī)合成多聚核苷酸所構(gòu)成的基因，該基因?qū)胨拗骷?xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞群體，這樣產(chǎn)生的宿主細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)，并篩選和(或)選擇這個(gè)群體以鑒別那些含有具備至少一種所要求特性的RNA序列，并從這樣鑒別了的宿主細(xì)胞中分離出RNA。如上所述，這樣分離的RNA特性可通過對(duì)應(yīng)隨機(jī)基團(tuán)的修飾、再轉(zhuǎn)化及再篩選或再選擇而得到改善。
上述特性可以是結(jié)合給定化合物的能力，該化合物可為諸如肽或多肽或蛋白質(zhì)，該特性也可為催化給定化學(xué)反應(yīng)的能力，或作為轉(zhuǎn)移RNA的能力。
首先，我們將描述極其有用的進(jìn)行隨機(jī)基因的合成以及將這些基因?qū)爰?xì)菌以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)菌的無(wú)性繁殖技術(shù)。
1)在一表達(dá)載體上的直接合成。
a)載體的線性化。
30mg，即大約1013pUC8表達(dá)載體分子通過在37℃下用100單位溶于300微升專為該酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的Pst1限制性內(nèi)切酶處理兩個(gè)小時(shí)而被線性化。線性化的載體用石炭酸-氯仿處理，然后在乙醇中沉淀，在標(biāo)準(zhǔn)TEB緩沖溶液中溶解為30μl體積并吸附于0.8%瓊脂糖凝膠上。在3v/cm范圍內(nèi)走柱三個(gè)小時(shí)后，線性載體被電洗脫，于乙醇中沉淀并溶于30微升水。
b)用末端轉(zhuǎn)移酶(Td T)的隨機(jī)合成30μg線性化載體與30單位的Td T于300μl適宜的緩沖液中反應(yīng)，緩沖液中有1mMd GPT，1mMd CTP，0.3m Md TTP及1mMd ATP。選擇低濃度d TTP是為了降低在單一的信使RNA中的“終止”密碼子的頻率。盡管稍微不順，但利用比其它脫氧三磷酸核苷酸低一些濃度的d ATP亦能取得類似的效果。在Pst1位點(diǎn)的3′末端上的共聚過程之后，將反應(yīng)過程中取出的等分試樣在凝膠上進(jìn)行分析。
當(dāng)反應(yīng)達(dá)到或超過每3′末端所加入的核苷酸平均值為300時(shí)停止反應(yīng)并用差式示沉淀法或者通過象生物凝膠P60一類的分子篩選柱將游離核苷酸與共聚物分離。在乙醇中沉淀濃縮之后，共聚物與Td T進(jìn)一步聚合，首先在有d ATP，隨后為d TTP存在的情況下進(jìn)行。最后這兩個(gè)反應(yīng)通過凝膠過濾分開并留有短的間隔(30秒到3分鐘)以連續(xù)加入10-30A繼之以10-30T于共聚物的3′末端。
c)隨機(jī)DNA副鏈的合成在上述反應(yīng)結(jié)束時(shí)每分子載體都具有兩個(gè)隨機(jī)序列，它們的3′末端是互補(bǔ)的。共聚物的混合體培養(yǎng)在有利于互補(bǔ)末端雜化的條件下，150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.6，1mM EDTA，65℃下10分鐘，隨后以每小時(shí)3-4℃的速度降至22℃。雜種聚合物隨后與60單位聚合酶Ⅰ大斷片(Klenow)在有四種三磷酸核苷酸(200mM)存在的情況下于4℃反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)。這一步驟完成了從雜種共聚物的3′末端合成副鏈。從線性載體開始的這步直接合成得到的分子隨后就用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
d)感受態(tài)無(wú)性系的轉(zhuǎn)化100-200ml濃度為1010細(xì)胞/ml的C600細(xì)胞的感受態(tài)HB101與隨機(jī)DNA制劑(取自上述)共同培養(yǎng)，條件為存在有6mM CaCl2，6mM Tris-HCl，pH8，6mM MgCl2，0℃，.30分鐘。對(duì)混合物施加一個(gè)37℃3分鐘的溫度沖擊，隨后加入400-800ml無(wú)抗菌素的NZY培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)60分鐘，然后加入含有40μg/ml的氨芐青霉素的NZY培養(yǎng)基稀釋至10立升。37℃培養(yǎng)3-5小時(shí)之后離心分離稀釋培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的片狀沉淀物凍干儲(chǔ)存于-70℃。這樣的一個(gè)培養(yǎng)物含有3×107-108獨(dú)立轉(zhuǎn)化株，每一個(gè)都含有一個(gè)獨(dú)特的嵌入表達(dá)載體的隨機(jī)基因。
Ⅱ)從沒有粘性末端的寡核苷酸起始的隨機(jī)基因合成。
這項(xiàng)技術(shù)建立在這樣事實(shí)的基礎(chǔ)上，明智地選擇了回文寡核苷酸的共聚化，使在六種可能的解讀密碼中的任意一個(gè)都沒有“終止”密碼子的隨機(jī)基因得以構(gòu)成，同時(shí)保證詳細(xì)說明了氨基酸的三聯(lián)體密碼的平衡表達(dá)。此外，為了避免序列主要部分在用少量的起始回文寡核苷酸時(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中的重復(fù)，寡核苷酸可含有若干堿基，但不超過三倍，下述實(shí)例描述了達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)的可能組合之一的用法。
a)八聚體組的選擇下列寡核苷酸群5′GGAATTCC 3′5′GGTCGACC 3′5′CAAGCTTG 3′5′CCATATGG 3′5′CATCGATG 3′由5組回文構(gòu)成(這樣自身互補(bǔ)序列為回文)，這里易于證明它們的隨機(jī)共聚作用沒有產(chǎn)生任何“終止”密碼子，并表達(dá)了所有的氨基酸。
顯然可以利用其它回文八聚體群，它不產(chǎn)生任何“終止”密碼子并表達(dá)了所有在多肽中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。顯然也可能利用非回文八聚體群或其它寡聚物，條件是，也用了它們的形成雙鏈DNA的互補(bǔ)體。而且可能使用多于5種的回文八聚體。
b)從一組八聚體中集合隨機(jī)基因群體一種含有前述寡核苷酸每一種各5μg的混合物(先用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在5′位上磷酸化寡核苷酸)在100μl含有1mMATP，10%聚乙二醇，及100單位TDNA連接酶在適宜的緩沖液中于13℃反應(yīng)6小時(shí)。這一步將八聚體隨機(jī)聚合成雙鏈狀態(tài)而沒有粘性末端。聚合產(chǎn)物過分子篩(生物凝膠P60)分離回收20-100寡聚體。濃縮后該部分在上述條件下再用TDNA連接酶催化聚合。然后如上所述那些至少集合有100寡聚物的共聚體被分離出來(lái)。
c)宿主質(zhì)粒的制備
PUC8表達(dá)載體用Smal酶于適宜的緩沖液中線性化，按上述方法進(jìn)行。SMal線性化的載體沒有粘性末端。因此線性載體用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)于每毫克載體一單位的水平在適宜的緩沖液中37℃處理30分鐘。CIP隨后用石炭酸-氯仿連續(xù)兩次萃取的方法鈍化。線性脫磷酸載體在乙醇中沉淀，然后在水中重新溶解為1mg/ml。
d)隨機(jī)基因與載體的連接等摩爾量的載體和聚合物混合并在有1000單位T4DNA連接酶，1mMATP、10%聚乙二醇存在的情況下于適當(dāng)緩沖液中13℃下培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。這一步驟將隨機(jī)共聚物連接于表達(dá)載體上并形成雙鏈環(huán)狀分子，因此它可進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
感受態(tài)無(wú)性系的轉(zhuǎn)化。
感受態(tài)無(wú)性系的轉(zhuǎn)化按前述方式進(jìn)行。
Ⅲ)從一組七聚體開始的隨機(jī)基因的裝配。
這步程序與剛討論過的不同，不同點(diǎn)在于利用具有可變粘性末端的回文七聚體取代了八聚體。這步程序具有能裝配含有少量同源主要部分的隨機(jī)序列的優(yōu)點(diǎn)。
a)七聚群體的選擇如例，能用下述三種回文七聚體5′XTCGCGA 3′5′XCTGCAG 3′5′RGGTACC 3′這里，X＝A、G、C或T，R＝A或T，這里共聚化不能產(chǎn)生任何“終止”密碼子并形成代表所有氨基酸的三聯(lián)體密碼。
顯然，可用滿足這些同樣條件的七聚體的其它群體。
b)一組七聚體的聚合這步驟合作用與前述八聚體的方式完全相同。
c)粘性末端的消除這樣得到的共聚物在其兩個(gè)5′末端上有一不成對(duì)堿基。因此必須在單一的3′末端加上互補(bǔ)堿基。這一步驟如下進(jìn)行10mg雙鏈共聚物在有100μl體積的脫氧磷酸核苷酸(200mM)存在的情況下于4℃與10單位Klenow酶反應(yīng)60分鐘。酶用石炭酸氯仿提取法滅活，共聚物用差示沉淀法凈化剩余的游離核苷酸。然后將共聚物按前述方法連接于宿主質(zhì)粒(先已線性化及脫磷酸化過的)。
應(yīng)該注意的是后兩種已描述過了的方法利用了構(gòu)成某種限制內(nèi)切酶特異位點(diǎn)的回文八聚體或七聚體。這些位點(diǎn)在很大程度上是pUC8表達(dá)載體所沒有的。因此，按照下述方法，有可能相當(dāng)大地增加隨基基因起始制備的復(fù)雜性分離由107獨(dú)立轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)中得到的質(zhì)粒DNA，而該轉(zhuǎn)化株是按上述最后兩種方法之一獲得的。該DNA純化后，用Clal限制性內(nèi)切酶(方法Ⅱ)或Pst1限制性內(nèi)切酶(方法Ⅲ)部分酶解。酶滅活后，部分酶解DNA用T4DNA連接酶處理，這樣產(chǎn)生了極大量的新序列，同時(shí)保持了起始序列的基本特性。隨后這個(gè)新的隨機(jī)序列的群體就可用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
另外，通過方法Ⅱ和Ⅲ克隆化的隨機(jī)基因利用屬于克隆載體的內(nèi)切位點(diǎn)從pUC8表達(dá)載體上完整地切割下來(lái)并且不在隨機(jī)DNA序列中表現(xiàn)出來(lái)。
通過上述兩種方法產(chǎn)生的隨機(jī)基因內(nèi)的重組，由于其周期發(fā)生的分子主體導(dǎo)致了體內(nèi)同源性，因而，是一種重要的實(shí)現(xiàn)編碼序列的體內(nèi)致突變的附加方法。這樣就導(dǎo)致了能被檢測(cè)的新基因數(shù)量的擴(kuò)大。
最后，對(duì)于所有產(chǎn)生新合成基因的方法來(lái)說，可用一些普通的技術(shù)在體內(nèi)或體外修飾基因，例如解讀密碼的改變，相對(duì)于其啟動(dòng)子的序列的倒位，點(diǎn)突變，或利用宿主細(xì)胞表達(dá)一種或幾種抑制子tRNA。
考慮到上面的描述，顯然能在體外合成極大量的(例如多于十億)不同的基因，通過核苷酸或寡核苷酸的酶促聚合作用實(shí)現(xiàn)。這步驟可以隨機(jī)方式進(jìn)行，即由反應(yīng)混合物中的核苷酸或寡核苷酸的各自濃度所決定。
如上所述，可用兩種方法克隆化這樣的基因(或編碼序列)共聚作用可直接于一克隆表達(dá)載體上進(jìn)行，該載體已預(yù)先線性化了;或先連續(xù)進(jìn)行聚合，隨后將聚合物與表達(dá)載體相連接。
在這兩種情況下，下一步驟是感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞(或培養(yǎng)的細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這一步包括在活細(xì)胞中克隆繁殖隨機(jī)基因，并使之非限定性地增殖和表達(dá)。
顯然，除了上述方法之外，用所有其他適宜的方法合成隨機(jī)序列是可行的。尤其能用生化的手段將得自化學(xué)合成的DNA或RNA單鏈寡聚物聚合，隨后用確定的技術(shù)處理DNA或RNA的這些片段產(chǎn)生雙鏈DNA(cDNA)，以便克隆這樣的基因。
轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系的篩選本發(fā)明方法的最后一步是通過選擇或篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其目的為分離一至數(shù)種這樣的細(xì)胞，即其轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的DNA導(dǎo)致具有所要求特性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)或轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的合成。這些特性可為諸如酶促的、功能的，或結(jié)構(gòu)的特性。
根據(jù)本發(fā)明，該技術(shù)的最重要的方面之一是能同時(shí)篩選或選擇一種可利用的產(chǎn)物(RNA或蛋白質(zhì))及產(chǎn)生該產(chǎn)物的基因。此外，前述合成并克隆化的DNA可為完全分離具有可利用生化特性的形成產(chǎn)物的DNA序列而被選擇或篩選。
現(xiàn)在我們將舉非限定性的實(shí)例說明對(duì)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞無(wú)性系選擇或篩選的最佳方法，因而從工業(yè)或醫(yī)學(xué)應(yīng)用的角度看，新型蛋白質(zhì)是有意義的。
這些方法之一建立在這樣的想法上，通過已確定的技術(shù)產(chǎn)生或獲得的多克隆或單克隆抗體直接抗蛋白質(zhì)或其它類型的生化或醫(yī)學(xué)分子，此處該分子是或已經(jīng)是提取的、致免疫的，隨后用這些抗體作為探針從大量的用隨機(jī)基因轉(zhuǎn)化的無(wú)性系中鑒別那些其蛋白與這些抗體反應(yīng)的無(wú)性系。這步反應(yīng)是存在于隨機(jī)基因合成的多肽與起始分子之間的結(jié)構(gòu)(抗原決定部位)同源的結(jié)果。用這種方法能夠分離若干具有類似于起始分子上的抗原決定部位或抗原決定因子的分子特征的新型蛋白質(zhì)。這樣的新型蛋白質(zhì)是模擬、刺激、調(diào)節(jié)、或限定起始分子作用的侯補(bǔ)者。顯然這種選擇或篩選手段具有非常多的制藥和生物醫(yī)學(xué)用途。如上所述，按具有類似于起始分子的抗原決定部位鑒定的肽可通過修飾為上述鑒定了的蛋白質(zhì)或肽編碼的隨機(jī)基因，繼之以用已知方法再克隆和再篩選或誘導(dǎo)那些肽本身而被改良。
下面我們?cè)诰唧w情況下舉非限定性實(shí)例說明這項(xiàng)操作的第一種方式EGF，(表皮生長(zhǎng)因子)是存在于血液中的小蛋白質(zhì)，其作用為刺激表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。這個(gè)效果是由EGF與位于表皮細(xì)胞膜上的特異受體的相互作用而得到的。通過給動(dòng)物注射結(jié)合于以增強(qiáng)EGF的免疫原性的KLH(銅孔
血青蛋白)的EGF，制備直接抗EGF的抗體。純化免疫動(dòng)物的抗-EGF抗體，用諸如過親和層析柱的方法，這里的配體是EGF或相當(dāng)于EGF碎片的合成肽。純化了的抗EGF抗體隨之作為探針篩選大量的溶于氯仿的細(xì)菌無(wú)性系，在固體支持器上進(jìn)行?？笶GF抗體結(jié)合那些類似起始抗原的抗原決定部位的隨機(jī)肽或蛋白質(zhì)。含有這種肽或蛋白質(zhì)的無(wú)性系在與放射性蛋白質(zhì)A固體支柱培養(yǎng)或與一放射性抗抗體抗體培養(yǎng)之后用射線自顯影術(shù)顯示出來(lái)。
這些步驟鑒別那些每一種都含有一種與篩選抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)(或其基因)的無(wú)性系。在大量細(xì)菌細(xì)胞或病毒噬菌斑(例如總數(shù)約為1，000，000)菌落中進(jìn)行篩選是可行的且可檢測(cè)出數(shù)量約為1毫微克的極少量的蛋白產(chǎn)物。隨后培養(yǎng)已經(jīng)鑒定了的無(wú)性系，這樣檢出的蛋白質(zhì)用常規(guī)方法純化。這些蛋白質(zhì)在上皮細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行體外檢驗(yàn)以確定它們是否抑制、模擬或調(diào)節(jié)這些培養(yǎng)中的EGF的作用。在這樣獲得的蛋白質(zhì)中，有些可被用于上皮細(xì)胞癌的化療中。這樣獲得的蛋白質(zhì)的活性能夠通過用類似上述方法或?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)衍生的方法，使為蛋白質(zhì)編碼的DNA突變而得到改善。
本方法的改進(jìn)型是純化這些隨機(jī)肽、多肽或蛋白質(zhì)，它們具有抗原決定部位或使它們被抗某些抗原例如一種病原體抗原的抗體所結(jié)合的分子特征，隨后用已鑒定的肽作為疫苗或更一般地利用它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生抗致病作用物的免疫性或產(chǎn)生其他作用，例如產(chǎn)生耐受性或特別是由于這些肽、多肽或蛋白質(zhì)與直接抗該抗原的抗體結(jié)合而降低對(duì)應(yīng)于給定抗原的過敏性。顯然可在體外及體內(nèi)使用該肽、多肽或蛋白質(zhì)。
更準(zhǔn)確地說，在與抗給定抗原X的抗體反應(yīng)的新型蛋白質(zhì)的群體中，每一個(gè)都具有至少一個(gè)與X相同的抗原決定基，所以該群體具有一個(gè)與X相同的抗原決定基群體。它使該群體或亞群可用作疫苗產(chǎn)生抗X的免疫性。例如易于純化一或幾種乙型肝炎病毒的衣殼蛋白。將這些蛋白注射進(jìn)兔子一類的動(dòng)物體內(nèi)，可用親和柱純化法回收對(duì)于起始抗原的抗體。如上所述，這些抗體可用于鑒定產(chǎn)生至少一種蛋白質(zhì)的無(wú)性系，該蛋白質(zhì)具有類似于起始抗原的至少一種抗原決定部位的抗原決定基。純化后，這些蛋白可(單獨(dú)或聯(lián)合)作為抗原以產(chǎn)生抗乙型肝炎的保護(hù)作用。疫苗的最終產(chǎn)物不需要進(jìn)一步接觸起始致病作用物。它不要求由乙肝病毒得到的起始抗原是蛋白質(zhì)抗原，而寧愿它們能包括多糖或其他抗原決定因子。此外，在有利的情況下，不需要接觸起始病原體，而將抗由與病原體接觸的動(dòng)物或人體產(chǎn)生的病原體的高效價(jià)循環(huán)抗體作為起始步驟篩選被那些高效價(jià)抗體所結(jié)合的肽。這樣的高效價(jià)循環(huán)抗體可達(dá)到所有循環(huán)抗體的1%-10%，因此，已確定的隨機(jī)肽的1%-10%作為交叉反應(yīng)將具有類似(可能未知的)病原體的抗原決定因子。該確定了的交叉反應(yīng)肽混合物可作疫苗。與高效價(jià)抗體分子交叉反應(yīng)的肽的亞型或可通過篩選與血清交叉反應(yīng)肽的集合體以及鑒別那些對(duì)于它們?cè)谘逯写嬖诟咚窖h(huán)抗體的肽而被選擇出來(lái)。這個(gè)篩選出的交叉反應(yīng)肽的集合體可隨之用于生產(chǎn)免疫性的疫苗，或作為具有其他免疫修飾作用的物質(zhì)。
在上述方法的描述中注意到，已經(jīng)描述了一些選擇和篩選的方法。所有這些方法可要求從一轉(zhuǎn)化無(wú)性系中提純一種特定的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的提純可通過已知方法以及利用特別是凝膠層析，離子交換，以及親和層析技術(shù)而進(jìn)行。另外，由隨機(jī)基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)已能以雜種蛋白質(zhì)的形式無(wú)性繁殖，該蛋白質(zhì)具有象β半乳糖苷酶的序列，該酶允許抗抗β半乳糖苷酶抗體的親和層析，以及隨后的雜種部位的分解(即允許雜種蛋白的新部位與細(xì)菌部位的分離)。
下面我們敘述根據(jù)建立在檢測(cè)這些肽或多肽催化特定反應(yīng)的能力的基礎(chǔ)上的輔助篩選方法篩選肽或多肽及相應(yīng)的基因的原理和技術(shù)。
作為一個(gè)具體的和非限定性的例子，我們將描述在一特定的能夠催化乳糖分解，通常為β半乳糖苷酶進(jìn)行的功能的蛋白質(zhì)的情況下的篩選。
如上所述，程序的第一步是產(chǎn)生表達(dá)載體的大群體，其中每個(gè)載體均能表達(dá)一個(gè)獨(dú)特的新型的蛋白質(zhì)。例如，具體地說，選擇pUC8表達(dá)載體于Pst1限制優(yōu)點(diǎn)克隆DNA的隨機(jī)序列。這樣獲得的質(zhì)粒隨之導(dǎo)入-E.coli無(wú)性系中，其基因組中的β半乳糖苷酶、Z的天然基因以及與前者無(wú)關(guān)但能突變成β-半乳糖苷酶的輔助基因EBG均已被消除。這樣的宿主細(xì)胞(Z-，EBG-)不能自己水解乳糖。并因此利用乳糖作為生長(zhǎng)的碳源。這樣就可用這個(gè)宿主無(wú)性系篩選β-半乳糖苷酶功能。
一種簡(jiǎn)便的用于分析那些具有新的表達(dá)β半乳糖苷酶功能基因的轉(zhuǎn)化E.coli的生物學(xué)檢驗(yàn)法是將上述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)在含有X-半乳糖的培養(yǎng)基中。在這種情況下，所有表達(dá)了β半乳糖苷酶功能的細(xì)菌菌落都可見到是呈藍(lán)色的菌落。用這樣一種生物檢驗(yàn)法能測(cè)得甚弱的催化活性。這種酶的特異活性范圍在每秒鐘10-10，000個(gè)產(chǎn)物分子。
假設(shè)一個(gè)由一個(gè)隨機(jī)基因合成的蛋白質(zhì)有微弱的特異活性，水平約為每100秒1分子，這樣的催化活性仍能被檢出。培養(yǎng)基中含有X-半乳糖的培養(yǎng)皿中，在有不能產(chǎn)生代謝變化的誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)存在的情況下，出現(xiàn)一個(gè)藍(lán)色區(qū)域要求大約每平方毫米分解1010-1011個(gè)X半乳糖分子。一個(gè)表達(dá)了一個(gè)弱酶且占據(jù)了1mm2的表面區(qū)域的細(xì)菌菌落有約107-108個(gè)細(xì)胞。如果每個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)弱酶復(fù)制品，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)需要催化分解10，000-100個(gè)X半乳糖去被檢測(cè)，這就要求2.7-270個(gè)小時(shí)。因?yàn)楹Y選能將每個(gè)細(xì)胞的每一質(zhì)粒的復(fù)制品的數(shù)量增加到每個(gè)細(xì)胞有5-20個(gè)復(fù)制品，甚至達(dá)到100或1000個(gè)，而且因?yàn)橄喈?dāng)于10%的細(xì)胞蛋白質(zhì)可被新基因表達(dá)，在每個(gè)細(xì)胞有100個(gè)酶分子的微弱活性的情況下檢驗(yàn)菌落變藍(lán)所需的時(shí)間約為0.27-2.7個(gè)小時(shí)。
作為這些事實(shí)的結(jié)果，篩選大量獨(dú)立的每一個(gè)都表達(dá)不同的新基因的細(xì)菌菌落，并利用表達(dá)β半乳糖苷酶作用的能力作為選擇的標(biāo)準(zhǔn)是完全可行的。在一個(gè)直徑為10cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行大約2000個(gè)菌落的篩選是可能的。因此，可在一大片1平方米的X半乳糖瓊脂培養(yǎng)基上篩選大約20，000，000個(gè)菌落。
需要嚴(yán)重關(guān)切的是在X半乳糖培養(yǎng)皿上顯示藍(lán)色的細(xì)菌落可能是假的陽(yáng)性，因?yàn)樵诩?xì)菌產(chǎn)生代謝乳糖能力的基因組中發(fā)生了突變，或者只是因?yàn)槟切┢鹨蛴诰浼?xì)胞所表達(dá)的新蛋白質(zhì)的催化活性。這樣的假陽(yáng)性可直接用從陽(yáng)性菌落上純化表達(dá)載體DNA并重新轉(zhuǎn)化Z-，EBG-E.coli宿主細(xì)胞的方法除去。如果β半乳糖苷酶活性是由于被表達(dá)載體中的新基因編碼的新蛋白質(zhì)，則所有那些被該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞都將表現(xiàn)β半乳糖苷酶作用。相反，如果起始的藍(lán)菌落是由于宿主細(xì)胞基因組中的突變，則為罕有的事件并與轉(zhuǎn)化無(wú)關(guān)，這樣能夠表現(xiàn)β半乳糖苷酶功能的轉(zhuǎn)化Ecoli新無(wú)性系細(xì)胞的數(shù)量將很小或零。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)從所有陽(yáng)性無(wú)性系(藍(lán)色的)中批量同時(shí)純化所有表達(dá)載體隨后重新轉(zhuǎn)化天然細(xì)菌的能力。假設(shè)目的是進(jìn)行篩選以選出具有催化功能的蛋白質(zhì)，以及一種新的肽或多肽至少微弱地表現(xiàn)出這個(gè)功能的概率是10-6，同時(shí)Ecoli細(xì)菌宿主無(wú)性系發(fā)生突變，使它能表現(xiàn)出同樣功能的概率是10-5，隨后預(yù)測(cè)出從篩選出的20，000，000轉(zhuǎn)化細(xì)菌中，20個(gè)陽(yáng)性無(wú)性系可歸因于表達(dá)載體所攜帶的新基因，另200個(gè)陽(yáng)性無(wú)性系將是基因組突變的結(jié)果。從所有220個(gè)陽(yáng)性細(xì)菌無(wú)性系中大量純化表達(dá)載體繼之以用這些表達(dá)載體混合物重轉(zhuǎn)化天然細(xì)菌將產(chǎn)生大量的陽(yáng)性無(wú)性系，該無(wú)性系由所有那些用20個(gè)為具有所要求功能的新蛋白質(zhì)編碼的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，以及極少量的由基因組突變所引起的且含有200個(gè)無(wú)意義的表達(dá)載體的細(xì)菌無(wú)性系所組成。從陽(yáng)性細(xì)菌菌落中純化表達(dá)載體的幾個(gè)周期，繼之以這樣的重轉(zhuǎn)化，使得非常少的對(duì)于所要求的催化活性為真正陽(yáng)性的表達(dá)載體得以檢出，盡管對(duì)于同樣的功能在宿主細(xì)胞中有高背景比例的突變。
在這類篩選操作之后，可用已確立的技術(shù)純化新蛋白質(zhì)。大量的這種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)由實(shí)用蛋白質(zhì)的鑒別以及同時(shí)的為同樣的蛋白質(zhì)編碼的基因的鑒別一起進(jìn)行的事實(shí)所構(gòu)成。結(jié)果，或者使用相同的表達(dá)載體，或者將新基因移植于一個(gè)更適宜的表達(dá)載體中以大量合成和分離。
將這種篩選的方法用于任意酶促的作用是可行的，對(duì)于該作用有一適宜的生物學(xué)檢驗(yàn)法。對(duì)于這種篩選，所要求的酶促功能對(duì)宿主細(xì)胞不必是實(shí)用的。不但對(duì)于酶促功能，而且對(duì)于其它任何所要求的能建立一種適宜的生物學(xué)檢驗(yàn)法的特性都能進(jìn)行篩選。此外，甚至在于-X-gal培養(yǎng)皿上所顯示的β半乳糖苷酶功能這樣簡(jiǎn)單的情況下，在100，000，000甚或1，000，000，000新基因的數(shù)量級(jí)上對(duì)其催化活性或其它所要求特性進(jìn)行篩選是可行的。
轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇。
另一方面，選擇技術(shù)能夠用于任意特性，催化的或其它的，這里特性的存在與否可理解為含有為新基團(tuán)編碼的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞生存的要素，或亦可用于選擇那些編碼和表達(dá)所要求新基因的病毒。作為一個(gè)非限制性的但具體的例子，β半乳糖苷酶功能的選擇將被描述。一個(gè)適宜的Z-，EBG-E.coli無(wú)性系不能以乳糖為唯一碳源而生長(zhǎng)。因此，在進(jìn)行了上述第一步驟之后，能夠在選擇的情況下，或者逐漸減少其它碳源，或者從一開始就只用乳酸培養(yǎng)極大量的被為新基因編碼的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在這樣選擇的過程中，通過重組或直接回收表達(dá)載體在體內(nèi)致突變，以及在體外用各種誘變劑或其它任何常見技術(shù)使其新基因致突變，在執(zhí)行所要求的催化功能的能力上有適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。象在這種情況下，當(dāng)選擇技術(shù)和簡(jiǎn)便的生物檢測(cè)技術(shù)同時(shí)存在時(shí)，開始可用選擇技術(shù)豐富顯示β半乳糖苷酶作用的宿主細(xì)菌的表現(xiàn)，隨后在培養(yǎng)皿上對(duì)X-gal培養(yǎng)基進(jìn)行篩選從而高效率地證實(shí)哪些是陽(yáng)性細(xì)胞。在沒有方便的生物檢測(cè)的情況下，應(yīng)用逐漸嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪x擇是最容易的純化一種或少量獨(dú)特的宿主細(xì)胞的方法，這些細(xì)胞的表達(dá)載體為催化所要求反應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼。
應(yīng)用這些技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)具有多種多樣結(jié)構(gòu)及除催化一種特定反應(yīng)的能力以外的功能特征的新型蛋白質(zhì)。例如，能夠?qū)υ贒NA上結(jié)合順式調(diào)節(jié)位點(diǎn)并因此抑制宿主細(xì)胞功能之一的表達(dá)或阻斷DNA的轉(zhuǎn)錄，刺激轉(zhuǎn)錄等的新型蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。
例如，就E.coli而言，一個(gè)乳糖操縱子(i-)阻遏物中的無(wú)性突變體顯示了β半乳糖苷酶功能，基本上是由于乳糖操縱基因不被抑制。這個(gè)類型的所有細(xì)胞在含有X-gal培養(yǎng)皿上產(chǎn)生藍(lán)色無(wú)性系。能夠用合成新型蛋白質(zhì)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化這類宿主細(xì)胞，并在X-gal培養(yǎng)皿上進(jìn)行篩選以檢測(cè)那些不是藍(lán)色的無(wú)性系。其中的一些表現(xiàn)了新蛋白質(zhì)結(jié)合了乳糖操縱基因并表達(dá)了β半乳糖苷酶的合成的情況。隨后進(jìn)行大量分離這樣的質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化，i-宿主分離那些不產(chǎn)生β半乳糖苷酶的無(wú)性系，然后進(jìn)行詳細(xì)的鑒定。
如上所述，這種方法可用于產(chǎn)生然后完全分離可利用蛋白質(zhì)，而且包括RNA和DNA作為具有可利用特性的產(chǎn)物。這一方面起因于該方法是產(chǎn)生可與其它分子或生化組分直接作用的DNA隨機(jī)序列，另一方面，這些在表達(dá)載體中克隆化的序列被轉(zhuǎn)錄成它們本身能進(jìn)行多重生化作用的RNA。
本方法用于產(chǎn)生和選擇實(shí)用DNA的實(shí)例。
本實(shí)例說明了對(duì)實(shí)用DNA的選擇，以及結(jié)合于DNA的調(diào)節(jié)蛋白的純化及其作用機(jī)制的研究?？紤]雌二醇受體，一種用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)的制備。在有雌二醇，一種固醇類性激素，存在的情況下，受體改變構(gòu)象并緊緊地結(jié)合在基因組DNA中某些特異序列上，從而影響與性別分化有關(guān)的并控制生育力的基因的轉(zhuǎn)錄。通過培養(yǎng)含有雌二醇，它的受體以及大量不同的嵌入其載體的隨機(jī)DNA序列的混合物，隨后在硝化纖維膜上過濾混合物，直接選擇那些結(jié)合在雌激素受體復(fù)合物上的隨機(jī)DNA序列，這里，只有那些被蛋白結(jié)合的DNA才能被膜擋住。沖洗和洗脫之后，從膜上釋放出的DNA被用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。轉(zhuǎn)化細(xì)菌培養(yǎng)后，它們所含有的載體被再次純化并培養(yǎng)幾個(gè)周期，按上述方法進(jìn)行過濾和轉(zhuǎn)化。這些方法分離了對(duì)雌二醇受體復(fù)合物具有更高親和性的DNA隨機(jī)序列。這樣的序列對(duì)許多診斷學(xué)和藥物學(xué)的應(yīng)用，特別是用于檢驗(yàn)用于繁殖力的控制和不育的治療上的合成雌激素而開放。
實(shí)用RNA的產(chǎn)生和選擇假設(shè)有大量的按已述方法產(chǎn)生并于一表達(dá)載體內(nèi)并克隆化的隨機(jī)DNA序列。結(jié)果是從這些序列在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的RNA可為完全實(shí)用的產(chǎn)物。作為一個(gè)非限制性例子，能夠按下述方法選擇一個(gè)為抑制基因轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)編碼的隨機(jī)基因大量(＞108)的隨機(jī)序列轉(zhuǎn)化到在精氨酸E.基因(arg E.gene)上有一“nonsense”突變的感受態(tài)細(xì)菌宿主。這些轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌平板培養(yǎng)在沒有精氨酸而有對(duì)該質(zhì)粒選擇性的抗菌素(如果載體是pUC8為氨芐青霉素)的基本培養(yǎng)基上。只有那些已經(jīng)變成能合成精氨酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能夠生長(zhǎng)。這個(gè)表現(xiàn)型既可由一宿主基因組的回復(fù)突變，又可由于細(xì)胞中的抑制基因tRNA的存在而引起。易于檢測(cè)每一轉(zhuǎn)化菌落以確定arg+表現(xiàn)是否由于在其載體中存在隨機(jī)基因;它滿足了純化該菌落質(zhì)粒并證實(shí)它在所有它所轉(zhuǎn)化的arg E細(xì)胞上產(chǎn)生了Arg+表現(xiàn)型的需要。
能夠催化一系列反應(yīng)的蛋白質(zhì)的選擇。
下面我們介紹另一種對(duì)獨(dú)立應(yīng)用開放，建立在同時(shí)平行選擇一定量能夠催化一系列相關(guān)反應(yīng)的新蛋白質(zhì)的原理基礎(chǔ)上的選擇方法。
本方法的基本設(shè)想如下給定一起始系列的化合物作為建筑積木或建筑成分，由此有望通過一系列催化的化學(xué)反應(yīng)合成一或數(shù)種所要求的化合物，有極多的反應(yīng)途徑可以部分或全部互相替換，并且在熱力學(xué)上全都是可能的，它們將建筑積木構(gòu)成所要求的目標(biāo)化合物。如果至少一個(gè)將建筑積木化合物構(gòu)成目標(biāo)化合物的反應(yīng)途徑的每一步由每個(gè)都是催化的反應(yīng)所組成的話，高效合成目標(biāo)化合物是有利的。另一方面，在許多獨(dú)立的或部分獨(dú)立的反應(yīng)途徑中它是否被催化相對(duì)來(lái)說不是很重要的。在前述方法中，我們已經(jīng)說明了如何能得到大量的每一個(gè)都表達(dá)一個(gè)獨(dú)特的新型蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。
這些新型蛋白質(zhì)的每一個(gè)都是催化所有可能將建筑積木群體構(gòu)成目標(biāo)化合物的反應(yīng)集合體中的某個(gè)可能反應(yīng)的候補(bǔ)者。如果足夠大量的隨機(jī)蛋白質(zhì)存在于含有建筑積木化合物的反應(yīng)混合物中，以致于足夠大量的可能的反應(yīng)被催化，則一系列關(guān)聯(lián)的將建筑積木化合物的集合體構(gòu)成目標(biāo)化合物的反應(yīng)將被新蛋白質(zhì)的亞群所催化就是高概率的了。顯然這種方法可被擴(kuò)展到同時(shí)催化不只是一種，而是幾種目標(biāo)化合物。
根據(jù)這個(gè)原理，為了同時(shí)選擇一套催化一系列所要求的化學(xué)反應(yīng)，如下所述那樣進(jìn)行是可能的。
1.選定構(gòu)成建筑積木化合物所要求的集合體，優(yōu)先利用適當(dāng)量的獨(dú)特化學(xué)物質(zhì)以增加有可能同時(shí)發(fā)生的導(dǎo)向所要求的目標(biāo)化合物的反應(yīng)數(shù)量。
2.用適當(dāng)體積的反應(yīng)介質(zhì)，加入大量的從合成它們的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離出的新的隨機(jī)蛋白質(zhì)。進(jìn)行檢驗(yàn)以確定是否已形成了目標(biāo)化合物。如果是的話，進(jìn)一步確定這步形成要求有新蛋白質(zhì)的混合物參與。如果是這樣的話，則混合物應(yīng)該含有一個(gè)催化一個(gè)或幾個(gè)將建筑積木集合體構(gòu)成目標(biāo)化合物的反應(yīng)途經(jīng)的蛋白質(zhì)亞群。純化分離合成一套新型隨機(jī)蛋白質(zhì)的無(wú)性系的起始群體。隨后重新檢驗(yàn)亞群看它能否催化與產(chǎn)生目標(biāo)化合物關(guān)聯(lián)的反應(yīng)。
更確切地說，作為一個(gè)非限制性的例子，下面我們介紹一套能夠催化一個(gè)特異小肽，特別是一個(gè)五肽，從由更小的肽和氨基酸所構(gòu)成的建筑積木集合體開始的合成的新型蛋白質(zhì)的選擇。所有的肽都是由20種不同類型的氨基酸線性序列所組成，方向?yàn)閺陌被┒说紧然┒?。任何肽能以專一的方法通過兩種較小的肽(或兩種氨基酸)的末端縮合或一較大的肽的水解而形成。具有M個(gè)殘基的肽可因此通過M-1步縮合反應(yīng)而形成。反應(yīng)的數(shù)目R，通過它一個(gè)具有1，2，3......M個(gè)殘基長(zhǎng)度的肽鏈可被互相轉(zhuǎn)換，比可能的分子種類的數(shù)目T要大。這可表示為R/T≌M-2。因此，從肽的給定群體開始，大量的獨(dú)立或部分獨(dú)立的反應(yīng)導(dǎo)致了特異目標(biāo)肽的合成。選擇了一個(gè)其存在可通過一些常見檢測(cè)技術(shù)，例如HPLC(液相高壓色譜)，紙層析等，而被方便地測(cè)得的五肽。在一稀釋的水介質(zhì)中形成一條肽鍵需要能量，但如果參與縮合反應(yīng)的肽充分濃縮的話，則在熱力學(xué)上肽鍵的形成比水解有利，而且在有一適宜的酶催化劑，例如胃蛋白酶或胰蛋白酶，存在的情況下，不需要ATP或其它高能化合物的參與就能高效地進(jìn)行。這樣一個(gè)其氨基酸用3H，14C，35S作為示蹤物而被放射性標(biāo)記的，由建筑積木集合體所構(gòu)成的小肽反應(yīng)混合物可在足夠高的濃度下用于縮合反應(yīng)。
例如，可按下述那樣進(jìn)行每種氨基酸和有2～4個(gè)氨基酸的小肽各15mg，用作建筑積木集合體，溶于0.25ml每毫升0.1M pH7.6的磷酸緩沖液中。大量按上述方法繁殖和分離的新蛋白質(zhì)從它們的細(xì)菌宿主細(xì)胞中被純化出來(lái)。新蛋白質(zhì)混合物在同樣的緩沖液中溶解至最終濃度約為0.8～1.0mg/ml。0.25～0.5ml的蛋白質(zhì)混合液加入于建筑積木混合物中。在25～40℃下保溫1～40個(gè)小時(shí)。每隔一定時(shí)間取出8ml等分試樣，第一份作為“空白”(blank)在新蛋白質(zhì)混合物加入之前取出。這些等分試樣通過層析法用正丁醇-乙酸-吡啶-水(30∶6∶20∶24)作為溶劑進(jìn)行分析。層析分離譜干燥后用茚三酮或放射自顯影術(shù)(用不用增感屏均可)分析。因?yàn)闃?gòu)成建筑積木集合體的化合物被放射標(biāo)記，所以目標(biāo)化合物是放射性的，并具有足夠高的可在1～10ng級(jí)別測(cè)得的特異活性。代替標(biāo)準(zhǔn)的層析分析法，可用HPLC(高壓液相層析法)，它可更快并更簡(jiǎn)單地進(jìn)行。更一般地說，所有常用分析技術(shù)都可應(yīng)用。結(jié)果能測(cè)得相對(duì)于作為起始建筑積木的化合物重量計(jì)不到百萬(wàn)分之一的目標(biāo)化合物的產(chǎn)率。
如果在上述條件下合成五肽，而不是用一從不含隨機(jī)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞得到的提取物，五肽的形成不是細(xì)菌雜質(zhì)的結(jié)果，因此在反應(yīng)混合物中要求新蛋白質(zhì)亞群的存在。
下一步驟是細(xì)胞特定亞群的分離，這種細(xì)胞含有具有催化產(chǎn)生目標(biāo)五肽的系列反應(yīng)的新型蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。舉例說明，如果形成該序列的反應(yīng)數(shù)目是5，則約有5種新蛋白質(zhì)催化必須的反應(yīng)。如果含有為新基因編碼的表達(dá)載體的細(xì)菌克隆庫(kù)具有若干總數(shù)約為1，000，000的性質(zhì)截然不同的新基因，則所有這些表面載體全部被分離并再轉(zhuǎn)化到108個(gè)細(xì)菌的100個(gè)不同的集合體中，載體對(duì)細(xì)菌的比例足夠低，即平均轉(zhuǎn)化了的集合體中細(xì)菌的數(shù)量約為起始基因的半數(shù)，即大約500，000。因此，任何已知細(xì)菌的100個(gè)集合體之一含有5種臨界的新蛋白質(zhì)的全部集合體的概率是(1/2)5＝1/32。在100個(gè)起始細(xì)菌集合體中，大約3個(gè)含有5個(gè)臨界轉(zhuǎn)化株。在這些集合體的每一個(gè)當(dāng)中，新基因的總數(shù)只有500，000而不是1，000，000。在目前狀況下，經(jīng)連續(xù)重復(fù)20次，本方法分離了5種臨界新基因。隨之對(duì)5種隨機(jī)基因的這個(gè)集合體致突變及選擇，從而改善了必要的催化功能。在必須催化20個(gè)反應(yīng)并同時(shí)分離編碼新蛋白質(zhì)的20個(gè)基因的情況下，它滿足了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化的多重性的要求，因而108個(gè)細(xì)菌的每一個(gè)集合體得到了10e6個(gè)隨機(jī)基因的80%，并使用了200個(gè)這樣的細(xì)菌集合體。在一個(gè)集合體中發(fā)現(xiàn)所有20種新蛋白質(zhì)的幾率是0.820≌0.015。因此，在200個(gè)集合體中大約有2個(gè)將具有所需催化目標(biāo)化合物形成的20個(gè)新基因。分離20種新基因所需要的周期數(shù)約為30。
上述原理和技術(shù)從肽對(duì)化學(xué)的許多方面作用的角度歸納出，在這些方面中化學(xué)反應(yīng)在水介質(zhì)中，溫度，pH和濃度等條件允許一般的酶促作用發(fā)生的條件下進(jìn)行。在每一種情況下必須用一種檢驗(yàn)方法檢測(cè)要求的目標(biāo)化合物的形成。也必須選擇足夠量的建筑積木化合物擴(kuò)大產(chǎn)生目標(biāo)化合物的反應(yīng)序列的數(shù)量。
為目標(biāo)五肽的合成所給出的具體實(shí)例也可按下述那樣被推廣上述技術(shù)從其它產(chǎn)物中產(chǎn)生隨機(jī)肽和蛋白質(zhì)。這些肽或蛋白質(zhì)能對(duì)其它化合物起催化的或其它方式的作用。它們同樣能構(gòu)成它們?yōu)橹鹱饔玫牡孜?。因此，?duì)于這樣的隨機(jī)肽或蛋白質(zhì)在它們本身中相互作用并因此修飾其中一些的構(gòu)象，結(jié)構(gòu)或功能的能力的選擇(或篩選)是可能的。相似地，能夠?qū)@些肽或蛋白質(zhì)對(duì)它們本身催化水解，縮合，轉(zhuǎn)肽或其它修飾肽的反應(yīng)的能力進(jìn)行選擇(篩選)。例如一個(gè)給定的隨機(jī)肽被隨機(jī)肽或蛋白質(zhì)集合體的至少一個(gè)成員催化的水解可通過給定蛋白質(zhì)的放射標(biāo)記繼之以和隨機(jī)蛋白質(zhì)混合物在有諸如Mg，Ca，Zn，F(xiàn)e和ATP或GTP存在的情況下一起培養(yǎng)而被跟蹤和測(cè)量。標(biāo)記蛋白質(zhì)的放射性碎片的出現(xiàn)按前述方法測(cè)得。催化該反應(yīng)的隨機(jī)蛋白質(zhì)可按上述方法，通過作為結(jié)果出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化無(wú)性系庫(kù)的縮減與產(chǎn)生它們的基因一起被分離。
本技術(shù)的擴(kuò)展在于一個(gè)能夠催化一組將起始建筑積木(氨基酸和小肽)構(gòu)成一些本組的肽或多肽的反應(yīng)的隨機(jī)肽和多肽群體的選擇。因此也能選擇一個(gè)能催化它自己合成的群體;這樣的一個(gè)反身自催化集合體可在一反應(yīng)產(chǎn)物被連續(xù)稀釋而建筑積木的濃度保持恒定的恒化器中建立起來(lái)。選擇性地，這樣一個(gè)集合體的合成通過在脂質(zhì)體中用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)關(guān)閉肽的復(fù)合物集合體而得到幫助。在一包圍該脂質(zhì)體的高滲水環(huán)境中，形成較大肽的縮合反應(yīng)降低了脂質(zhì)體內(nèi)的滲透壓，將因?yàn)榭s合反應(yīng)而產(chǎn)生的水分子排出了脂質(zhì)體，因而有利于更大的聚合物的合成。自催化群體的產(chǎn)生可通過兩次凝膠電泳和HPLC顯示肽和多肽穩(wěn)定分布的合成而證實(shí)。合適的反應(yīng)體積取決于所用分子種類的數(shù)量，以及有利于肽建的形成超過它們的水解所必需的濃度。自催化群體的分子種類的分布能夠因?yàn)椴煌淖源呋后w的出現(xiàn)而自由變化。構(gòu)成一個(gè)自催化集合體的肽和多肽可以具有與大的起始群體相同的某些成份(由本方法所給出的編碼的肽和多肽構(gòu)成的)而且還能含有不是由為起始群體的肽和蛋白質(zhì)編碼的隨機(jī)基因群體所編碼的肽和蛋白質(zhì)。
其產(chǎn)物是建立這樣一個(gè)自催化集合體所必需的隨機(jī)基因集合體，可按已知方法通過連續(xù)縮小轉(zhuǎn)化無(wú)性系庫(kù)而完成分離。此外，一個(gè)自催化集合體可以包括由隨機(jī)基因起始編碼的并在自催化集合體內(nèi)連續(xù)合成的編碼肽。為了分離這個(gè)編碼的肽和蛋白質(zhì)的亞群，自催化集合體可用于通過在動(dòng)物體內(nèi)的免疫接種作用得到識(shí)別大量的自催化集合體組分的多克隆血清。
該血清可用于篩選隨機(jī)基因庫(kù)從而發(fā)現(xiàn)那些表達(dá)能夠與血清中存在的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因。
這個(gè)隨機(jī)基因的集合體表達(dá)了大量的存留在自催化集合體內(nèi)的編碼隨機(jī)蛋白質(zhì)。這樣一個(gè)自催化集合體的編碼組分存留物可通過隨機(jī)基因庫(kù)的連續(xù)縮減而被分離，由此，用免疫法檢出的亞群首先被除去。
按所述方法獲得的這樣的肽和蛋白質(zhì)的自催化集合體可以發(fā)現(xiàn)若干實(shí)際的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.通過微生物法產(chǎn)生肽或多肽的方法，其特征在于至少有一部分是由隨機(jī)的合成多聚核苷酸組成的基因可在一種普通培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生，如此獲得的基因被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，含有這些基因的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性繁殖系同時(shí)被培養(yǎng)以便無(wú)性繁殖那些隨機(jī)基因并導(dǎo)致由這些隨機(jī)基因各自所表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的無(wú)性繁殖系以鑒定那些產(chǎn)生至少具有一種專一性的肽或多肽的無(wú)性繁殖系的方式進(jìn)行選擇或篩選，分離那些如此鑒定出的無(wú)性繁殖系，然后以產(chǎn)生至少一種具有上述特性的肽或多肽的方式培養(yǎng)之。
2.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于這些基因是由四種類型的脫氧磷酸核苷酸A，C，G，和T的隨機(jī)共聚作用而產(chǎn)生的，隨機(jī)共聚作用是從一個(gè)預(yù)先線性化的表達(dá)載體的兩個(gè)末端開始的，然后通過這樣的方式形成粘性末端，即產(chǎn)生包含具有兩個(gè)隨機(jī)序列的一個(gè)表達(dá)載體分子的隨機(jī)DNA的第一股，所述兩個(gè)隨機(jī)序列的3′末端是互補(bǔ)的，隨后合成隨機(jī)DNA的第二股。
3.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于基因是由那些沒有粘性末端的雙股寡核苷酸的隨機(jī)共聚作用產(chǎn)生的，其方式為形成隨機(jī)DNA的碎片，然后在一個(gè)預(yù)先線性化的表達(dá)載體中連接這些碎片。
4.按照權(quán)項(xiàng)2或3的方法，基特征在于表達(dá)載體是一個(gè)質(zhì)粘。
5.按照權(quán)項(xiàng)4的方法，其特征在于表達(dá)載體是pUC8。
6.按照權(quán)項(xiàng)2或3的方法，其特征在于表達(dá)載體是病毒DNA的碎片。
7.按照權(quán)項(xiàng)2或3的方法，其特征在于表達(dá)載體是質(zhì)粘和病毒DNA的一種雜化物。
8.按照權(quán)項(xiàng)1到7的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
9.按照權(quán)項(xiàng)1到7的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.按照權(quán)項(xiàng)8的方法，其特征在于，細(xì)胞選自HB101和C600中。
11.按照權(quán)項(xiàng)3的方法，其特征在于寡核苷酸形成一組四文八聚體。
12.按照權(quán)項(xiàng)11的方法，其殊征在于，四文八聚體是下列一組5′GGAATTCC 3′5′GGTCGACC 3′5′CAAGCTTG 3′5′CCATATGG 3′5′CATCGATG 3′。
13.按照權(quán)項(xiàng)3的方法，其特征在于寡核苷酸形成一組四文七聚體。
14.按照權(quán)項(xiàng)13的方法，其特征在于，四文七聚體是下列一組5′XTCGCGA 3′5′XCTGCAG 3′5′RGGTACC 3′其中X＝A，G，C，或T，R＝A或T。
15.按照權(quán)項(xiàng)4和權(quán)項(xiàng)12或14之一的方法，其特征在于，首先分離和純化由培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性繁殖系得到的轉(zhuǎn)化DNA，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是以在權(quán)項(xiàng)11或權(quán)項(xiàng)13中限定的方式獲得的，然后至少用一個(gè)對(duì)應(yīng)著存在于這些四文八聚體和七聚體中的特異限制位占的限制性內(nèi)切酶切割純化的DNA，但所用的表達(dá)載體上沒有該特異限制性位點(diǎn)，此后用DNA連接酶同時(shí)處理如此得到的線性化隨機(jī)DNA碎片的整體，以這樣的方法產(chǎn)生一種含有新的隨機(jī)序列的新的DNA整體，利用這種新的轉(zhuǎn)化DNA整體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并無(wú)性繁殖這樣的基因，最后對(duì)新的轉(zhuǎn)化細(xì)胞無(wú)性繁殖系進(jìn)行選擇或篩選和分離，并培育這些無(wú)性繁殖系以便產(chǎn)生至少一種具有所需特性的肽或多肽。
16.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于所述的特性為催化一種給定化學(xué)反應(yīng)的能力。
17.按照權(quán)項(xiàng)1產(chǎn)生幾種肽和/或多肽的方法，其特征在于，所述的特性為催化由給定的起始化合物直至形成至少一個(gè)目標(biāo)化合物的一系列反應(yīng)的能力。
18.按照權(quán)項(xiàng)16產(chǎn)生由一個(gè)以上反身自催化的肽和/或多肽組成的整體的方法，其特征在于所述的特性為催化由氨基酸和/或寡肽開始的整體本身的合成的能力。
19.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，所述的特性為選樣修飾一種給定化合物的化學(xué)性質(zhì)或/和生物學(xué)性質(zhì)的能力。
20.按照權(quán)項(xiàng)19的方法，其特征在于，所述的特性為選擇修飾一種多肽的催化活性的能力。
21.按照權(quán)項(xiàng)19的方法，其特征在于，所述的特性為模擬或修飾至少一種生物活性化合物的至少一個(gè)生物學(xué)功能的能力。
22.按照權(quán)項(xiàng)21的方法，其特征在于，所述的生物活性化合物選自激素，神經(jīng)遞質(zhì)，粘連或生長(zhǎng)因素，以及DNA的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄，和/或RNA的轉(zhuǎn)解的特異調(diào)節(jié)劑中。
23.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，所述的特性為與一種給定配位體結(jié)合的能力。
24.用按照權(quán)項(xiàng)23所獲得的肽或多肽檢測(cè)和/或滴定配位體。
25.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，所述的特性為至少有一個(gè)與給定抗原的抗原決定部位相似的抗原決定部位。
26.按照權(quán)項(xiàng)19和25的方法，其特征在于所述的性質(zhì)為模擬或修飾一種生物活性分子的作用的能力，對(duì)產(chǎn)生具有該特性的至少一種的肽或多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性系的篩選和(或)選擇，是這樣完成的，即制備或獲取抗(給定)分子的抗體，并且利用如此獲得的這些抗體鑒定那些含有通過抗體而結(jié)合的那些肽或多肽的無(wú)性繁殖系，然后通過培育這樣鑒定的無(wú)性繁殖系并分離和純化由這些無(wú)性繁殖系所產(chǎn)生的肽或多肽，最后通過提供這些肽或多肽在體外測(cè)定證實(shí)它(它們)實(shí)際上有模擬或修飾所述分子的作用的能力，模擬或修飾所述分子作用的能力方面的改進(jìn)可通過對(duì)所鑒定的肽或多肽編碼的隨機(jī)基因(不論突變或不突變)的修飾，然后重新篩選和重新試驗(yàn)，或者由已知方法對(duì)所鑒定的肽或多肽本身的衍生作用而獲得。
27.通過按照權(quán)項(xiàng)1或權(quán)項(xiàng)26的方法所獲得的可作為具有藥理學(xué)和/或化學(xué)治療作用的活性物質(zhì)而利用的肽或多肽。
28.通過按照權(quán)項(xiàng)25的方法獲得的肽或多肽，在體外或體內(nèi)可用來(lái)減小對(duì)所述抗原有特異性的游離抗體的濃度，這是通過這些肽或多肽與這些抗體之間形成鍵而實(shí)現(xiàn)的。
29.按照權(quán)項(xiàng)27或28的可作為免疫過敏性抑制劑而利用的肽或多肽。
30.通過按照權(quán)項(xiàng)25的方法獲得的可用作對(duì)所述抗原產(chǎn)生忍耐力試劑的肽或多肽。
31.按照權(quán)項(xiàng)25的方法，其特征在于抗原是EGF。
32.通過根據(jù)權(quán)項(xiàng)31的方法獲得的肽或多肽，可用于上皮細(xì)胞癌的化療。
33.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，產(chǎn)生具有所述特性的肽或多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞無(wú)性繁殖系通過在相應(yīng)于由DNA雜種的天然碎片表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體上的親和層析得到鑒定和分離。
34.按照權(quán)項(xiàng)33的方法，其特征在于DNA雜種的天然碎片含有表達(dá)β半乳糖苷酶的基因，通過抗β半乳糖苷酶抗體的親和層析鑒定和分離所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞宿主的無(wú)性繁殖系。
35.按照權(quán)項(xiàng)1或34的方法，其特征在于，在雜種肽或多肽的表達(dá)和純化之后，新的碎片得到分離。
36.將按照權(quán)項(xiàng)25或權(quán)項(xiàng)26的方法用于疫苗的制備，其特征在于，抗病原作用物的抗體被獲得并被用于鑒定那些至少產(chǎn)生一個(gè)具有至少一個(gè)與病原作用物的抗原決定部位之一類似的抗原決定部位的蛋白質(zhì)的無(wú)性繁殖系，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的無(wú)性繁殖系以這樣一種方式培育以便產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，從這種細(xì)胞無(wú)性繁殖系的培養(yǎng)物中分離和純化蛋白質(zhì)并且利用這種蛋白質(zhì)生產(chǎn)抗病原作用物的疫苗。
37.按照權(quán)項(xiàng)36的應(yīng)用，制備抗HVB疫苗，其特征在于，至少一種HUB病毒的衣殼蛋白質(zhì)被提取和純化，這種蛋白質(zhì)被注入能夠形成抗此蛋白質(zhì)的抗體的動(dòng)物體內(nèi)，這些抗體被回收和純化，用這些抗體鑒定那些至少產(chǎn)生一種具有至少一個(gè)與HBV病毒的抗原決定部位之一類似的抗原決定部位的蛋白質(zhì)的無(wú)性繁殖系，以產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的方式培育相應(yīng)于這些無(wú)性繁殖系的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的無(wú)性繁殖系，從這些宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離和純化這種蛋白質(zhì)，并且用這種蛋白質(zhì)生產(chǎn)抗HVB疫苗。
38.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，宿主細(xì)胞是大腸桿菌類型的細(xì)菌，其基因組既不含天然的β半乳糖苷酶基因，也不含EBG基因，是Z-EBG-大腸桿菌，在也含有誘導(dǎo)物IPTG的X-gel培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，對(duì)β半乳糖苷酶的功能是陽(yáng)性的無(wú)性繁殖系在這種培養(yǎng)基中被檢測(cè)，此后，(相應(yīng)的)DNA被移植到宿主細(xì)胞的無(wú)性繁殖系中，這種宿主細(xì)胞的無(wú)性繁殖系適于至少一種具有β半乳糖苷酶功能的肽、多肽或蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)。
39.按照權(quán)項(xiàng)1的方法，其特征在于，所述的特性為與一種給定化合物結(jié)合的能力。
40.按照權(quán)項(xiàng)39的方法，其特征在于，在肽、多肽和蛋白質(zhì)中選擇所述的化合物。
41.按照權(quán)項(xiàng)40的方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄活性或復(fù)制的蛋白質(zhì)。
42.按照權(quán)項(xiàng)39的方法，其特征在于在DNA和RNA序列中選擇所述的化合物。
43.通過按照權(quán)項(xiàng)40或42的方法得到的蛋白質(zhì)。
44.一種產(chǎn)生DNA的方法，其特征在于，在同樣的培養(yǎng)基中，至少有一部分是由隨機(jī)的合成多核苷酸組成的基因被生產(chǎn)出來(lái)，如此產(chǎn)生的基因以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的整體的方式，被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培育這些基因以便產(chǎn)生如此產(chǎn)生的宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性繁殖系，在這個(gè)整體上進(jìn)行篩選和(或)選擇以鑒定那些含有至少具有一種所需特性的DNA的那些隨機(jī)序列的宿主細(xì)胞，這樣的DNA與所鑒定的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離開。
45.按照權(quán)項(xiàng)44的方法，其特征在于所述的特性為與一種給定化合物結(jié)合的能力。
46.按照權(quán)項(xiàng)45的方法，其特征在于，在肽、多肽和蛋白質(zhì)中選擇所述的化合物。
47.按照權(quán)項(xiàng)45的方法，其特征在于，所述的化合物是一種調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄活性或復(fù)制的化合物。
48.按照權(quán)項(xiàng)47的方法，其特征在于，所述的化合物是一種控制DNA轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的調(diào)節(jié)蛋白。
49.通過按照權(quán)項(xiàng)46，或權(quán)項(xiàng)47的方法獲得的DNA序列用作為一個(gè)DNA鄰近序列的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。
50.按照權(quán)項(xiàng)42的方法，其特征在于，所獲得的蛋白質(zhì)具有修飾DNA的轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制，或穩(wěn)定性的能力。
51.利用通過按照權(quán)項(xiàng)48的方法獲得的蛋白質(zhì)在含有該序列的DNA和表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中修飾DNA序列的轉(zhuǎn)錄，復(fù)制或穩(wěn)定性。
52.生產(chǎn)RNA的方法，其特征在于，在同樣的培養(yǎng)基中，同時(shí)產(chǎn)生至少有一部分是由合成的隨機(jī)多核苷酸組成的基因，如此得到的基因以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的整體的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的獨(dú)立無(wú)性繁殖系，在這個(gè)整體上進(jìn)行的篩選和(或)選擇是以鑒定那些含有至少具有一種所需特性的RNA隨機(jī)序列的宿主細(xì)胞的方式進(jìn)行，這種RNA從如此鑒定的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離出來(lái)。
53.按照權(quán)項(xiàng)52的方法，其特征在于所述的特性為與一種給定化合物結(jié)合的能力。
54.按照權(quán)項(xiàng)52的方法，其特征在于所述的特性為催化一種給定化學(xué)反應(yīng)的能力。
55.按照權(quán)項(xiàng)52的方法，其特征在于所述的特性應(yīng)為一種轉(zhuǎn)移RNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及微生物生產(chǎn)肽或多肽的方法，可以 在一種普通培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生出至少有一部分是由 隨機(jī)合成多聚核甘酸組成的基因，將這樣的基因?qū)?入宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以便無(wú)性繁殖那些隨 機(jī)基因并導(dǎo)致由其所表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)所需 的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體進(jìn)行鑒別，篩選，分離，然后培養(yǎng) 之，生產(chǎn)出所需的肽或多肽。
文檔編號(hào)C12N1/21GK86102090SQ86102090
公開日1986年11月5日 申請(qǐng)日期1986年3月29日
發(fā)明者馬克·巴利維特, 斯圖亞特·阿蘭·考夫曼 申請(qǐng)人:馬克·巴利維特;斯圖亞特·阿蘭·考夫曼導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan