專利名稱:生產(chǎn)肽的方法
本發(fā)明涉及重組體家蠶(Bombyx mori，蠶)核多角體病毒及應(yīng)用這些重組體病毒生產(chǎn)肽的方法。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了利用Bombyx mori蠶體核多角體病毒(BmNPV)來生產(chǎn)肽的方法(見本文末尾所引用的參考文獻(xiàn)之參考文獻(xiàn)1)。
該方法的主要特征包括應(yīng)用重組體DNA技術(shù)，以一種期望的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因置換多角體蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段，以建造一種重組體BmNPV，并使這種重組體在培養(yǎng)的蠶(家蠶，Bombyx mori)體細(xì)胞中或活蠶(家蠶)體內(nèi)繁殖，以便在其中積累期望的蛋白質(zhì)。但是，這種方法在期望的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率方面仍不能使人滿意。
此外，融合的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)也曾在大腸桿菌(Escherichia coli)體中實(shí)施過，但是，其產(chǎn)率也不能說已經(jīng)有了大的增長(zhǎng)(參考文獻(xiàn)2-8)。
本發(fā)明就是關(guān)于一種重組體病毒，即是一種在Bombyx mori家蠶體核多角體病毒DNA的多角體蛋白質(zhì)一個(gè)編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段中，具有所期望的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的重組體蠶核多角病毒，它連接到整個(gè)或部分的多角體蛋白質(zhì)一編碼結(jié)構(gòu)基因中。該等基因之間具有或不具有中間插入的連接子堿序列。
本發(fā)明也是關(guān)于在培養(yǎng)的Bombyx mori家蠶體細(xì)胞中或在活的Bombyx mori的家蠶體內(nèi)，繁殖重組體病毒從而生產(chǎn)融合的蛋白質(zhì)的一種方法。
本發(fā)明還進(jìn)一步是關(guān)于在融合蛋白質(zhì)的連接位點(diǎn)將其分割或分解，從而生產(chǎn)所期望的蛋白質(zhì)的方法。
在本文的附圖中，圖1至圖6通過一個(gè)舉出的實(shí)例，用示意圖表明用于生產(chǎn)重組體病毒的某些質(zhì)粒的建造圖解。
圖7及圖8是所期望的融合蛋白質(zhì)的電泳圖示。
BmNPV是養(yǎng)蠶工作者所廣泛地知道的。T3菌株是由本發(fā)明者所分離來的一種典型的菌株。這種菌株的病毒DNA(BmNPV DNA)已經(jīng)存放于在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其登記號(hào)碼是ATCC 40188。
為了從這種病毒的DNA中分離出含多角體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的一個(gè)區(qū)段，用限制性內(nèi)切酶(EcoRI)的處理來處理是適合的，如參考文獻(xiàn)1所述，其中有一種帶有質(zhì)粒pBmE36的大腸桿菌菌株(E.coli K12JM83 DGB-0036)，而質(zhì)粒中含有病毒DNA的EcoRI-EcoRI片段〔約10.5千堿基(kb)〕，該片段是在EcoRI分裂位點(diǎn)插入到質(zhì)粒中。此種菌株現(xiàn)已存放到日本通商產(chǎn)業(yè)省，工業(yè)科學(xué)與技術(shù)廳，發(fā)酵研究所，登記號(hào)碼是FERM BP-813。
此外正如在參考文獻(xiàn)1所敘述的那樣，當(dāng)應(yīng)用HindⅢ處理pBmE36時(shí)，可得到含有多角體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因而長(zhǎng)度約為3.9千堿基(kb)的片段。然后將此片段插入一市售的質(zhì)粒pUC9〔可由P-L生物化學(xué)藥品公司(Pharmacia P-L Biochemicals)買到〕。隨后的EcoRI分割，Bal31處理(在此，不同長(zhǎng)度的片斷可通過調(diào)節(jié)處理時(shí)間而得到)此及進(jìn)一步的HindⅢ分割，或者用一種相似的方法可提供包括全部或部份多角體蛋白質(zhì)基因的片段。
應(yīng)用一種適當(dāng)?shù)倪B接子(DNA)(參考文獻(xiàn)19)，可將所期望的蛋白質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)基因，連接到整個(gè)或一部份多角體蛋白質(zhì)基因上，而對(duì)所產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)，當(dāng)用一種適當(dāng)?shù)墓ぞ咴谟上鄳?yīng)的連接子堿基順序翻譯成的氨基酸或肽的位點(diǎn)上分割時(shí)，可生成期望的蛋白質(zhì)，然后可用通常的方法將其分離。當(dāng)這種融合蛋白質(zhì)本身就可應(yīng)用時(shí)，自然不需要分割的步驟，在這種情況下;連接子也不需存在。
眾所周知，在相當(dāng)于連接子的肽或氨基酸(連接部份)及用于分割或分解融合蛋白質(zhì)的各種工具之中所包括的分別是異亮-谷-甘-精的序列及能夠分割序列的凝血因子Xa(下面簡(jiǎn)稱“F-Xa”);脯-Ama-甘-脯(其中Ama是任何一種氨基酸)及能夠分割序列的膠原酶;精氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質(zhì)之后的肽鍵的胰蛋白酶;酪氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質(zhì)之后的肽鍵的糜蛋白酶;脯氨酸-精氨酸及能夠分解在融合蛋白質(zhì)之后的肽鍵的凝血酶;色氨酸及能夠分解融合蛋白質(zhì)的N-溴代丁二酰亞胺;以及甲硫氨酸及能夠分解融合蛋白質(zhì)的溴化氰(參考文獻(xiàn)2-10)。連接部份及分割或分解的工具并不限于上述者。許多其他的各種肽的組合物或氨基酸以及各種的化學(xué)的或酶促的方法均可分別用作連接區(qū)段及分割或分解的工具。
較理想的是，所期望的蛋白質(zhì)不含有任何一種氨基酸或肽，而該氨基酸或肽暴露在上述的連接區(qū)段分割或分解的過程時(shí)則會(huì)被分解。但是，限制性地應(yīng)用恰當(dāng)?shù)厥芟拗萍熬徍偷臈l件去分解融合蛋白質(zhì)，則也可能藉此達(dá)到目的。
在此所用的名詞-“期望的蛋白質(zhì)”-可以是一種真核生物蛋白質(zhì)，較好的是一種哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。期望的蛋白質(zhì)的具體例子包括不同的生理活性物質(zhì)及用作診斷試劑的物質(zhì)，例如干擾素(IFNs)，腫瘤壞死因子(TNF)，白細(xì)胞素及其他的淋巴細(xì)胞活素，胰島素，生長(zhǎng)激素及其他的激素，肝炎疫苗，流感疫苗，及各種其他的抗原蛋白類，組織血纖維蛋白溶酶原活性因子(TPA)，促生長(zhǎng)因子，工業(yè)上應(yīng)用的酶例如甾類化合物轉(zhuǎn)化酶、?；D(zhuǎn)移酶，淀粉酶、脂酶等，食物添加劑及飼料添加劑，以及其他種種。在這些物質(zhì)中，有些會(huì)有糖鏈加于其中。按照本發(fā)明，肽是由真核細(xì)胞產(chǎn)生的。當(dāng)應(yīng)用一種由真核生物殖生的基因，肽的生產(chǎn)可經(jīng)歷與發(fā)生在真核生物體內(nèi)相同的一種改性這或多種改性。因此，本發(fā)明所生產(chǎn)的產(chǎn)品與由細(xì)菌生產(chǎn)的產(chǎn)品相比較，可以說是具有較高的效益。
用于這些蛋白質(zhì)的基因編碼，可以是由天然發(fā)生的物質(zhì)分離出的染色體DNAs，也可以是通過天然衍生的mRNAs的中間體制備的cDNAs，由化學(xué)合成的DNAs，或由上述列舉的技術(shù)的適當(dāng)組合(參考文獻(xiàn)18及19)而生產(chǎn)出的DNAs。
假如一種產(chǎn)品在氨基酸順序上與預(yù)期的物質(zhì)在氨基酸順序上有些不同(取代，減少或增加)，但仍然具有所要求的功能(例如生理活性)的話，則可按需要去改變此種影響。例如當(dāng)與上述連接區(qū)段有關(guān)的蛋氨酸被溴化氰分解時(shí)，存在于期望蛋白中的一個(gè)或多個(gè)蛋氨酸殘基可被另一個(gè)氨基酸殘基或其他的氨基酸殘基所置換或被取消。在這種情況下，檢驗(yàn)按照上述的概念而設(shè)計(jì)出的堿序列為基礎(chǔ)所產(chǎn)生的肽，看其活性是否適合所要達(dá)到的目的，這樣做是可取的。
在某些例子中，正如所看到的那樣，一種氨基酸殘基的部份，可以留在期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)品上，例如，在用2-硝基-5-硫氰基苯甲酸來化學(xué)分解半胱氨酸的情況就是如此。在這種情況下，最好也象上述那樣檢驗(yàn)產(chǎn)品的活性，以確定產(chǎn)品是否符合預(yù)定的用途。
以一種堿基序列插入其中的質(zhì)粒(用于重組的質(zhì)粒)，可以應(yīng)用有關(guān)的那些質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶及市場(chǎng)上買得到的其他材料，以慣用的重組體DNA技術(shù)生產(chǎn)出來。這種堿基序列包括Bombyx mori家蠶體核多角病毒DNA(BmNPV DNA)的全部或部份的多角體蛋白質(zhì)基因與一個(gè)期望的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因結(jié)合在一起(有或沒有中間插入的連接子)，它即構(gòu)成一種融合蛋白質(zhì)的基因。這些質(zhì)粒的生產(chǎn)可參考此文后面所述的例子按常規(guī)的方法來實(shí)施。
為了應(yīng)用上述質(zhì)粒來生產(chǎn)重組體病毒，可使一種規(guī)定的Bombyx mori蠶體細(xì)胞株的細(xì)胞，受到用于重組作用的一種質(zhì)粒及BmNPV的混合感染，如果需要的話，接著用空斑方法(Plaque Method，參考文獻(xiàn)11)或稀釋方法(參考文獻(xiàn)12)分離重組體病毒?？梢詰?yīng)用的適合的規(guī)定Bombyx mori蠶體細(xì)胞株中，包括已知的Bm細(xì)胞(在參考文獻(xiàn)1，11及13中所敘述的BM-N細(xì)胞，保藏于ATCC，保藏號(hào)CRL-8910)及保藏于ATCC(保存號(hào)為CRL-8851)的BM-N細(xì)胞。為了在蠶體內(nèi)生產(chǎn)所需要的物質(zhì)，通過將在培養(yǎng)的細(xì)胞中繁殖的病毒(用重組體或非重組體病毒混合物或者從其中分離出的重組體病毒)經(jīng)皮膚法射或注射到蠶體的體腔內(nèi)，或通過口腔將病毒喂入蠶體，而使蠶體受到病毒的感染。然后用人工飼料桑葉飼喂適當(dāng)?shù)奶鞌?shù)，使其積累所期望的融合蛋白。通常，融合蛋白質(zhì)不溶于水而懸浮于蠶體體液內(nèi)，而可用慣用的方法如色層層析法(離子交換樹脂層析，親合層析，膠體滲透層析，等等)，離心法、萃取法等等進(jìn)行分離或純化。
當(dāng)將蠶體磨碎并與溶劑〔例如十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液，尿素水溶液，強(qiáng)堿水溶液等等〕混合或與這些溶劑一起磨碎時(shí)，可用上面敘述的方法從溶液中將融合蛋白質(zhì)分離或純化。當(dāng)要將融合蛋白質(zhì)分割時(shí)，其分割/分解的步驟可按上面敘述過的方法來進(jìn)行。
下述的實(shí)例中〔在這些例子中期望的蛋白是胰島素相似物生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ)及α-干擾素〕用作進(jìn)一步說明本發(fā)明。但是，必須指出，這些例子決不是意圖限制本發(fā)明范圍。質(zhì)粒建造的示意圖在圖1-5中作了描述。除非有其他的說明，按照通常的慣例，DNA序列的5′末端(上行)表示于左側(cè);而3′末端(下行)則表示于右側(cè)。
多角體蛋白質(zhì)基因，用于生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)基因，及用于生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)的基因的合成、分割、篩選、分離及其他處理，可應(yīng)用在參考文獻(xiàn)1中所敘述的技術(shù)，以及常規(guī)應(yīng)用的基因操作技術(shù)(參看例如參考文獻(xiàn)18及19)來進(jìn)行。
實(shí)例1
A.脫除多角體基因的質(zhì)粒的建造用EcoRI分割質(zhì)粒pBmE36(參考文獻(xiàn)1)，并用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)在dNTPs(四脫氧核苷三磷酸類)存在下，使分割產(chǎn)物變成平整末端(blunt ended)。用HindⅢ部份消化，接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到含多角體基因片段。應(yīng)用T4連接酶，使此片段與由EcoRI分裂pUC9而制備的pUC9片段相連接(pUC9可由P-L生化藥品公司買到)，應(yīng)用Klenow片段使分割產(chǎn)品末端整平，并進(jìn)一步用HindⅢ使之分割以生成一種連接產(chǎn)物。所得到的連結(jié)產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12JM83。然后回收質(zhì)粒接并命名為p9BmE36，(參考資料19中敘述了上述方法)。
由活體外的突變，將一種EcoRV識(shí)別位點(diǎn)及一種Aat Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)分別引進(jìn)p9BmE36的起始密碼子ATG的位點(diǎn)及終止密碼子TAA的位點(diǎn)(參考文獻(xiàn)14)。于是在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓存在下，以脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)來處理p9BmE36，以生產(chǎn)一種具切斷口的質(zhì)粒(參考文獻(xiàn)14)，然后此種質(zhì)粒再與下面兩個(gè)化學(xué)合成的DNA片段退火(annealing)。
接著用聚合酶Ⅰ及T4連結(jié)酶處理，而生成異源雙鏈質(zhì)粒，此質(zhì)粒隨后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12JM83。為了得到所希望的突變體，再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化作用。這樣就得到了一種p9BmM36的質(zhì)粒。
為了從p9BmM36上脫下多角體基因及插入聚連接子，用化學(xué)方法合成下面兩個(gè)片段(每個(gè)片段為38個(gè)單體)CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG 和CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG這兩個(gè)片段是互相輔助的，并有Sac Ⅰ，SmaⅠ，EcoRI，NcoⅠ，EcoRV及XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。
應(yīng)用T4激酶分別將上述兩個(gè)片段在5′末端磷酸化，然后一起退火。在T4連接酶存在下，退火的產(chǎn)物與用EcoRV及AatⅠ分割p9BmM36所得到的而沒有多角體基因的片段相連接。這一步驟結(jié)果使BglⅡ識(shí)別位點(diǎn)及AatⅠ識(shí)別位點(diǎn)分別在連接子的5′側(cè)及3′側(cè)形成，由此而產(chǎn)生的質(zhì)粒用作轉(zhuǎn)變大腸桿菌K-12JM83，然后將其回收及命名為pBMO30。
現(xiàn)將pBMO30的DNA序列及在pBMO30的聚連接子區(qū)段上的分裂位點(diǎn)，與p9BmE36的多角體基因區(qū)段的對(duì)比，表示如下
B.具有部份缺陷的多角體基因的質(zhì)粒的建造應(yīng)用EcoRI分裂質(zhì)粒p9H18(參考文獻(xiàn)1)，然后以Bal31處理，從而削去分裂位點(diǎn)每邊的一部份。由于用Bal31處理的時(shí)間不同，產(chǎn)生了不同長(zhǎng)度的片段。用HindⅢ處理這些片段并經(jīng)0.7%瓊脂糖膠電泳分離，然后經(jīng)過萃取，即可得到不同長(zhǎng)度的病毒衍生的DNA片段。
用SmaⅠ及HindⅢ處理質(zhì)粒pUC9，接著將先前得到的DNA片段(具有一個(gè)平整末端及一個(gè)HindⅢ末端)相連接。應(yīng)用由此而生成的質(zhì)粒，將大腸桿菌K-12JM83轉(zhuǎn)變?nèi)缓笊L(zhǎng)?；厥召|(zhì)粒，應(yīng)用一種引子(M13的15-堿基序列的引子)，以二脫氧法(dideoxy method，參考文獻(xiàn)15)由每個(gè)病毒殖生的插入物DNA片段的3′側(cè)，檢驗(yàn)堿基順序，由此鑒定病毒多角體基因區(qū)段，從而在病毒殖生的DNA片段的堿基順序中，發(fā)現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)于Serebryani等人(參考文獻(xiàn)16)所敘述的多角體蛋白質(zhì)的氨基酸順序的堿基順序。翻譯的起始密碼子ATG及終止實(shí)碼子TAA也得到鑒證。
由于Bal31的處理時(shí)間長(zhǎng)短，所得到的不同的質(zhì)粒(p9B系列質(zhì)粒)之中，從失去多角體基因的翻譯始密碼子ATG，具下行的212堿基對(duì)，338堿基對(duì)，662堿基對(duì)及727堿基對(duì)的那些質(zhì)粒，分別被命名p9B240，p9B120，p8B115及p9BO86。多角體基因的長(zhǎng)度為738堿基對(duì)，其中包括終止密碼子TAA。
123 40ATGCCGAATT ATTCATACAC CCCCACCATC GGGCGTACTTACGTGTACGA CAATAAATAT TACAAAAACT TGGGCTGTCTTATCAAAAAC GCCAAGCGCA AGAAGCACCT AGTCGAACATGAACAAGAGG AGAAGCAATG GGATCTTCTA GACAACTACATGGTTGCGCA AGATCCCTTT TTAGGACCGG GCAAAAACCA
GATACCATGA AGTTAATCGT CAACTGGAGC GGCAAAGAGTTTTTGCGTGA AACTTGGACC CGTTTTGTTG AGGACAGCTT
GTCGCCAACC TCAAACCCAC ACGCCCCAAC AGGTGCTACAAGTTCCTCGC TCAACACGCT CTTAGGTGGG AAGAAGACTACGTGCCCCAC GAAGTAATCA GAATTATGGA GCCATCCTACGTGGGCATGA ACAACGAATA CAGAATTAGT CTGGCTAAAAAGGGCGGCGG CTGCCCAATC ATGAACATCC ACAGCGAGTACACCAACTCG TTCGAGTCGT TTGTGAACCG CGTCATATGGGAGAACTTCT ACAAACCCAT CGTTTACATC GGCACAGACT
TTTCAAAATA AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC
C.由多角體蛋白質(zhì)及α-干擾素組成的融合蛋白質(zhì)基因的建造用Sma Ⅰ分裂pIFN2B310(參考文獻(xiàn)1)，用瓊脂糖凝膠電泳分離α-IFN-J片段。應(yīng)用T4連接酶使此片段與經(jīng)Sma Ⅰ-分割的pBMO30相連接。生成的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)變大腸桿菌K-12JM83。重組體質(zhì)粒被命名為pBT310，經(jīng)證實(shí)，其中α-IFN-J基因是在正確的方位插入。
以Bgl Ⅱ分裂pBT310，用Klenow片段在dNTPs的存在下使分裂產(chǎn)品變成平整末端，然后用Sca Ⅰ分割。以瓊脂糖凝膠電泳分離含有α-IFN-J基因的片段。
用EcoRI及Sca Ⅰ分割p9BO86，用瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因的片段，應(yīng)用S1核酸酶使此片段產(chǎn)生末端平整，并應(yīng)用T4連接酶使此片段與上述含有α-IFN-J基因的片段連接。用生成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12JM83。然后，用二脫氧方法證實(shí)應(yīng)用此方法得到的質(zhì)粒的連接區(qū)段的DNA順序是正確的。此種質(zhì)粒命名為pIFNFO86。
連接部份的DNA順序是
D.用于由胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ)及多角體蛋白質(zhì)所組成的融合蛋白質(zhì)的基因的建造。
將由大腸桿菌K12 MC1016 IGF001(FERM BP-932)回收得到的質(zhì)粒pIGF001用Sal Ⅰ分割。在dNTPs的存在下，用Klenow片段使分裂的產(chǎn)品末端平整，并用Ava Ⅱ分割之，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離含IGF-Ⅰ基因的片段。
分別用EcoRV及Sac Ⅰ分割pBMO30。
可以看到，在融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，必須將氨基酸順序異亮-谷-甘-精導(dǎo)入多角體蛋白質(zhì)及IGF-Ⅰ之間，由此，融合蛋白質(zhì)可被識(shí)別出并可被凝血因子Xa(F-Xa)分割。為此目的，用化學(xué)合成法合成下面兩個(gè)DNA片段ATTGAAGGCAGAG (13單體)GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20單體)這兩條片段是互補(bǔ)的，在退火之后，在上行的一側(cè)形成了一個(gè)可與Sacl分裂末端連結(jié)的粘性末端，而在下行的一側(cè)則形成一個(gè)可與AvaⅡ分裂末端連接的粘性末端。
應(yīng)用T4激酶使這兩條片段的5′末端磷酸化，然后在一起退火，將退火的產(chǎn)物，上述的IGF-Ⅰ片段與上述的分割pBMO30，用T4連接酶使之連接在一起。用此連接的產(chǎn)物使大腸桿菌K-12JM83轉(zhuǎn)變以生成一種質(zhì)粒。用二脫氧方法證實(shí)，在此質(zhì)粒(pIFG-IO30)上的IGF-Ⅰ基因與F-Xa識(shí)別位點(diǎn)之間連接的DNA排列順序是正確的。用BglⅠ分割pIGF-IO30，然后應(yīng)用Klenow片段，在dNTPs的存在下使轉(zhuǎn)變成平整末端，用ScaⅠ分割，含有IGF-Ⅰ基因的片段則用瓊脂糖凝膠電泳分離。
分別用EcoRI及ScaⅠ分割p9B086，并用S1核酸酶使之轉(zhuǎn)變成平整末端，用瓊脂糖凝膠電泳將含多角體基因的片段分離，應(yīng)用T4連接酶將此片段與上述含IGF-Ⅰ基因的片段相連接。應(yīng)用所生成的質(zhì)粒，使大腸桿菌K-12JM83轉(zhuǎn)變，可得到一個(gè)具有由正確的連接構(gòu)造的融合蛋白質(zhì)基的質(zhì)粒，并命名為pIGF-IFO86。連接區(qū)段的DNA順序表示如下
E.由不同長(zhǎng)度的多角體蛋白質(zhì)及IGF-Ⅱ所組成的融合蛋白質(zhì)基因的建造由大腸桿菌K12 MC1061 IGF002(FERM BP-933)回收得質(zhì)粒pIGF002，以Sal Ⅰ部份消化，再用Klenow片段在dNTPs存在下使之變成平整末端，然后用Hae Ⅲ分割，接著用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，由此分離出一條含有IGF-Ⅱ基因的片段。應(yīng)用T4連接酶使此片段與經(jīng)SmaⅠ分裂的pBMO30連接，此連接產(chǎn)物用于大腸桿菌K-12JM83的轉(zhuǎn)變。作為以此方法得到的轉(zhuǎn)變物，它被證實(shí)帶有一個(gè)質(zhì)粒(pIGF-IIO30)，其中由正確方位插入IGF-Ⅱ基因。
用EcoRI部份消化pIGF-ⅡO30，然后用ScaⅠ分割，用瓊脂糖凝膠電泳使含有IGF-Ⅱ基因的片段分離，在T4連接酶的存在下，這一片段與含有一部份多角體基因的片段連接，后者是在用EcoRI及ScaⅠ分割了p9B240，p9B120及p9B115之后用瓊脂糖凝膠電泳分離得到。
應(yīng)用由前面的步驟中所得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)變大腸桿菌K-12JM83。應(yīng)用二脫氧方法測(cè)定DNA排列順序，證實(shí)由生成的轉(zhuǎn)變物所生成的各質(zhì)粒中具有以正確方式建造的各個(gè)融合蛋白質(zhì)基因。
這些質(zhì)粒分別被命名為pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115。
在各個(gè)質(zhì)粒中連接區(qū)段的DNA順序表示如下PIGF-IIF240
實(shí)例2Bm細(xì)胞的轉(zhuǎn)染BmNPV T株病毒DNA(ATTC保藏號(hào)40188)及PIFNF086(摩爾比為1∶100)與溶液Ⅰ和溶液Ⅱ相混合，溶液Ⅰ與Ⅱ分別有下列的組成溶液Ⅰ 蒸餾水 2.1毫升載體DNA(鮭精巢，1毫克/毫升) 50微升BmNPV DNA 10微升pIFNF086 DNA 50微克2M氯化鈣 300微克溶液Ⅱ 50mM HEPES 緩沖溶液(pH7.1) 2.5毫升(含0.28M氯化鈉)磷酸鹽緩沖溶液(35mM Na2HPO4-35mM NaH2PO4) 50微升將生成物懸浮液一份1毫升加入到4毫升的一種Bm細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(含有10%的牛犢胎兒血清的TC-10介質(zhì);參考文獻(xiàn)17)，將此混合物加到Bm細(xì)胞中(ATTC保藏號(hào)CRL-8910，2×106個(gè)細(xì)胞)從而將上述DNA引入Bm細(xì)胞中。20小時(shí)后，換入新鮮的介質(zhì)，經(jīng)過再培養(yǎng)5天后，回收介質(zhì)并離心分離，將上清液進(jìn)行空斑測(cè)定(參考文獻(xiàn)11)，由此回收作為無性繁殖系的重組體病毒。將其命名為vIFNF086。
分別應(yīng)用pIGF-IF086，pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115，以上述同樣的方法取得重組體病毒無性繁殖系，vIGF-IF086，vIGF-IIF240，vIGF-IIF120及vIGF-IIF115。
實(shí)例3在Bm細(xì)胞中融合蛋白質(zhì)的表達(dá)向Bm細(xì)胞群(ATTC保藏號(hào)CRL-8910，2×106個(gè)細(xì)胞中)加入一種vIFNF086的懸浮液〔5×107空斑單位(pfu)〕，以使其受vIFNF086的感染。卅分鐘后，除去上清液，加入4.5毫升的新鮮介質(zhì)一份并在25℃繼續(xù)培育四天。之后，用離心法(1000轉(zhuǎn)/分，經(jīng)10分鐘)處理培養(yǎng)液得到一種沉淀。將500微升的新鮮介質(zhì)一份加到沉淀中，經(jīng)過5次重復(fù)的冰凍-解凍循環(huán)，離心分離混合物(15，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)，向以此法收集到的沉淀中加入200微升4%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%的巰基乙醇。用5微升的生成物溶液一份作為樣品，進(jìn)行SDS-14%聚丙烯酸酰胺凝膠電泳。
電泳過后，凝膠中可觀察到與所期望的融合蛋白質(zhì)相關(guān)的一條帶。因此，可以應(yīng)用光密度計(jì)來測(cè)量該帶的密度并與每一個(gè)標(biāo)志物的密度相比較(每個(gè)標(biāo)志物帶含有1微克蛋白質(zhì))。這樣測(cè)定的產(chǎn)率是每一毫升第一次得到的細(xì)胞培養(yǎng)液中含有0.3毫克。由于計(jì)算出在此種融合蛋白質(zhì)中IFN部分約占40%(按分子量計(jì))，這一產(chǎn)量在成功的分割及IFN回收后，應(yīng)相當(dāng)于0.12毫克/毫升產(chǎn)率的IFN。當(dāng)該產(chǎn)率與在一份報(bào)告所給出的用于表達(dá)在家蠶體細(xì)胞中的IFN的數(shù)值即5×106單位/毫升(相當(dāng)于0.005毫克/毫升)相比較，是后者的20倍(參考文獻(xiàn)1)。
同上述的同樣方法測(cè)定用vIGF-IF086，vPIGF-IIF240，vPIGF-IIF120及vIGF-IIF115感染Bm細(xì)胞而生產(chǎn)的融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量分別是每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液含0.5毫克，0.1毫克，0.4毫克及0.5毫克，或者當(dāng)根據(jù)含于這些蛋白質(zhì)中的IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ的數(shù)量來表示時(shí)，則分別是0.1毫克/毫升，0.05毫克/毫升，0.1毫克/毫升及0.1毫克/毫升。
實(shí)例4A.在Bm細(xì)胞中的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)向Bm細(xì)胞群(ATTC保藏號(hào)CRL-8910，2×106個(gè)細(xì)胞)中加入vIGF-IIF120懸浮液(5×107空斑單位)，使Bm細(xì)胞受到vIGF-IIF120之感染。卅分鐘后，將病毒除去，加入4.5毫升的新鮮介質(zhì)一份，在25℃繼續(xù)培養(yǎng)4天，并離心分離(1，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)培養(yǎng)液。向離心后收集到的沉淀加入500微升訴鮮的介質(zhì)。在重復(fù)5次冷凍-解凍循環(huán)后，將混合物離心分離(15，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)以取得沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀，溶于0.5%SDS中，經(jīng)高效液體色譜分離〔HPLCTSK凝膠苯基5PWRP〔由東洋曹達(dá)工業(yè)株式會(huì)社(Toyo soda Manufacturing co，Ltd.)生產(chǎn)〕;溶劑系統(tǒng)0.1%三氟乙酸-20-75%乙腈，線性濃度梯度。由此可收集到含有融合蛋白質(zhì)的液分2毫升。
B.用溴化氰(BrCN)分割向此含融合蛋白質(zhì)的液分加入50微升的1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，將混合物濃縮至干，并將濃縮物溶于50徵升的蒸餾水中。取此溶液15微升并向其中加入35微升的甲酸及45微升70%的甲酸，接著進(jìn)一步加入含有溴化氰溶液(200微摩爾/毫升)的70%的甲酸5微升。在室溫下反應(yīng)24小時(shí)后，將反應(yīng)混合物濃縮至干，將濃縮物溶于7.5微升的蒸餾水中，并將此溶液電泳，檢測(cè)出有一相當(dāng)于IGF-II的帶。
從而，用十二烷基硫酸鈉水溶液萃取受vIGF-IIF120感染的Bm細(xì)胞，并接著用高效液相色譜進(jìn)行部份純化而取得的液份，在十二烷基硫酸鈉-16%聚丙烯酰胺凝膠電泳中，得到相當(dāng)于由多角體蛋白質(zhì)(部份)及IGF-II組成的融合蛋白質(zhì)的一條約23K帶，而溴化氰分解產(chǎn)物則顯示約7K的帶(相當(dāng)于IGF-II)與幾條在10-14K的帶一起，估計(jì)可能是由于多角體蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物所致(見圖8;其中A是標(biāo)志物，B是融合蛋白，C是溴化氰分解產(chǎn)物)。
C.IGF-IP的N-末端的確定應(yīng)用類似于上面所敘述的方法，從50毫升受vIGF-II120感染的Bm細(xì)胞的培養(yǎng)液中取得的20毫克融合蛋白質(zhì)，用溴化氰分割此融合蛋白質(zhì)，并濃縮此反應(yīng)的混合物。
將此濃縮物溶于5毫升200毫摩爾的吡啶-醋酸緩沖液中(pH3.0)，用桂色譜〔SP-Toyopearl(東洋曹達(dá)工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn));溶劑體系200毫摩爾吡啶-醋酸緩沖液(pH3.0)-2.0M吡啶-醋酸緩沖液(pH5.0)，線性濃度梯度〕進(jìn)行分離。從而收集含有IGF-II的液份。將此液份冷凍干燥后溶于蒸餾水中，并使之經(jīng)過高效的液相色譜〔HPLC0DS-120T(東洋曹達(dá)工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn));溶劑體系0.1%三氟醋酸-10-65%乙腈，線性濃度梯度〕。所得到的純IGF-II經(jīng)過測(cè)定其肽順序排列〔470A蛋白質(zhì)定序器(由Applied Biosytems生產(chǎn))〕。由此確定IGF-II的氨基末端氨基酸排列順序表示于下Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly GluLeu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp ArgGly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser實(shí)例5A.在Bm細(xì)胞中融合蛋白質(zhì)的表達(dá)從大腸桿菌K12 MC1061 IGF001(FERM BP-932)中回收質(zhì)粒pIGF001，并用Sal Ⅰ分割。應(yīng)用Klenow片段在dNTPs的存在下使分割的產(chǎn)物變成平整末端并用Ava Ⅱ分割，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將含有IGF-Ⅰ基因的片段分離。
分別用EcoRV及EcoRI分割pIGF-IIF120以除去含IGF-II基因片段。
可以看出，在制備融合蛋白質(zhì)時(shí)，必須將氨基酸順序甘-脯-丙重復(fù)地引至多角體蛋白質(zhì)與IGF-Ⅰ之間，因而使融合蛋白質(zhì)可被膠原酶所識(shí)別及分割，這種酶識(shí)別氨基酸順序脯-Ama-甘-脯(Ama是指任何一種氨基酸)并在Ama與甘氨酸之間分割。為此目的用化學(xué)方法合成下面兩個(gè)DNA片段
(54單體)GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC(53單體)這兩個(gè)片段是互補(bǔ)的，在退火以后，在上行一側(cè)形成一個(gè)可與EcoRI分裂末端相連接的粘性末端，而在下行一側(cè)則形成一個(gè)可與Ava Ⅱ分裂末端相連接的粘性末端。
應(yīng)用T4激酶使這兩個(gè)片段各在5′末端磷酸化，然后在一起退火。用T4連接酶使退火的產(chǎn)物，上述的IGF-Ⅰ片段與上述的分割的pIGF-IIF120連接在一起。用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變大腸桿菌K-12JM83，以產(chǎn)生一種質(zhì)粒并命名為pIGF-IF120。用二脫氧法斷定DNA的排列順序，得知在此質(zhì)粒中的IGF-Ⅰ基因與膠原酶識(shí)別位點(diǎn)之間的連接是正確的。連接區(qū)段的DNA順序可表示如下
應(yīng)用pIGF-IF120，并使用與實(shí)例2中所敘述的相類似的方法，可取得重組體病毒vIGF-IF120。
應(yīng)用在實(shí)例4(a)中所敘述的相似方法，用vIGF-IF120感染Bm細(xì)胞，將從50毫升培養(yǎng)液收集的Bm細(xì)胞冷凍-解凍之后，離心該細(xì)胞(15，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)以取得沉得沉淀。將沉淀溶于6M鹽酸胍溶液中并離心分離(15，000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)以除去殘余物。將溶液用蒸餾水滲析，用離心法收集所生成的沉淀(15，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)。
B.用膠原酶分割將由上面步驟中取得的沉淀溶于800微升的10M尿素溶液中，接著加入200毫摩爾的氯化鈣100微升，250毫摩爾的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)200微升及膠原酶溶液900微升〔由兩格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical co.)生產(chǎn)〕(1，500單位/毫升)。在40℃培育兩小時(shí)之后，離心此混合物(15，000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)以收集上清液，將此上清液進(jìn)行離子交換色譜分析〔DEAE-Toyopearl(由東洋曹達(dá)工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn);溶劑體系25毫摩爾的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)〕。由此收集到含有IGF-Ⅰ而在其氨基末端有額外的氨基酸殘基(以下簡(jiǎn)稱為“IGF-IP”)的液份。
C.IGF-IP的N-末端的鑒定將含有IGF-IP的液份濃縮，并將濃縮物進(jìn)行高效液相色譜分析〔HPLC∶RPSC，由貝克曼公司(Beckman co.)生產(chǎn);溶劑體系0.1%三氟乙酸-10-65%乙腈，線性濃度梯度〕。將所得到的純IGF-IP經(jīng)過肽定序鑒定〔470A蛋白質(zhì)定序器(由Applied Biosystems生產(chǎn))〕，結(jié)果顯示膠原酶在所期望的位點(diǎn)分割融合蛋白質(zhì)，由此確定的IGF-IP的氨基末端氨基酸序列表示如下Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu實(shí)例6在蠶類(家蠶)體中多角體-IGF-Ⅰ融合蛋白質(zhì)的表達(dá)將vIGF-IF086的懸浮液經(jīng)皮注射到5齡1天的蠶(家蠶)體中，其劑量為0.5毫升/只(107空斑單位)然后在25℃下以桑葉喂食3天。再用收集針插入腹肢，將所收集的體液放入一個(gè)冰凍的Eppendorf管中。離心該體液(15，000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)，將沉降物溶于4%十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%巰基乙醇混液200微升中，并將2微升的生成溶液一份作為樣本進(jìn)行SDS-14%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后在凝膠上有一條與融合蛋白質(zhì)相應(yīng)的帶。因此，用光密度計(jì)測(cè)定此帶的密度并將之與每一標(biāo)志物的密度相比較(每一標(biāo)志物含有1微克蛋白質(zhì))。這樣測(cè)定出的產(chǎn)率為5毫克/毫升體液。(以分子量為基礎(chǔ)計(jì)算表明，在IGF-Ⅰ從融合蛋白質(zhì)中分離之后，IGF-Ⅰ可能的回收率為1毫克/毫升)。
在SDS-14%聚丙烯酰胺凝膠電泳中，從受BmNPV-T3株感染的家蠶所得到的體液，大約在相應(yīng)于多角體蛋白質(zhì)的30K處顯示出一清晰的帶，然而從經(jīng)vIGF-IF086感染的家蠶體液中卻沒有顯示出相應(yīng)于多角體蛋白質(zhì)的任何帶，但卻顯示一條由多角體蛋白質(zhì)及IGF-Ⅰ組成的融合蛋白質(zhì)的特征的約36K帶(見圖7其中A是標(biāo)志物，B是受vIGF-IF086感染的體液而C是受BmNPV-T3感染的體液)。
應(yīng)用于上述各個(gè)實(shí)例中的IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的每一個(gè)合成基因，與相應(yīng)的氨基酸序列表示如下IGF-ⅠGly Pro Glu Thr Leu Cys Gly┄TCGAATTC ATG GGT CCA GAA ACC TTG TGT GGTAla Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val CysGCT GAA TTG GTT GAC GCT TTG CAA TTC GTT TGTGly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro ThrGGT GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACT
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro GlnGGT TAC GGA TCC TCT TCC AGA AGA GCT CCA CAAThr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg SerACT GGT ATC GTC GAT GAA TGT TGT TTC AGA TCTCys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys AlaTGT GAC TTG AGA AGA TTG GAA ATG TAC TGT GCTPro Leu Lys Pro Ala Lys Ser AlaCCA TTG AAG CCA GCT AAG TCT GCT TAG TCGACTGIGF-IIAla Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu-AATTC ATG GCT TAC AGA CCA TCT GAA ACC TTGCys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln PheTGT GGT GGT GAA TTG GTC GAC ACC TTG CAA TTCVal Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser ArgGTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTT TCC AGAPro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg GlyCCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGA TCC AGA GGTIle Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys AspATC GTC GAA GAA TGT TGT TTC AGA TCC TGT GACLeu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr ProTTG GCT TTG TTG GAA ACT TAC TGT GCC ACC CCAAla Lys Ser GluGCC AAG TCC GAA TAG┉
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權(quán)利要求
1.一種重組體病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段中，具有期望的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的一種重組體家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒，將所述基因連接到全部或部份的多角體蛋白質(zhì)一編碼結(jié)構(gòu)基因上，它們之間有或者沒有插入連接子堿基序列。
2.一種生產(chǎn)肽的方法，它包括，建造一種重組體病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段中，具有所期望的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的一種重組體核多角體病毒，將上述基因連接到全部或部份的多角體蛋白質(zhì)-編碼結(jié)構(gòu)基因上，它們之間有或者沒有插入連接子堿基序列，以及繁殖所述的病毒，以生產(chǎn)出一種融合蛋白質(zhì)，此種融合蛋白質(zhì)含有所述的期望蛋白質(zhì)及全部或者部份多角體蛋白質(zhì)，它們之間以插入或者不插入連接的氨基酸或者肽相連接。
3.一種生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)的方法，它包括，建造一種重組件病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質(zhì)-編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段中，具有期望蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的一種重組體家蠶核多角體病毒，將所述基因連接到全部或部份多角體蛋白質(zhì)-編碼結(jié)構(gòu)基因上，其間插入或沒有插入連接子堿基序列，繁殖所說的病毒，以生產(chǎn)一種融合蛋白質(zhì)，此種蛋白質(zhì)含有所述的期望蛋白質(zhì)及全部或部份的多角體蛋白質(zhì)，它們之間以插入或沒有插入連接的氨基酸或肽相連接，然后在其連接位點(diǎn)，分割上述融合蛋白質(zhì)，以生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)。
4.一種質(zhì)粒，它含有5′-上行堿基序列，其中包括家蠶(Bmobyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的啟動(dòng)區(qū)段，全部或部份BmNPV DNA的多角體蛋白質(zhì)-編碼結(jié)構(gòu)基因，選擇性的一種連接子堿基序列，一種期望的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因(選擇性地包括期望蛋白質(zhì)的終止區(qū)的一種堿基序列)，及含有一種3′-下行的堿基序列(包括上述BmNPV DNA的終止區(qū)段)。
5.一種生產(chǎn)重組體家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA的方法，其中包括共轉(zhuǎn)染一種培養(yǎng)的家蠶細(xì)胞系或者帶有家蠶核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的家蠶的一種品系，以及一種質(zhì)粒，質(zhì)粒中含有5′-下行堿基序列，其中包括家蠶核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的啟動(dòng)區(qū)段，BmNPV DNA的全部或部份的多角體蛋白質(zhì)-編碼結(jié)構(gòu)基因，選擇性的一種連接子堿基序列，一種期望的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因(選擇性地包括期望蛋白質(zhì)的終止區(qū)的一種堿基序列)，及含有上述BmNPV DNA的終止區(qū)段的一種3′-下行堿基序列。
專利摘要
提供一種重組體病毒，即在家蠶核多角體病毒DNA的多角體蛋白質(zhì)一編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)段中，具期望的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的重組體家蠶核多角體病毒，所述基因與全部或部分多角體蛋白質(zhì)一編碼結(jié)構(gòu)基因連接，其間插入或不插入連接子堿基序列。在蠶體或蠶體的衍生細(xì)胞中繁殖上述病毒，生產(chǎn)一種由期望的蛋白質(zhì)及全部或部分多角體蛋白質(zhì)結(jié)合成的融合蛋白質(zhì)，當(dāng)其結(jié)合時(shí)，插入或不插入連接子氨基酸或肽。所期望的蛋白質(zhì)由在連接位點(diǎn)上分割或分解融合蛋白質(zhì)而得到。
文檔編號(hào)C12R1/91GK86107784SQ86107784
公開日1987年6月3日 申請(qǐng)日期1986年11月14日
發(fā)明者前田進(jìn), 古澤滿, 丸本恭正, 堀內(nèi)正, 佐藤嘉生, 佐伯欣之 申請(qǐng)人:第一制藥株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan