專利名稱:雜多糖s-657的制作方法
本發(fā)明是關于微生物多糖類方面的。人們知道，在這個方面某些微生物具有一個共同特征，那就是能產生細胞外的雜多糖。雜多糖通常為高分子量的線性碳水化合物多聚體，含有兩種或兩種以上類型的單糖，這些單糖以重復單位互相聚合在一起。
大部分雜多糖的用處在于它們能夠改變水溶液中的粘度和液流學性質。此外，雜多糖還有相關的次要功能，如乳化作用，懸浮，穩(wěn)定，及絮凝作用等等。參見示例，美國專利4，326，052，4，401，760。
雜多糖被廣泛用于食品，鉆井，農業(yè)及各種各樣其它工業(yè)應用上。近幾十年來，商業(yè)上對這些水溶性膠的需求大大增加。另外，新的工業(yè)技求產生對新的物理性質的雜多糖的需要。所以，對不同功能性范圍的雜多糖的需要，結合商業(yè)上的需求，都已明顯地說明發(fā)展新的、有不同物理特性的新型雜多糖是十分需要的。
因而，本發(fā)明的一個目的就是提供一種新型雜多糖，該雜多糖是由一種微生物野油菜黃單胞菌的新菌株所產生的。本發(fā)明的另一個目的是提供制備這種新型雜多糖的方法。還有一個目的是提供生產這種新化合物的微生物。另外，本發(fā)明還提供配制含有這種新型雜多糖的配方。本項發(fā)明的所有這些目的將在下面詳盡說明。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，野油菜黃單胞菌一種新菌株通過在某一選擇性碳源上作用可產生一種新型雜多糖。該雜多糖主要由碳水化合物，和大約12%蛋白以及7%?；?以0-乙酰基計算)所組成。碳水化合物部分含有重量比為19%的葡萄糖醛酸及中性糖-鼠李糖和葡萄糖，這兩種糖的摩爾分子數比例約為2∶1。這個新型化合物是通過野油菜黃單胞菌的新菌株在合適液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中有氧發(fā)酵而制備的。根據布達佩斯條約，這種微生物菌株的生物純培養(yǎng)于1985年6月19日，按注冊號ATCC 53159保存在美國馬里蘭州，洛克菲勒的美國菌種保藏中心。這種雜多糖，這里命名為雜多糖S-657，在水溶液系統(tǒng)中具有我們期望的那些特性，尤其適用于配制油井處理液體。
本發(fā)明的這種新型微生物是從一種采自美國加州尤里卡地區(qū)附近沼澤地的藻類樣品中分離得到的。經過30℃溫度下培養(yǎng)4天，從YM瓊脂平板上挑選出這種呈膠狀菌落的微生物，然后這種分離物在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進一步純化培養(yǎng)。
取在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的分離株接種到種子三角瓶中培養(yǎng)。然后再取三角瓶中培養(yǎng)物用作種子接種到另一個含有以水解淀粉作為碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)三角瓶中含有一種粘液，加入異丙醇后，可見一種纖維狀物質沉淀下來。另一個三角瓶種子培養(yǎng)，用來測定各種營養(yǎng)培養(yǎng)基對膠產量的影響，以及測定這種微生物生長用最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。
雜多糖S-657是在控制的條件下，接種ATCC 53159菌株培養(yǎng)物，通過在營養(yǎng)培養(yǎng)液中有氧發(fā)酵而產生的。所用培養(yǎng)基含有可同化的碳源，氮源和無機鹽。
一般來說，碳水化合物(例如葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，木糖，乳糖等)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中能被單獨或聯(lián)合在一起用作可同化的碳源。培養(yǎng)基中所用的一種或多種碳源的確切數量部分程度上取決于培養(yǎng)基中所含的其它成分。但是總的來說，所用碳水化合物量通常在培養(yǎng)基重量的2%～5%之間。這些碳源在培養(yǎng)基中能被單獨或聯(lián)合使用。
總的來說，許多蛋白質性物質可被用作發(fā)醇過程的氮源。合適的氮源包括如酵母水解物，粗酵母，大豆粉，棉籽粉，酪蛋白水解物，玉米漿，蒸餾酒廠廢液濃縮物，蕃茄醬等等，這些氮源既可單獨也可聯(lián)合使用;用量范圍通常為液體培養(yǎng)基重量的0.05%～0.2%。
那些可摻入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)無機鹽常為一些鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽及其類似的離子。也包括一些微量的金屬元素如鈷、錳、鐵、鎂。
提請注意的是，我們這里所列舉的培養(yǎng)基僅僅是說明可被使用的培養(yǎng)基種類很多，而不是想就限制在這些。
用一種更替的培養(yǎng)基，S-657菌株可在低鈣條件下生長，也即在去離子水或一些實際上不含鈣離子的其它水溶液系統(tǒng)中。(也即最終發(fā)酵培養(yǎng)基中每1%膠液中含有鈣離子濃度小于4ppm)。
發(fā)酵在溫度25°～35℃范圍內進行，然而為獲得最佳結果，常在溫度28°～32℃下進行發(fā)酵，用以培養(yǎng)ATCC53159菌株和生產雜多糖S-657，培養(yǎng)基的PH值可在6-8范圍內變動。
盡管雜多糖S-657用表面培養(yǎng)和浸沒培養(yǎng)都能產生，但通常都選用在浸沒狀態(tài)下進行發(fā)酵。
小規(guī)模的發(fā)酵可以很方便地將培養(yǎng)物接種入合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行，轉到生產培養(yǎng)基中后，就讓發(fā)酵在大約30℃恒定溫度下，在搖床上進行數天。
發(fā)酵過程從一個滅菌三角瓶起始，通過一級或多級的種子擴大。種子階段的培養(yǎng)基可以是任何合適的碳源和氮源的聯(lián)合物。含種子的三角瓶在恒溫搖床上，約30℃，振搖培養(yǎng)1～2天，或者直到培養(yǎng)物生長到合適為止。有些生長的培養(yǎng)物既可作接種二級種子用，也可接種到生產培養(yǎng)基中。所用中間過程的種子三角瓶培養(yǎng)時，基本上也以相同的方式進行擴大，也即來自上一種子階段的一部分搖并培養(yǎng)物可被用作接種到生產培養(yǎng)基上的種子。被接種的三角瓶在恒溫下振搖培養(yǎng)幾天，培養(yǎng)結束三角瓶中內含物可通過用一種合適的醇，如異丙醇沉淀而回收。
對大規(guī)模發(fā)酵來說，通常在合適的裝備攪拌器和向發(fā)酵培養(yǎng)基有通氣裝置的發(fā)酵罐中進行。根據這種方法，營養(yǎng)培養(yǎng)基可在罐中配制，然后在加溫到121℃下滅菌。等冷卻后，在無菌的培養(yǎng)基中接入原先為生產培養(yǎng)生長好的種子，然后進行一段時間的發(fā)酵，例如進行2～4天，同時攪拌和或向營養(yǎng)培養(yǎng)基中通氣，并維持溫度在30℃。大量制備時用這個方法生產S-657，特別合適。
雜多糖-S657由ATCC53159菌株所產生的雜多糖主要是由碳水化合物，約12%蛋白質，和約7%重量比的酰基(以0-乙?；嬎?組成，實際上不含有丙酮酸。S-657中碳水化合物部分含有大約19%葡萄糖醛酸，(據膠液的重量計算)和中性糖鼠李糖和葡萄糖，兩種糖的摩爾分子比為2∶1。
乙?；看蠹s為7%，這是根據兩種分離技術確定的。0.2%的S-657膠的水溶液用一種堿，即羥胺試劑處理，緊接著用酸性氯化鐵試劑處理，然后進行比色分析。〔參閱S.Hestvin(1949)J.Biol、Chem.180，249-261〕。這種O-?；昏b定為0-乙酰基，并用液相層析測定。
S-657的中性糖也用各種技術進行了測定。其中有一個方法涉及到把50毫克S-657放入1毫升1MH2SO4中，在100℃水解4小時。冷卻后，加0.5毫升的3毫克/毫升濃度的木糖溶液作為內標準。樣品通過加入3毫升的飽和氫氧化鋇而中和，然后加二滴剛果紅而氫氧化鋇加入直到溶液顏色變?yōu)榧t色止。經過離心(轉速為3000轉/分，離心時間20分鐘)，所有樣品上清液都蒸發(fā)干燥。干的樣品溶解在0.1毫升鹽酸羥胺中(40毫克/毫升在無水吡啶中)，然后在90℃加熱45分鐘。冷卻后加入0.1毫升乙酸酐，再把樣品在90℃下加熱處理45分鐘。這些糖可通過它們相應的醛糖酸腈的(aldononitvile)乙酸鹽衍生物的氣-液相層析而分離，并可通過與可靠的標準物比較而鑒定和定量?！矃⒁娢墨IJ.K.Baird，M.J.Holroyde，anel D.C.Ellwood(1973)Carbohydr.Res.27，464-467〕。
這種雜多糖中各種中性糖還可通過第二種方法鑒定。該方法涉及把2毫克S-657溶解于2毫升的0.5M三氟乙酸中。樣品在100℃下過夜，然后濃縮到干燥，并再溶解于2毫升水中。加氫硼化鈉25毫克，2小時后溶液用Dowex50(酸型)離子交換劑處理，以后溶液pH下降到3.5。過濾后，濃縮溶液，并與甲醇一起共餾(三次，每次甲醇加入量5毫升)。殘余物溶解在1毫升的乙酐和1毫升吡啶的混合液中，在100℃保持1小時，然后濃縮。再與甲苯共餾，(三次，每次甲苯加入量5毫升)，殘存物溶解于亞甲基氯化物中，最后用氣-液相層析進行分析。
表1S-657中性糖總量方法1(三個樣品) 鼠李糖摩爾百分比 葡萄糖摩爾百分比57 43方法2(9個樣品) 64 36該多糖中的葡萄糖醛酸含量是通過用17%鹽酸進行脫羧反應，接著把釋放的二氧化碳收集在標準氫氧化鈉中進行反滴定而測定的。〔參閱文獻B.L.Browning(1967)木材化學方法，2，623-633〕。用這種脫羧方法測定三種不同S-657樣品，得出它們的葡萄糖醛酸含量在17.6%-19.6%之間。
紙電泳被用來分離和鑒定上述中性化的酸水解物中所存在的糖醛酸。取多份這種樣品和已知的糖醛酸標準進行紙電泳，電泳緩沖液pH為2.7，電泳時間2小時。分離后的區(qū)帶譜在空氣中自然干燥，然后用硝酸銀染色，確定被分離的糖醛酸位置。這里唯一確定的糖醛酸位置是葡萄糖醛酸。
鑒定S-657中不含有丙酮酸是通過加1毫升濃度為2毫克/毫升的S-657溶液到一個培養(yǎng)用試管中，再加1毫升0.2N鹽酸，在100℃反應4小時。取0.5毫升水解液樣品加入0.1毫升的還原型二磷酸吡啶核苷酸(NADH)和2.4毫升的三乙醇胺溶液中。在分光光度計上測定光吸收，從而測定丙酮酸〔參閱文獻Duckworth and Yaphe，Chem，& Ind.(1970).P747〕。沒有測出丙酮酸。
通過克氏消化法進行氮元素的分析。經測定氮含量為1.5%重量比(對三個不同樣品其含量值在1.3%-1.9%之間)。固體和灰分分析表明，S-657含有約94%重量固體物質。(91.8%-95.8%)和9%(7.8-10.3%)重量的灰分。蛋白質含量經用Lowry氏方法〔Lowry ef al J.B.iol.Chem，(1951)，193，P256〕測定用小牛血清白蛋白作為標準大約有12%(7.5%-14.5%)。
甲基化作用分析是用經透析和冰凍干燥的部分純化的S-657樣品進行的。樣品甲基化過程是根據Sandford & Conrad提出的方法進行的〔參閱文獻。Sandford & Conrad(1966)BioChem，5 1508-1507〕這些糖的O-甲基醚衍生物作為它們的aditol acetates可通過氣相層析分離，并與可靠標準品比較，用計算機鑒定。鑒定過的主要甲基化糖列于下表2中。
表2甲基化S-657的水解物中所含O-甲基糖甲基化糖 連接形式2，3，4三甲基鼠李糖 12，3二甲基鼠李糖 1，42，4二甲基葡萄糖 1，3，62，6二甲基葡萄糖 1，3，4應該知道盡管這里所述各種分析雜多糖的方法實際上是我們采用以測定上述各種組分的方法，但對有這方面技術經驗的人來說可以采用其他的分析方法。運用其它分析方法會獲得該雜多糖的相同特性結果，但也許在定量結果上會有所不同。
雜多糖S-657在水溶液中具有突出的特性，尤其是在低濃度下有很高的粘度，良好的溫度穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性。正因為如此，它常用作為增稠，懸浮，乳化，穩(wěn)定，潤滑，成膜式結合劑。S-657在各種工業(yè)上，石油和食品應用方面都有用處。在這些方面，高粘度和良好的熱穩(wěn)定和泡沫穩(wěn)定性是最合乎需要的。S-657特別在下面這些應用和產品上有用處。例如，粘合劑，墻壁連接結合劑，保水灰漿和膠泥，發(fā)泡劑，罐頭密封劑，鍋爐防垢劑，膠乳乳化，電焊條的焊劑，煮蒸食物用的糊狀物，陶器的上釉和擠壓，清洗劑和拋光劑，玩具，乳化液(膠乳，瀝青乳液，硅酮)，銀回收，種子覆蓋，殺蟲劑和除草劑的噴灑控制，可乳化的濃度和可流性殺蟲劑和除草劑，煙草結合劑，含水墨水，平板制版的潤板液，皮革拋光劑，水覆蓋和水插種，紡織品的印染和精加工，濕部紙?zhí)砑觿?，濕部紙的保持和形成劑，抗滑劑，鑄模松脫劑，液體樹脂，液體和包裝的炸藥，石油和水井鉆井泥漿，石油修井液和完井液，石油增產液，化妝品，藥物的懸濁溶和乳濁液。
這種膠在食品系統(tǒng)中也有用處。例如凝膠軟糖和其它高糖含量系統(tǒng)，飲料類包括那些含檸檬酸的飲料，奶制品包括冰淇淋，酸牛奶，色拉調味料，干粉，蛋糕的糖衣，糖衣，糖漿，淀粉類食物，布丁，罐頭食品和滅過菌的食品，面包夾心餡。
在石油井及水井的處理液和泥漿這方面，這種膠具有特別的利用價值。已經發(fā)現(xiàn)雜多糖S-657在水相介質中很有用，尤其是把它配制成為用作油井處理液。
油井處理液是涉及范圍很廣的介質，它在鉆探和使用礦井(包括天然氣井和油井)的不同階段中被用在推進操作和簡化操作過程上。術語“油井處理液”包括下面這些液體，如循環(huán)鉆井液，修井液和完井液，取心作業(yè)用液體，增產液(水力壓裂和酸化)，以及增加石油回收液。在這些液體中可能存在的一些物質包括，氯化鈉，氯化鉀，硫酸鋇，無定形氧化硅，碳酸鈣，皂土，活性白土，偏硫酸鈉，白雀樹皮，木素磺化鈣鹽，石灰，硫酸鈣，氯化鈣，石油磺酸鹽，妥爾油皂，原油和柴油、淀粉、殺生劑，以及如羧甲基纖維素，聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等聚合物。值得提出的是，并非所有這些化合物都存在于一些特定液體中，相反而由油井操作工根據要完成特別工作而選用必需量的化合物。
由于在鉆井過程中和鉆井完成以后地層經歷情況不同，要對油井處理液進行調整，或者完全換用另一種油井處理液都是可能的。
S-657具備改進懸濁液使有高粘度，熱穩(wěn)定和鹽穩(wěn)定，剪切穩(wěn)定，加熱后和冷卻后良好的粘度恢復等方面性質，所有這些使它在油井處理液中作為一種非常理想的液流學改良劑。
具有代表性的油井處理液配方列于例4和例5，這些配方并非想作為配方的限制，而只是用S-657制備油井處理液配方的一種可能范圍的建議。雜多糖S-657在這些配方中所用的量的重量比是0.01%～1.0%的范圍。
S-657在低濃度具備高粘度這個特性使得這個雜多糖作為一種增強原油回收特別有效粘化劑。在這些操作中，S-657可使用的濃度范圍為0.01%～0.2%(重量比)，最好在0.02%～0.1%之間。
雜多糖S-657具有特殊方面的溶液特性，這點是這個多糖物質的一個顯著特征，使它與其它雜多糖類區(qū)別開來。S-657有下列方面的特性Ⅰ、液流學數據1%STW1粘度(Bvookfield，LVF)6轉/分，19500厘泊60轉/分，2200厘泊6/60比例 8.90.1%STW粘度(Brookfield，LVF)6轉/分，95厘泊(附UL聯(lián)接器)Ⅱ、相容性數據(Y代表相容，N代表不相容)磨緣的(陰離子)相容性，1%膠濃度，可觀察， Y美蘭(陽離子)相容性，1%膠濃度，可觀察， N鯨蠟基二甲基銨化溴(陽離子)相容性，膠濃度0.5%，可觀察， N陽離子膠乳的相容性，0.5%膠濃度，可觀察， N陽離子表面活性劑相容性，0.4%膠，可觀察， NⅢ、功能數據海水粘度〔濃度1ppB(0.28%膠濃度)3轉/分，F(xiàn)ann 35，〕 850厘泊溫度反應測試2〔Fann 50℃粘度計處于100秒-1〕起始粘度，80°F(華氏溫度) 86厘泊溫度300°F粘度 78厘泊(91%)溫度在300°F一小時后粘度 63厘泊(73%)溫度冷卻到80°F后粘度 73厘泊(85%)飽和氯化鈉粘度〔濃度1ppB(0.28%膠濃度)，3轉/分，F(xiàn)ann 35，〕 20厘泊飽和氯化鈣粘度〔濃度1ppB(0.28%膠濃度)，3轉/分，F(xiàn)ann 35〕 10厘泊剪切穩(wěn)定性(1%膠濃度)，15分鐘混合，起始粘度(60轉/分)變化百分數 2200厘泊/+16丙烯膠乳增稠〔乳膠漆，粘合劑(聚丙烯酸)〕，0.5%膠濃度Brookfied粘度，60轉/分厘泊 2250厘泊6轉/分/60轉/分 比例 6.9乙酸，加熱(80℃二小時)，0.5%膠濃度，9.6秒-1時起始粘度/二小時反應時間的變化百分數/80℃二小時變化百分數 1000厘泊/+2/+6僅在80℃加熱二小時，0.5%膠濃度，9.6秒-1時起始粘度/變化百分數 1000厘泊/+4Ⅳ、注解和觀察1STW代表人工組合自來水(Synthetic Tap Watcl之縮寫)含有1000ppm Nacl和147ppm Cacl2·2H2O化合物的去離子水。
20.4%多聚物溶于含500ppm Na2SO3海水中。
菌株特性描述雜多糖S-657是由野油菜黃單胞菌中一個新菌株在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵而制備的，用以產生這種雜多糖的微生物菌的生物純培養(yǎng)，按照布達佩斯條約于1985年6月19日，以注冊號ATcc53159保存在美國馬里蘭州，洛克菲勒美國菌種保藏中心(ATCC)。
ATCC還對S-657細菌分離株完成了分類學鑒定。鑒定是參照ATCC原先鑒定野油菜黃單胞菌的ATCC內部材料，以及已發(fā)表在文獻上的各種細菌分類。這些發(fā)表的文獻包括伯杰氏細菌分類手冊1984，Voll，Krng & Holf eds，Williams & Wilkins;D.W.Dye，N.Zealand J.Med.，5，P.393-416(1962);
M.P.Starr，原核生物中的黃單胞菌屬(1981)在肯定了這種黃單胞菌微生物周身性鞭毛這一特性后，查對近期文獻，包括Palleroni，N.in Clarke，P.H.and M.H.Richmond(1975)，Genetics and Bio Chemistry of Pseudomonas.pq.5-6，Wiley & Sons;
Palleroni，N.in Bergeys Manud of Systematic Bacteriology(1984)，pq.142，Vol.1、Hugh，R.and G.Gilardi in lennette，Balows，Hauoler and Truanf，(1980)，Manual of Clinicas Microbiology，pq.290，American Societyfos MlWokiology;
Palleroni，N，M.Doudoroff，R.Y.stanier，R.E.Solanes.andl M.Mendal(1970)Jounal of Generol Micvokioko，Vol.60215-231;
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Shinoda，s.andl Okamoto，K.(1977)，Jounal of Bacteriology，Vol.1291266-1271。
在評閱了這些文獻之后，可以確定黃單胞菌屬具有極生鞭毛的形態(tài)特征，而該特征直到最近還被認為是黃單胞菌屬的典型特征，但現(xiàn)現(xiàn)已大大降低了其分類上意義，因為有異常鞭毛(即側生鞭毛)情況存在。因而由于它有很多吻合的特征所以把這種S-657菌株分類野油菜黃單胞菌種內。
很典型的一點是野油菜黃單胞菌通過純培養(yǎng)發(fā)酵過程產生一種黃色的膠。這種黃色膠的碳水化合物部分為葡萄糖醛酸和中性糖如葡萄糖和甘露糖。而雜多糖S-657并不是一種黃色的膠，它含有葡萄糖和鼠李糖，而不含甘露糖。因此，ATCC53159是野油菜黃單胞菌中一個新的菌株，它產生雜多糖S-657。
A、菌落形態(tài)特征在營養(yǎng)瓊脂上，在30℃培養(yǎng)兩天出現(xiàn)菌落，直徑達0.5～1.0毫米。菌落園形，完整，半透明、光滑、淺黃色。向營養(yǎng)瓊脂中加入1%葡萄糖后，菌落變成粘膠狀，園形隆起，并有光澤。
B、細胞形態(tài)特征在營養(yǎng)瓊脂上細胞大小約為0.8-1.0×2.0-3.0微米。以單獨成對或呈長鏈狀出現(xiàn)，細胞屬革蘭氏陰性，棒狀，端部漸尖，游動很活躍，周身鞭毛。
C、生理和生化特征下表3列出在鑒定這種微生物中所進行的許多生理和生化試驗的結果。
表3. S-657分離株的生理生化試驗結果4℃培養(yǎng)生長 - 明膠酶 W25℃生長 + 吐溫20水解 +30℃生長 + 吐溫80水解 +37℃生長 + 吲哚 -41℃生長 - 西蒙氏檸檬酸鹽生長 -產熒光素 - 脲酶 -產綠膿菌素 - 硝酸鹽到亞硝酸鹽 -非擴散黃色素 + 硝酸鹽還原 -產黑色素 - 亞硝酸鹽到氮氣 -pH6.0生長 + 硫化氫(TSI) -1%Nacl生長(+) + 醋酸鉛帶 +3%Nael生長(-) - 賴氨酸脫羧酶 -6.5%Nacl生長 - 精氨酸(Mollers) -MacConkey瓊脂生長 - 烏氨酸脫羧酶 -脫脂乳瓊脂生長 + 苯丙氨酸脫氨 -七葉苷水解 + 卵磷脂酶 -酪蛋白水解 - 磷酸酯酶 -淀粉水解 + 過氧化氫酶 +
葡萄瓊脂上生長粘液狀 + 氧化酶 -葡糖酸鹽氧化 -0.1%TTC生長 - 以丙二酸作為唯一 -0.02%TTC生長 + 碳源的生長酪氨酸降解 -外消羥基丁酸鹽上 -生長對羥基苯甲醛(pHB)累積 -脫氧核糖核酸酶 W0.05溴化十六烷基三 -甲銨上生長以乙酸鹽為唯一碳 +源的生長睪酮降解 -TTC＝三苯基四唑氯化物W＝弱陽性在斯坦尼氏的無機物基質中單一碳源試驗L-阿拉伯糖 + L-蘋果酸鹽 W纖維二糖 + 壬酸鹽 -D-果糖 W 丙酸鹽 -D-葡萄糖 + 奎尼酸鹽 -乳糖 + 琥珀酸鹽 W麥芽糖 + L-十一酒石酸鹽 -
D-甘露醇 - 戊酸鹽 -L-鼠李糖 - B-丙氨酸 -D-核糖 - D-A-丙氨酸 -D-山梨醇 - 甜菜堿 -蔗糖 + 甘氨酸 -海藻糖 - L-組氨酸 -D-木糖 + DL-正亮氨酸 -核糖醇 - L-脯氨酸 -赤蘚糖醇 - D-色氨酸 -甘油 - L-纈氨酸 -乙醇 - DL-精氨酸 -牻牛兒醇 - 芐胺 -i-肌醇 - 丁胺 -癸二酸 W 腐胺 -乙酰胺 - 甲基反丁烯二酸 -乙二酸 - DL-甘油酸鹽 -苯甲酸鹽 - L-色氨酸 -丁酸鹽 -順甲基丁烯二酸 -D-葡糖酸鹽 -M-羥基苯甲酸鹽 -2-酮葡糖酸鹽 -DL-乳酸鹽 -
在O-F培養(yǎng)基中碳水化合物的發(fā)酵L-阿拉伯糖產酸 + 核糖醇產酸 K纖維二糖產酸 + 半乳糖醇產酸 K乙醇產酸 K D-半乳糖產酸 +D-果糖產酸 + 菊粉產酸 KD-葡萄糖AO2產酸 + 水楊苷產酸 -D-葡萄糖-AnO2產酸 - D-山梨醇產酸 -D-葡萄糖中的堿性pH -甘油產酸 Ki-肌醇產酸 K乳糖產酸 +麥芽糖產酸 +D-甘露醇產酸 KD-甘露糖產酸 +核糖產酸 K蔗糖產酸 +海藻糖產酸 KD-木糖產酸 ++＝酸性K＝堿性-＝沒有變化本發(fā)明包含的其它試驗實例對一個在這項技術上有經驗的人來說，只需稍微考慮一下上述說明就會十分明瞭的。因此，我們的意圖是這些說明和所有舉例僅僅被看作是一個范例，而該發(fā)明真正的包括范圍和實質在下面的權利要求
書中有具體說明。
例1.
YM三角瓶的種子是從48小時的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物放在30℃的旋轉搖床就開始。大約24小時后，把這個種子接種到一個含有以3%水解淀粉作為碳源的E1培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)基也放在旋轉搖床上30℃培養(yǎng)。大約72小時后，可以看到，三角瓶中有粘狀液出現(xiàn)，當加入2倍體積的99%異丙醇后，可以見到一種纖維狀沉淀出現(xiàn)。
E1培養(yǎng)基含有5克磷酸氫二鉀，0.1克硫酸鎂，0.9克硝酸銨，0.5克的Promosoy 100(CSCD公司所售大豆粉酶解物)，30克D-葡萄糖，加1升自來水。E1培養(yǎng)基pH為7.6-7.8。
如上方式準備另一個YM種子三角瓶，用為在24小時后五個含有不同培養(yǎng)基的三角瓶接種的種子，接種后把它們放置在旋轉搖床上，30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)約72小時，此時測定其pH，粘度，膠產量，產物粘度，所得結果列于表4。
最終培養(yǎng)基中的濃度(PPm)H3BO30.05B3+Mnel2·4H2O 0.5Mn2+Feso40.5Fe2+Cucl20.01Cu2+Zncl20.02Zn2+Cocl2·6H2O 0.01Co2+Na2MoO4·2H2O 0.01Mo+6酒石酸鈉 1.8如上面這些結果所示，最佳生長培養(yǎng)基是含有3%水解淀粉和全鹽液的E1培養(yǎng)基。
例2這個示例提供了一個大量制備雜多糖S-657的發(fā)酵步驟。
在一個含有100毫升YM肉汁培養(yǎng)基(Diflo公司)的500毫升埃氏三角瓶中接入一整環(huán)在營養(yǎng)瓊脂平板上生長48小時的S-657菌株細胞。該三角瓶放置在旋轉搖床上，振搖速度400轉/分，溫度30℃搖瓶培養(yǎng)24小時。1%的接種物接入到二個每個內含100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升埃氏三角瓶中。種子培養(yǎng)基成分是葡萄糖 3%K2HPO40.5%NH4NO30.09%MgSo4·7H2O 0.01%Promosoy 100 0.05%
全鹽溶液 1毫升/升這個培養(yǎng)基用自來水配制。全鹽溶液的制備是把下列這些成分加到1升的去離子水或蒸餾水中H3BO3285毫克MnCl2·4H2o 1800毫克Feso41360毫克Cucl226.9毫克ZnCl220.8毫克CoCl240.4毫克Mg2MoO4·2H2o 25.2毫克酒石酸鈉 1770毫克這些三角瓶在旋轉搖床上培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉速400轉/分，培養(yǎng)24小時，此時，把它們接種到一個五升的發(fā)酵罐中，該罐中含有終體積為3000毫升的同樣成分的培養(yǎng)基，發(fā)酵過程控制在30℃，通氣速度為1升/分，開始時攪拌速度為400轉/分，然后攪拌速度加快，以保證良好的混合效果。大約24小時后，將大約2.5升這個種子再接種到70升發(fā)酵罐中，該發(fā)酵罐含有終體積為50升的下面這些物質的培養(yǎng)基葡萄糖 3.0%K2HPO40.05%NH4NO30.09%MgSO4·7H2O 0.01%Promosoy 100 0.05%全鹽溶液 1毫升/升
Fe++1PPmSag5691(一種由聯(lián)合碳化物 0.005%公司生產的去泡沫劑)將溫度維持在30℃，通氣速度為10升/分，發(fā)酵進行25小時后通氣速度調節(jié)到20升/分。其后整個發(fā)酵過程一直維持這個通氣速度。利用一個自動的PH值控制系統(tǒng)，按需要通過加入40%氫氧化鉀控制PH大于6.0。攪拌速度起始為300轉/分，25小時后增到500轉/分，48小時后為750轉/分，72小時后為800轉/分。其后整個發(fā)酵過程都維持在800轉/分。下面表5列出這個發(fā)酵結果的數據。
表5菌令 PH 液體粘度 膠產量(克/100毫升) 殘存的碳源0小時 7.0 5厘泊 ND 3.0%25小時 6.5 230厘泊 0.51 ND48小時 6.2 960厘泊 0.80 1.2772小時 6.3 2250厘泊 1.22 0.70116小時 6.2 3550厘泊 1.64 0.24141小時 7.1 4000厘泊 1.63 0.17在整個發(fā)酵過程中總共需要加150毫升的40%氫氧化鉀溶液以控制PH值。將發(fā)酵液在約75℃下加熱15分鐘，然后冷卻到大約30℃。在發(fā)酵液中加三倍體積99%異丙醇。這種多糖化合物以纖維狀物質的形式沉淀下來，用一個篩網很容易將它回收。纖維狀物質在140°F下在加強通氣的盤狀干燥器上干燥2.5小時，然后再把它磨成粉末。
例3通過把某些S-657分離株的生理生化特征與按伯杰氏鑒定手冊(1984)和據ATTC原先所鑒定的28個菌株結果所確定的野油菜黃單胞菌的典型特征相比較，完成了分類學鑒定。結果列于下表6。
表6伯杰氏手冊 ATCC數據 S-657分(1984) 離株七葉苷 + + +來自蛋白胨的硫化氫 + +脲酶 - - -37℃下生長 + + +在0-下培養(yǎng)基中產酸阿拉伯糖 + + +葡萄糖 + + +蔗糖 + + +甘露糖 + + +半乳糖 + + +纖維二糖 + + +果糖 + + +核糖醇 - - -甘露醇 - - -山梨醇 - - -
半乳糖醇 - - -水楊苷 - - -肌醇 - - -菊粉 - - -海藻糖 + 95 -唯一碳源利用乙酸鹽 + 25 +檸檬酸鹽 + + -萍果酸鹽 + + +丙酸鹽 + 5 -琥珀酸鹽 + + +乳酸鹽 + 40 -L-酒石酸鹽 - - -苯甲酸鹽 - - -注數字表示呈陽性的百分率。
例4海水泥漿成分雜多糖S-657可在油井鉆探泥漿中使用。海水泥漿配方和數據如下S-657 1磅海水 1桶(42加侖)Fann 35粘度數據速度(轉/分) 3 6 100 200 300 600刻度顯示(f1.0跳動) 7.8 8.4 12.4 14.8 17.0 22.4
粘度(厘泊) 780 420 37.2 22.2 17.0 11.2例5活水皂土泥漿另一個含有起作用的S-657雜多糖的鉆井用配方如下S-657 1磅皂土 7磅活水 1桶(42加侖)Fann 35粘度數據速度(轉/分) 3 6 100 200 300 600粘度(厘泊) 1160 610 48 28.2 21.6 14.5例6在含鹽體系中溶解性雜多糖可溶于各種含鹽體系中。1磅S-657與1桶(42加侖)的下列水溶液混合，其Fann 35粘度測定如下Fann 35粘度(厘泊)數據轉速(轉/分) 3 6 100 200 300 600活水 1020 540 36.0 19.8 14.6 9.23%Kcl 920 510 42 23.7 17.6 10.415%Nacl 580 320 31.2 16.2 15 9.9
權利要求
1.雜多糖S-657，主要由碳水化合物，約12%蛋白質和7%?；?以0-乙?；嬎?所組成。碳水化合物部分含有約19%葡糖醛酸，中性糖的鼠李糖和葡萄糖，兩種糖的摩爾分子比約為2∶1。
2.微生物野油菜黃單胞菌的生物純培養(yǎng)是ATCC 53159菌株。
3.包含微生物野油菜黃單胞菌ATCC 53159菌株的培養(yǎng)物，所說的培養(yǎng)物通過有氧發(fā)酵可以產生都回收到一定量的雜多糖S-657。
4.用以生產雜多糖S-657的過程，包括將微生物野油菜黃羊胞菌ATCC 53159通過可同化碳源的有氧發(fā)酵;生長在一種液體營養(yǎng)培養(yǎng)基上，以及回收所說的雜多糖S-657。
5.按照權利要求
4的過程，其中可同化的碳源是碳水化合物。
6.按照權利要求
5的過程，其中碳水化合物是水解淀粉。
7.按照權利要求
4的過程，其中營養(yǎng)培養(yǎng)基實際上不含鈣離子。
8.按照權利要求
4的過程生產產品。
9.油井處理液包含水和重量比約為0.01%-1.0%之間的雜多糖S-657。
專利摘要
新型雜多糖S-657是由野油菜黃單胞菌的一個新菌株，ATCC53159，經過發(fā)酵而制備的。它有作為增稠劑，懸乳劑和在水溶液中穩(wěn)定劑有用特性，在油井處理液使用上具有特殊價值。雜多糖S-657主要由碳水化合物，約12％蛋白質和約7％酰基(以0-乙?；嬎?組成。碳水化合物部分含有約19％葡萄糖醛酸，以及中性糖鼠李糖和葡萄糖，兩者的摩爾比約為2∶1。
文檔編號C09K8/90GK86104449SQ86104449
公開日1987年1月21日 申請日期1986年6月27日
發(fā)明者杰里·A·派克, 蘇姍娜·M·斯延伯根, 喬治·T·維德 申請人:麥克公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan