專利名稱:直接將dna插入質體和線粒體的制作方法
本發(fā)明是一種定向的直接將基因轉移到植物細胞原生質體中的質體或線粒體，特別是葉綠體中的一種方法。對本發(fā)明來說，植物是進行光合作用的單細胞或多細胞的有機體。植物細胞原生質體是用纖維素酶部分或全部處理細胞壁物質轉變而成的植物細胞。
葉綠體成為某些類除草劑的目標，例如三嗪除草劑。近來發(fā)現(xiàn)，阿特拉津(Atrazine)，一種三嗪類除草劑，作用于稱為psb A的葉綠體基因(Hirschberg等，1984)所編碼的32千道爾頓(Kd)的多肽。psb A的編碼區(qū)中的一個單核苷酸的取代導致在32Kd多肽中的一個氨基酸的取代，從而賦予對阿特拉津的抗性。在雜草中發(fā)生這種突變的有，例如綠穗莧和龍葵。
能直接引進基因到植物，特別是農(nóng)作物的質體和線粒體的基因組中去，是人們的宿愿。這樣將能引進新的基因和所期望的特征到所希望的植物中去。例如，賦予除草劑抗性基因，為了在對除草劑敏感的葉綠體中產(chǎn)生除草劑抗性是必要的。
至今，為了得到對在葉綠中具活性的除草劑的抗性或耐性，人們已開始操作植物細胞核的染色體組。但是，這樣一種策略，僅付與對這些除草劑以耐性而不是真正的抗性。還不能通過直接的基因轉移使作物具有對葉綠體作用的真正抗性。因此，也不能認為用這種方法能夠轉化諸如葉綠體的質體。
引進一個具有期望特征的基因，例如除草劑抗性到植物核染色體組的另一個缺點，是由于這種抗性也通過授粉引入了某些雜草。這種雜交將提供將所期望的特征引進雜草中去的機制。
為引進基因到植物細胞核染色體組中去的最普遍的方法是，用致病菌侵染細胞，例如含有Ti質粒載體系統(tǒng)的土壤桿菌屬(農(nóng)桿菌屬)(Agribacterium)(Barton等，1983，Chilton等，1985)。
這種方法由于侵染而受到損害。其缺點包括限于宿主的特異性和必須將轉化的植物細胞與用于轉化程序的病原分開。在環(huán)境中釋放這種病源菌已引起關注(Roberts，1985)。
De Block等(1985)報導利用土壤桿菌屬Ti質粒載體系統(tǒng)將一個編碼抗生素抗性基因引進能夠再生整個細胞和完整植物的煙草原生質體的葉綠體基因組。然而這些研究者發(fā)現(xiàn)在無抗生素存在的情況下，基因是不穩(wěn)定的，并且在很短的時期內便消失了。只有在抗生素選擇的情況下，植物才能保持引進的基因，因此沒有實際的應用價值。
直接地以缺口線狀或環(huán)狀質粒DNA轉化植物細胞原生質體的方法也是眾所周知的(Pasz-Kowski時，1984;Schilperoor等1983)。這種方法無需用病源菌侵染植物細胞，然而到目前為止，這種方限于對核的轉化。
為了能夠授與植物細胞有利的新的性質，而不用病源菌侵染防止這種性質被轉移到雜草中去，需要一種允許直接轉移有用基因進入質體和線粒體基因組的方法。更進一步需要一種能直接將基因穩(wěn)定地轉移到植物細胞的質體和線粒體以及整個植株的方法，以使在田間作物生長發(fā)育期間，基因能穩(wěn)定地表達而不致丟失。
因此，本發(fā)明的主要目的，是提供一種直接將基因引進維持在質體和線粒體，特別是葉綠體中，而不用病源侵染的方法。本發(fā)明的進一步目標是產(chǎn)生含有遺傳工程組建的質體或線粒體，能穩(wěn)定地維持和表達引進性狀的植株。
這個和另一個目標從下面說明中可以看到，由于提供一個將在質體或線粒體中含有一個或多個在質體或線粒體中具有功能的啟動子的基因的DNA，直接引入植物細胞質體或線粒體的程序，這程序包含暴露DNA于在培養(yǎng)基中的原生質體，給予一個充分的時間，讓DNA滲入原生質體和原生質體中的質體或線粒體，而無需將原生質體暴露于病源菌。
圖1是概述構建質粒pCAT°和p32CAT的步驟程序方框圖。
圖2是概述構建質粒pUCHl的步驟的程序方框圖。
圖3是概述構建質粒pBRCAT步驟的程序方框圖。
圖例X＝XhoⅠS＝SmaⅠH＝HindⅢB＝BamHⅠRⅠ＝EcokⅠSl＝SalⅠLⅠG＝T4DNA連接酶的連接作用X/S1指示一個Xhol位點連接在一個SalⅠ位點的一個兩種酶都不能酶切的雜交位點。
CAT表示氯霉素乙酰(基)轉移酶的編碼區(qū)。CAT°表明CAT基因無啟動子的形式。
在圖1～3中，psb A基因用黑色線條指示，它的啟動子用黑色的框表示。
圖1～3中，CAT編碼區(qū)用點表示。
以下定義適用于發(fā)明申請專利的說明書和權利要求
書;
“基因”是包含一個啟動子和一個轉錄序列的DNA序列。啟動子，在大多數(shù)情況下是不能轉錄的，引起伴隨它的基因序列，有些情況下位于它側面的序列，轉錄成RNA。RNA可能或不可能被轉譯成一個多肽。如果RNA被轉譯，則RNA稱為信值RNA(mRNA)。相當于mRNA的DNA序列以及mRNA自身包含一個5′不轉譯的區(qū)域，一個編碼區(qū)域，和一個3′不轉譯區(qū)域。僅編碼區(qū)域。僅編碼區(qū)域是被轉譯成一個多肽。DNA序列的“活性部分”構成DNA序列的功能性部分。一些DNA序列活性部分的例子包括RNA聚合酶的結合位點，一個啟動子轉錄作用開始的信號(TATA盒)，核糖體的結合位點，編碼序列5′不轉譯區(qū)的轉譯開始信號，轉錄終止信號和3′不轉譯區(qū)的聚腺苷作用信號。DNA序列不重要的不同的間隔區(qū)域，可以認為是不具活性的DNA序列。
一個自然DNA序列的“變異體”是執(zhí)行同樣功能的自然序列的修飾形式。這變異體可以是一種突變體，或可能是合成的DNA序列，并且實際上對于相應的自然序列是同源的。如果至少在70%以上，更甚者在80%以上，而最好在90%以上DNA序列活性部分是同源的，那么第一種DNA序列實際上對第二種DNA序列是同源的。如果一個取代另一個構成一個沉默的突變，為了測定實際上同源的目的，那么在編碼區(qū)域的DNA序列中兩種不同的核苷酸永遠不會被認為是同源的。如果存在某種來源的DNA序列，那么DNA序列便是由這種諸如質體或線粒體的來源“衍生”而來，本發(fā)明同樣也包括這樣DNA序列的變異體。
如果某一DNA順序執(zhí)行它所期望的功能并且在質體或線粒體的子代中保持下去的話，那么它在質體中或線粒體中是有功能的。
一個“可被轉化的植物細胞原生質體”意味著通過直接基因轉移后，該原生質體含有一個質體或線粒體的基因組，該基因組包含有在正常情況下在質體或線粒中未被發(fā)現(xiàn)的共價連結的DNA。
通過本發(fā)明的方法，這個可被轉化的植物細胞原生質體可以從培養(yǎng)的細胞中衍生而來。那是附著于植物部分的細胞，或附著于多細胞植物的細胞。這種轉化的植物細胞原生質體也可以由單細胞植物，例如藻類衍生而來。某些單細胞植物的例子包括蘭細菌(cyanobacteria)(例如Synechococcus Spp.)，衣藻屬，和眼蟲藻屬(Euglena)。本發(fā)明優(yōu)先選用的植物細胞原生質體是由多細胞植物衍生而來。轉化以后，原生質體可以再生成植物細胞。
本發(fā)明任何植物的原生質體都可以有它自己的遺傳工程技術得到的質體或線粒體。適合的植物細胞原生質體的一些例子包括茄屬(馬鈴薯)，棉屬，(棉花)，大豆屬(大豆)，矮牽牛屬(矮牽牛)，胡蘿卜屬，(胡蘿卜)，柑桔屬，(橘，檸檬)，番茄屬，(番茄)，蕓苔屬，(蘿卜，甘蘭，花椰菜)，菾菜屬spp.(甜菜)，菜豆屬，(蠶豆)，向日葵屬(向日葵)，落花生屬(落花生)，莧屬，(谷類莧)，苜蓿屬(紫花苜蓿)，車軸草屬，(三葉草)，顛茄屬，(龍葵)，天仙子屬(天仙子)，毛地黃屬spp.(foxglove)，長春花屬(長春花)，豌豆屬(豌豆)，松屬(松樹)。能被轉化的質體包括，例如有色體，淀粉(質)體，白色體(leucoplasts)，白色(質)體(etioplasts)，和葉綠體。對于轉化來說，葉綠體是優(yōu)先選用的質體。
本發(fā)明也包括在質體或線粒體中具有功能的基因。本發(fā)明的基因為引入它的質體和線粒體提供需要和有用的性狀，諸如抗殺草劑，抗抗生素，提高光合效率，使某種辨認生色物質的酶提高活性。殺草劑抗性可以是對任一種在質體或線粒體是有活性的殺草劑，例如，許多殺草劑在葉綠體中是有活性的。這樣的除草劑包括三嗪，尿素，磺酰尿素，和尿嘧啶類的除草劑以及glyphoste〔N-(膦羧甲基)甘氨酸〕(N-phosphonomethy-lglycine)三嗪除草劑的一些例子包括阿特拉津(atrazine)，莠滅凈(ametryn)，嗪草酮(metribuzin)，和西瑪津simazine。尿素除草劑的一些例子包括苯尿除草劑例如亂草隆(diuron)，枯草隆(chloroxuron)和伏草隆(fluormeturon)，以及DCMU(二氯甲基尿素(dichloromethy-lurea))?；酋Ｄ蛩氐囊恍├影∣ust和Glean。尿嘧啶除草劑包括的一些例子如除草定(bromacil)和特草定(terbacil)。這些和另外的除草劑已為Le Baron和Gressel(1982年)所敘述。
為了給細胞上提供除草劑抗性，沒有必要直接將基因轉移到具有編碼除草劑抗性的細胞中所有的大約50到100個葉綠體中去。將基因直接轉移到葉綠體的一個較小部分就已足夠保護這些細胞了。
由于幾方面的理由給與植物除草劑抗性，如有特拉津抗性，是人們所期望的。例如，它允許在耐受該殺草劑的植物用較高濃度該殺草劑，提高了除草劑的濃度也就提高了它殺死雜草的效率。
此外，除草劑抗性可以用作遺傳學上連結比較難于選擇的生理性狀的選擇標記。為了利用這種可能性，構建了一個供體DNA質粒，該質粒含有一個給與除草劑抗性基因和一個別的具有所期望性狀的基因，即第二基因。這第二基因可以給與，例如改善光合作用效率的性狀。這種供體DNA被引進到植物細胞原生質體中，該原生質體可再生成植物細胞培養(yǎng)物，甚至可以再生整株植物。該整株植物既有除草劑抗性的性狀又有第二種性狀。在除草劑存在的情況下種植植物，便可選出那些具有第二種性狀的植物。
此外，在植物葉綠體上引進既有除草劑抗性，又有農(nóng)學上有用性狀的供體DNA，通過在有除草劑存在的情況下載培植物，可以使第二種性狀穩(wěn)定地保留在葉綠體中。De Block等(1985)(見上述)已經(jīng)指明，在葉綠體中的外源基因的不穩(wěn)定性。
除草劑抗性首先指的是對阿特拉津的抗性，它是2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基-1，3，5-三嗪。
可以利用抗生素抗性作為在體外證明細胞含有轉化的質體或線粒體的特定性狀。賦予這種選擇性標記的基因是特別有用的，如果它們在遺傳學上與農(nóng)學有用的性狀連結在一起的話。例如氯霉素，卡那霉素或任何其它抗生素的抗性，原則上都可以這種方法來利用。
為了鑒定含有用遺傳工程得到的質體或線粒體的植物細胞，在組織培養(yǎng)中，一個首先用作篩選標記的性狀是由于引進編碼具有產(chǎn)色物質的酶的基因，例如，如果該酶是β-半乳糖苷酶，那么將植物細胞培養(yǎng)在含有產(chǎn)色底物Xgal(5-氯-4-溴-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的組織培養(yǎng)基質中，含有遺傳工程得到的質體或線粒體的植物細胞由于β-半乳糖苷酶分解Xgal釋放出靛藍染料而被染成藍色。
用于本發(fā)明的基因可以通過先有技術已知的方法得到。這樣一種方法包括分離天然基因或在自然界發(fā)生的質體或線粒體外的基因變異體，天然基因引入這些質體或線粒體。該基因可以是任何天然基因或在質體或線粒體中具有功能的一種基因的變異體。優(yōu)先選用的基因是天然質體，線粒體或細菌的基因，最好的是葉綠體基因。為了保證基因確定在質體或線粒體中。而不是在核中，這是所期望的，但并不是主要的，該基因在核中是非功能的或至少較在質體或線粒體中的功能明顯地差。
天然細菌基因的一些例子包括那些編碼抗生素抗性或具有產(chǎn)色物質酶的基因。能夠賦予質體或線粒體抗生素抗性的一個細菌基因便是氯霉素乙酰轉移酶基因。一個編碼具有產(chǎn)色物質酶的基因是編碼β-半乳糖苷酶的LacZ。質體或線粒體基因的一些例子包括為除草劑抗性或為改善光合作用效率編碼的那些基因。一個能夠賦予除草劑抗性的葉綠體基因是曾為Hirschberg等(1983)所描述過的突變的psb A基因，或一個psb D基因的突變形式(見Rochaix等，1984)。一個賦予改善光合作用效率的葉綠體基因是rbc L的修飾形式，它編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)修飾的大亞基。表達Rubisco大亞基的基因已經(jīng)存在于葉綠體內，而且參于光合作用。然而，可以引進一個具有改善光合作用效率基因修飾的形式突變，工程的或異源的(Jordan等，1981)。
人們通過構建一個嵌合基因(chimeric gene)而獲得在質體或線粒體中具有功能的基因。嵌合基因至少有一部分，最好是其活性部分，在自然界中不與其它部分共價結合。嵌合基因可以是一個RNA轉錄子，或編碼一個多肽。
本發(fā)明的嵌合基因的啟動子可以是任何一個在質體或線粒體中具有功能的啟動子。嵌合基因的啟動子可以從一個質體或線粒體基因衍生，或來自質體或線粒體的異源基因。優(yōu)選的天然質體或線粒體基因的啟動子包括那些從psb A，psb D和rbc L基因衍生來的。啟動子也可以是一個天然啟動子的變異體。本發(fā)明的嵌合基因的異源啟動子可以是一個不發(fā)生在自然界的，質體或線粒體的天然啟動子。因為質體和線粒體基因的功能常常是相似于或與那些細菌基因相同的，所以細菌的啟動子在質體或線粒體中可以具有功能。在質體或線粒體中任何具有功能的細菌啟動子都可用作本發(fā)明的嵌合基因啟動子。一些適合的細菌啟動子，包括那些來自新霉素磷酸轉移酶Ⅱ和來自T-DNA基因的諸如Ti質粒nopaline合成酶基因。
一個異源啟動子也可以是任何部分地或全部地合成的，在質體或線粒體中具有功能的啟動子。部分或整個地合成的啟動子類似于他們的天然物，在轉錄開始區(qū)，有大約10個核苷酸左右的TATAAT類似序列，這種合成產(chǎn)物也包括在本發(fā)明內。
本發(fā)明的嵌合基因5′不轉譯區(qū)可以是任何在質體或線粒體中具有功能的5′不轉譯的區(qū)域。例如，5′不轉譯區(qū)可以從質體或線粒體基因衍生而來，或可以是質體或線粒體異源基因的形式。優(yōu)選的同源5′不轉譯區(qū)是從psb A，psbD或rbc L基因衍生而來。優(yōu)選的異源5′不轉譯區(qū)是那些由細菌衍生而來的。合成的5′不轉譯區(qū)類似于他們的天然物，具有一個有效的核糖體結合位點，它也一并被復蓋在這個發(fā)明之中。
原則上，能賦予植物細胞所期望性狀的任何編碼區(qū)，都適合用作本發(fā)明的編碼區(qū)。從任何上述討論的天然基因衍生來的以及其它來源的編碼區(qū)都可以被用于本發(fā)明的嵌合基因的構建。
同時，本發(fā)明的編碼區(qū)可以由天然質體或線粒體基因衍生而來，可以來源于異源，可以完全或部分地合成，或可以是那樣的兩個或多個編碼區(qū)融合的結構物。每一個編碼區(qū)編碼一條能賦予植物細胞一個或多個新性質的多肽。
天然發(fā)生在一些植物的葉綠體基因所表達的多肽的一個例子，是Hirschberg等(1983)敘述的分子量為32，000道爾頓的多肽的突變型。發(fā)現(xiàn)這種多肽能賦予一些雜草阿特拉津抗性。編碼該多肽的這種psb A基因用本發(fā)明的方法可以轉移到有用的植物，如糧食作物中去。
由異源來源到質體和線粒體的衍生的編碼區(qū)的一個例子，是從植物，動物或細菌的gsh A和gsh B基因以及從谷胱甘肽還原酶(gor)基因而來的，當引進到質體或線粒體時，它能賦予有用的特征。gsh A和gsh B編碼催化谷胱甘肽三肽合成酶，該酶負責許多除草劑的協(xié)同解毒作用(Meister等，1983;Rennenberg，1982)。
由異源來原到質體和線粒體的衍生編碼區(qū)的另一個例子是，來自一種植物，動物，昆蟲，或細菌的谷胱甘肽-S-轉移酶基因的編碼區(qū)。已知一些植物對除草劑阿特拉津是有耐性的。(Shimabukuro，等，1971)，這種耐性是基于谷胱甘肽-S-轉移酶的存在。谷胱甘肽-S-轉移酶通過催化形成阿特拉津谷胱甘肽結合物而達到解除植物毒性。
本發(fā)明的嵌合基因中的另一個有用的編碼區(qū)編碼一個Rubisco更為有效的形式。這樣的編碼區(qū)可由一個天然基因衍生而來。
本發(fā)明的編碼區(qū)也可由兩個或多個不同的編碼區(qū)衍生而來。被那樣編碼區(qū)編碼的多肽稱為融合多肽。
融合多肽的一個例子是一個Rubisco的更為有效的形式。Rubisco有兩個功能，即可作為一個羧化酶和一個氧化酶。羧化酶的功能在光合作用中發(fā)揮，而氧化酶的功能不是所期望的。因此，一個合適的融合多肽應具有大部分羧化酶作用部分和最少的氧化酶作用部分。嵌合基因的3′不轉譯區(qū)或可自然發(fā)生在質體或線粒體基因，或對質體或線粒體基因組是異源的。優(yōu)先選擇的3′不轉譯區(qū)是由質體或線粒體起始點的基因衍生而來。優(yōu)先選擇的3′不轉譯區(qū)是psb A，psb D或rbc L的。
本發(fā)明的基因轉錄區(qū)即是RNA轉錄子。在一些情況其本身就是可用的。這些轉錄子可構成tRNA或rRNA。這個轉錄子也可是一個至少有一部分與另一個RNA轉錄子的序列互補的RNA。這樣一種互補序列，通稱反義序列(anti-sense sequences)，如果足夠長，它可以擾亂與反義序列互補的RNA序列的功能，或且可阻斷來自那個基因的RNA的轉錄作用;參見Pestka等，1984;Melton，1985;Izan等，1984;Simons等，1983，Coleman，1984。
在本發(fā)明中有用轉錄區(qū)可以從天然的轉錄區(qū)衍生而來，或可以整個地或部分地合成。反義序列也可以至少由天然基因的一部分通過相對于它的啟動子的天然基因一部分反向衍生而來。
在本發(fā)明中適合利用的基因，是通過先有技術中的已知方法構建于或插入到克隆的載體質粒中。(Maniatis等，1982)。
為將外源基因整合到植物細胞基因組DNA中去，如果基因位于天然DNA序列(載體DNA)的側面，是有利的。載體DNA可以由兩股線性DNA鏈組成，因此插入到植物細胞的結構是一個線狀的DNA分子。然而為基因轉化作用的結構也可能具有環(huán)狀的構造(質粒的構造)。載體DNA可能是起源于合成，或適當?shù)南拗菩院怂醿惹忻柑幚淼奶烊淮嬖诘腄NA序列獲得。例如用一種或多種對載體DNA合適的限制性核酸內切酶打開的自然存在的質粒。這樣一種質粒的范例是容易獲得的pUC8質粒(Messing等發(fā)現(xiàn)，1982)。天然存在的質粒片段也可用作載體DNA。
用于轉化的部分可以含或不含來自Ti質?；騺碜孕揎椷^的Ti質粒的DNA。如果質粒至少含有T-DNA邊緣區(qū)的一段，那么它便被認為是一個修飾的Ti質粒。一段T-DNA邊緣區(qū)是一段土壤桿菌(農(nóng)桿菌)基因組中的DNA序列，該土壤桿菌使基因組中(T-DNA)一個不同序列被引進到與土壤桿菌接觸的植物細胞中去。T-DNA邊緣區(qū)可以是，例如象一個Ti或Ri質?；蛞粋€修飾Ti或Ri質粒這樣一類載體的序列。T-DNA可以是與邊緣區(qū)相同的載體上的一段序列，或在不同載體上的一段序列。
植物細胞基因轉化作用的可能性可以通過不同的因素而得到加強。相應地，正如從酵母的實驗中得知，成功穩(wěn)定的基因轉化數(shù)增加是隨著1.每個細胞的新基因的拷貝數(shù)的增加，2.當復制信號與新的基因結合的時候，和3.當整合信號與新的基因結合的時候。一個整合信號是促進一股DNA鏈整合到另一股DNA鏈的信號。
當轉移的基因與一個在植物細胞中有效的復制信號或與一個在植物細胞中有效的整合信號結合的時候，或且與兩種信號相結合的時候，本發(fā)明的程序是可以被特殊有利的應用的。
原生質體，細胞培養(yǎng)的細胞，植物組織的細胞，花粉，花粉管，卵細胞，胚囊或合子以及發(fā)育不同階段的胚部是適合作轉化起始材料的植物細胞的代表性的例子。原生質體，由于無需進一步預處理而直接利用，他們可能被優(yōu)先選用。
分離的植物原生質體，細胞或組織可以通過已知的方法或與已知方法相類似的方法獲得。
為了獲得分離的植物原生質體，適合于作為起始材料的分離的植物細胞和組織可以從植物的任何部分，例如，從葉，胚，莖，花，根，花粉得到。分離的原生質體也可以從細胞培養(yǎng)物中獲得。分離原生質體的方法Gamborg等(1975)已作過敘述。
新基因轉移到植物細胞是直接勿需以病源菌，諸如病源及細菌，病毒，真菌來感染細胞，也勿需通過昆蟲或能夠以用轉移病源DNA感染植物的真菌來轉移DNA。這種直接的轉移，通過將基因所含的DNA暴露于一個基質中的植物原生質體來完成的在該基質中基因滲入原生質體，或原生質中的質體或線粒體，只要滲透的時間充分，是可以作到的。轉化的頻率可通過基因轉移的各種技術與這個步驟結合而增加。這種技術的例子包括用聚-L-鳥氨酸，或聚-L-賴氨酸，脂質體融合，DNA-蛋白復合物處理，改變原生質體膜的電荷，與微生物的原生質體融合，或磷酸鈣的共同沉淀等，特別是用某些多元醇如聚乙二醇處理，熱振藻和電擊法(electroporation)，以及后面談及的三種技術結合處理。
適合利用的本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是任何培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中包含特定基因的DNA滲透到原生質體或原生質體中的質體或線粒體。
外源基因和原生質體受體引入的合適溶液，優(yōu)選的是滲透穩(wěn)定的用于原生質體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
已經(jīng)利用的大量的培養(yǎng)基中的個別成分或某些組成成分是不同的。然而所有培養(yǎng)基的成分都與下列原則一致，即它們含一組濃度范圍大約10mg/l到幾百mg/l的無機離子(所以稱為大量元素，例如硝酸鹽，磷酸鹽，硫酸鹽，鉀，鎂，鐵);濃度最大為幾個mg/l無機離子(稱為微量元素，如鈷，鋅，銅，錳);一些維生素(例如肌醇，葉酸，硫胺(素));能源和碳源，例如蔗糖和葡萄糖;和濃度范圍從0.01到10mg/l的天然形式的生長調節(jié)因子或合成的植物生長激素以及細胞激動素類的植物激素。培養(yǎng)基用糖醇(例如甘露醇)或糖(例如葡萄糖)或鹽離子(如CaCl)來維持其滲壓，并且調節(jié)其pH范圍在5.6～6.5之內。
我們將可以找到常規(guī)的培養(yǎng)基更為詳細的敘述，例如在Koblitz等的著作中(1974)。
一個特殊適合于原生質體直接轉化的培養(yǎng)基包括一種能修飾原生質體膜的多元醇，它也用于促進細胞融合。優(yōu)先選用的多元醇是聚乙二醇。較長鏈的多元醇，例如聚丙烯乙二醇(425～4000g/克分子)，其羥基被部分或完全烷基化了的聚乙烯醇或多元醇同樣可以使用。普遍在農(nóng)業(yè)上使用并為植物耐受的多羥去污劑同樣也是適合的多元醇這樣的去污劑在以下的出版物中有敘述
“Mc.Cutcheon′s去污劑和乳化劑年鑒”MC出版集團，Ridgewood，New，Jersey，1981Stache，H.，“Tensid-Taschenbuch”，Carl Henser Verlag，Munich/Vienna，1981優(yōu)先選用的多元醇是具有一個分子量范圍在1000～10，000g/克分子的聚乙二醇，而優(yōu)先選用的是3000～8000g/克分子的。
直接轉化的頻率通過下面更詳細敘述的技術可以得到極大地提高。
在聚乙二醇的處理中，原生質體的懸浮液可加到培養(yǎng)基中。然后將含某基因的DNA，它可以是線狀的或環(huán)狀的質粒，加入到聚乙二醇和培養(yǎng)基的混合液中去。或是將原生質體和含基因的DNA先加入培養(yǎng)基，而后加入聚乙二醇。
在本發(fā)明中的程序中，電擊法和熱振蕩處理也提供了特別便利的技術。
在電擊法，Neuman等(1982)報道，將原生質體轉移到一個滲壓劑中，例如甘露醇/鎂溶液，再將該原生質體懸液放入兩個電極之間的電擊室里。在懸液上方通過電容器放電，原生質體遭受短暫時間的高壓電脈沖的沖擊，因而，原生質體的膜有效的極化，并在膜中打開小孔。
在熱處理中，原生質體被懸在滲透劑中，例如甘露醇/Ca Cl溶液，懸液在小容器中加熱，例如在離心管中，最好是在水浴中。加熱的時間取決于選擇的溫度。一般來說。溫度范圍在40℃到80℃，從一秒到一小時。在溫度40°到50℃，4～6分鐘，特別在45℃，5分鐘可以獲得最佳結果。懸液隨后冷卻到室溫或更低，也曾發(fā)現(xiàn)，鈍化細胞外的核酸酶可以提高轉化頻率。利用為植物可以耐受的二價陽離子可以有效地導致核酸酶失活鈍化，例如鎂或鈣。在高pH值條件下完成轉化，可使失活作用更有效。最適pH范圍為9到10.5。
令人驚奇的是，選用這些不同的方法都大大地提高了轉化頻率，提高轉化頻率，在遺傳工程的領域里，很久以來就是一個奮斗目標。
在基因轉化中轉化頻率越低，在大量的非轉化的克隆中找到由轉化細胞產(chǎn)生的少數(shù)克隆就越困難和越消耗時間。轉化頻率低的地方，利用通常的篩選技術實際是不可能的，除非所用的基因具有選擇標記的功能(例如對特殊物質的抗性。因此，當利用沒有標記功能的基因時。低轉化頻率需要付出大量的時間。
在使用其他技術諸如聚乙二醇處理，電擊和熱振蕩處理之前將外源基因和受體原生質體結合與其它所用步驟的不同順序相比，大大提高了轉化頻率。
由兩個或三個以下的技術組合已經(jīng)證明是很有利的程序聚乙二醇處理，熱振蕩處理，和電擊法，在外源基因和原生質體導入溶液后，使用這些技術可以獲得特別好的結果。在聚乙二醇和任意的隨后的電擊處理之后，首先選用的技術是熱振蕩處理。通常，外加的電擊作用將進一步提高轉化頻率;但在有些情況下熱振蕩和聚乙二醇處理后再經(jīng)電擊作用其結果不再有本質上的改善。
也可以用植物所能耐受的二價陽離子處理在pH9到10.5的情況下上述的各項轉化的原生質體，也就是聚乙二醇處理，熱振蕩和電擊法。
因而，本發(fā)明的程序允許在不利用病源菌為病毒和根癌農(nóng)桿菌，或天然的或為轉化用而修飾的Ti質粒，達到高轉化頻率。
一個優(yōu)選的方法包括，例如，將原生質體轉移到甘露醇溶液，并將原生質體懸液與包含基因DNA的水溶液混合。然后將在這種混合液中的原生質體保溫在45℃，五分鐘，接著冷卻至0℃，10秒以上。保溫后將聚乙二醇(分子量3000～8000)加到混合液中，直到濃度達到1～25%，優(yōu)選的是8%左右。小心而完全混合以后，進行電擊。然后用培養(yǎng)基稀釋原生質體懸液，讓其在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞壁再生。
本發(fā)明的程序適合于所有植物細胞的轉化，特別是被子植物和裸子植物。
在裸子植物綱中，含松柏酶類的植物是特別令人感興趣的。
在被子植物綱中，特別有興趣的植物，除落葉樹和灌木外，還有下列科的植物茄科，十字花種，菊科，百合科，葡萄科，藜科，蕓香科，鳳梨科，茜草科，茶科，芭蕉科，禾本科以及豆科系列(of the arder leguminosae)，特別是Papilianaceae。優(yōu)先選用的植物是茄科，十字花科，禾本科的代表植物。
特別感興趣的是煙草屬，碧冬茄屬，天仙子屬，蕓苔屬(芥屬)，黑麥草屬。作為例子有煙草，Nicotiana Plumbaginifolia，碧冬茄，Hyoscyamus muticus，蕓苔，蕪菁，和多花黑麥草。
由原生質體通過再生能夠產(chǎn)生植株的所有植物的質體和線粒體同樣可以用本發(fā)明的程序進行有用的轉化。到目前為止，還不能從遺傳上去操縱禾本科(grasses)代表的質體和線粒體，包括玉米，小麥，水稻，大麥，燕麥，粟，裸麥和高粱等谷物。本發(fā)明可以讓禾本科的細胞，包括谷物的細胞質體和線粒體，通過直接的基因轉化被轉化。用同樣的方法，能夠有效地轉化下述任何栽培植物的質體和線粒體。這些栽培植物的屬有茄屬，煙草屬，蕓苔屬，菾菜屬，豌豆屬，菜豆屬，大豆屬，向日葵屬，蔥屬，小麥屬，大麥屬，燕麥屬，狗尾草屬，稻屬，榅桲屬，梨屬，蘋果屬，懸鉤子屬，草莓屬，李屬，落花生屬，黑麥屬，黍屬，甘蔗屬，咖啡屬，山茶屬，芭蕉屬，鳳梨屬，葡萄屬，高粱屬，向日葵屬或柑桔屬。
轉化基因結合到質體或線粒體可以通過已知的先有技術方法顯示，如遺傳雜交和分子生物學實驗，特別是包括質體和線粒體DNA的Soulhern吸印法分析以及用酶活性的試驗來分析測定。
Southern吸印分析可通過如下步驟來完成將由轉化的細胞或原生質體的質體或線粒體分離出的DNA，經(jīng)限制性內切酶處理以后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，轉移到硝酸纖維素膜上〔Southern等(1975)〕，然后與體外標記的期望證實其存在的DNA雜交。通過缺口翻譯，DNA可被體外標記成活性為5×108到10×108(c.p.m)/微克〔Rigby等(1977)〕的標記DNA。濾膜用0.03M檸檬酸鈉和0.3M NaCl，水溶液在1小時內洗滌3次，溫度為65℃。雜交的DNA在X-射線膠片上放射性自顯影一到數(shù)日。
帶有所期望的基因的轉化細胞，可以通過先有技術分離。這些方法包括選擇和篩選。核基因的選擇用Fraley等(1983);Herrera-Estrella等，(1983);和Bevan等(1983)。所敘述方法。篩選可以用β-半乳糖苷酶〔Helmer等(1984)〕，nopaline合成酶，或octopine合成酶〔Wostemeyer等(1984);De Greve等(1982)〕或阿特拉津抗性。
在本發(fā)明之前，尚不知道質體或線粒體可通過直接轉移基因被轉化。因而，通過將分離的DNA引入細胞器，功能地引進所期望的基因去，在以前是不可能的。如果基因能復制和表達的話，那么它們被認為是功能地摻入到質體和線粒體的染色體組中去了。
通過基因的直接轉移，將基因引入到質體或線粒體中去的優(yōu)點是可以同時使不期望有的原已在質體或線粒體基因組的基因失活。因為直接基因轉移的程序不需通過同源重組插入外源基因到質體或線粒體基因組中去，所以這是可能的。例如，一個攜帶psb A的阿特拉津抗性類型的供體DNA分子，將不需插入到相應的阿特拉津敏感的psb A基因中去。另一方面，因為質體和線粒體基因組相對較小，在轉化的植物細胞中進行篩選并找到那些其中的供體DNA插入體已隨機“擊中”(插入進去)受體基因組的任何期望的功能，這是辦得到的。直接將基因轉移到質體和線粒體基因組，提供了一個使原有基因失活的方法，這在從前是不可能的。通過篩選，可以找到轉化的植物細胞，其中阿特拉津敏感的psb A基因由于攜帶阿特拉津抗性psb A基因的供體DNA的插入而失活，這也是辦得到的。
直接基因轉移到質體和線粒體基因組中去的再一個優(yōu)點是那樣的基因組不像核染色體組，它們是通過細胞質體性狀遺傳的，而不是通過通常的花粉傳到它們有性后代而轉移基因。因此，將期望性狀的基因從栽培作物轉到雜草的可能性是非常小的。
用本發(fā)明的方法轉化的培養(yǎng)中的植物細胞可用于生產(chǎn)被插入基因編碼的多肽。這些產(chǎn)物包括被psb A表達32Kd的多肽，氯霉素乙酰轉移酶，谷胱甘肽S-轉移酶，和Rubisco大亞基。
含有插入基因的植物細胞，在有些情況下也可以再生成表達基因的多細胞植物，因此，它具有所期望的新性狀。通過本發(fā)明的方法，可以使得由原生質體衍生而來的植物細胞具有再生成整個植株的能力。某些適合的完整的植物包括茄屬(馬鈴薯)，矮牽牛屬(矮牽牛)，胡蘿卜屬(胡蘿卜)，番茄屬(番茄)，蕓苔屬(蘿卜，甘蘭，花椰菜等)，苜蓿屬(紫花苜蓿)，車軸草屬(三葉草)，柑桔屬，顛茄屬，天仙子屬，喇叭舌屬，擬南芥屬，毛地黃屬，菊苣屬，棉屬，大豆屬，老鸛草屬，Anthirrhinum，天門冬屬。這些植物用先有技術方法可以再生;參閱Evans和Bravo，1983;Dale，1983。例如，這些植物可以從任何合適的繁殖體再生，諸如細胞，愈傷組織，組織，器官，芽，插條，小枝條，小根，小植株，體細胞胚，和其它類似物。
只要種子含有插入的基因和產(chǎn)生所期望的特征，那么本發(fā)明將進而包括用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物的種子，用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的植物的后代，包括有性和無性的后代，是進一步的實施。有性后代可以從自身或異花授粉產(chǎn)生。這些具除草劑抗性或耐性的種子和后代或含有不穩(wěn)定抗性或耐性的親本，只要他們被種植在有除草劑存在的情況下，將保留他們的除草劑抗性或耐性。優(yōu)先選用的除草劑是阿特拉津。因此，本發(fā)明可以生產(chǎn)在用除草劑，如阿特拉津，致死的濃度下處理，仍能存活的遺傳工程的植物產(chǎn)品。
不言而喻，本發(fā)明同樣也包括所有植物的原生質體，植物細胞，植物組織培養(yǎng)繁殖的材料或用在這里所敘述的方法轉化的植物，以及用所敘述的方法轉化的材料衍生而來的任何植物，這些植物仍將顯示該性狀或由所述轉化產(chǎn)生的性狀。
實施例下述實施例的程序見Maniatis等人的方法，(1983)。所用酶可從New England Biolabs得到。除有其他說明外，均按制造商建議的方法應用這些酶。
例1構建質粒pCAT°(見圖1)1.用HindⅢ和BamHⅠ酶解來自Tn903攜帶Kmr基因的載體質粒pMON187。
2.從質粒pSVO分離出無啟動子的CAT基因，它在凝膠提純的HindⅢ/BamHⅠ片段中。(見Gorman等人的方法，1982)。
3.將步驟2片段與步驟1片段連接，得到的質粒轉化HB101大腸桿菌，選擇具有圖1的pCAT°質粒的APr.AKmr菌落。
例2選擇的構建pCAT°用除pMON187以外的其它質粒重復例2的程序?？砂聪铝胁襟E構建來自Tn903，含Kmr基因的一個合適的質粒。
從質粒pAO2分離來自Tn903含Kmr基因的1.2Kb AvaⅡ片段(見OKa等人方法，1981年)。將AvaⅡ片段用Klenow聚合酶填平，再將BamHⅠ銜接物連接到該平整末端的片段。再用酶TaqⅠ和BamHⅠ限制這段DNA，將它連接到已用claⅠ和BamHⅠ酶解的質粒pBR327，含Tn903片段重組體提供給大腸桿菌Km基因。
例3構建p32CAT(見圖1)為將psb A啟動子加到CAT°無啟動子CAT°基因，按下列步驟進行4.用SmaⅠ和HindⅢ酶解pCAT°。
5.從質粒pAH484分離psb A啟動子的，用凝膠純化161bp長的SmaⅠ/HindⅢ片段。重組質粒pAH484含有從抗除草劑(阿特拉津)的綠穗莧克隆到pBR322中的3.86Kb的葉綠體DNA片段。(見Hirschberg和Mc Intosch的方法，1983)。
6.將步驟5分離的片段連接到步驟4得到的較大片段，得到p32CAT。它給轉化的大腸桿菌提供了Cmr基因。
例4構建質粒pUCHl-一個攜帶psbA和一個嵌入psb A/CAT基因構建物的載體。(見圖2)通過五步(7-11)將質粒pUCHl構建在pUC8中7.(見圖1)如上述，從pAH484分離含完整psbA基因的3.6Kb長的EcoRⅠ片段(凝膠純化的)。
8.將pUC8(見圖2)在唯一的EcoRⅠ點斷開而線性化。
9.將從步驟8得到線性化的pUC8連接到步驟7所述的片段。轉化大腸桿菌，得到具有所需插入片段的AP菌落，其中之一命名為pUC-32。
10.從p32CAT分離出一個凝膠純化的1.8Kb長的XhoⅠ/BamHⅠ片段。
11.用SalⅠ部分酶解，再用BamHⅠ完全酶解步驟9得來的質粒pUC8-32。將其與步驟10得到的片段連接，轉化大腸桿菌后，選擇CM菌落，得到含pUCHl的大腸桿菌菌落。
例5構建一個嵌入psb A/CAT基因的pBRCAT質粒(見圖3)通過將下列三個DNA片段連接到一起構建pBRCATa.從質粒pAH484(見步驟12)中psbA基因得到的約660bp長的EcoRⅠ/HindⅢ(啟動子)片段;
b.含無啟動子CAT基因(見步驟2)的psvo質粒的HindⅢ/BamHⅠ片段，(見步驟2)
c.EcoRⅠ/BamHⅠ酶解的pBR322作為載體(見步驟13)。
14.連接后得到質粒pBRCAT，它通過轉化被引進大腸桿菌宿主細胞，為其提供CMr基因。
例6將供體DNA引入植物原生質體將煙草原生質體以2×106/ml的密度懸浮在1毫升含0.1mg/l 2.4-二氯苯氧基乙酸，1.0mg/l的1-萘乙酸和0.2mg/l 6-芐胺基嘌呤的K培養(yǎng)基〔見Z.Planzenphysiologie 78卷，453-455頁(1976);突變研究81期165-175頁(1981)〕。通過在pH5.8，0.6M的蔗糖液上浮選，從酶懸液中得到原生質體，然后在pH5.8的0.17M的氯化鈣溶液中以100g沉降5分鐘。然后加入懸在修飾的F溶液中(滅菌后調pH至5.6)的分子量為6000的40% PEG0.5毫升〔見Nature 296卷，72-74頁(1982年)〕及65微升含15微克供體DNA(p32CAT，pUCHl或pBRCAT)的水溶液，50微克的小牛胸腺DNA。將這混合液于26℃培養(yǎng)30分鐘，偶爾攪動，然后用F培養(yǎng)液逐滴稀釋。離心分離原生質體(100g，5分鐘)，再將其重懸在30毫升新鮮的K3培養(yǎng)基中。進而取10毫升，置于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，24℃，黑暗培養(yǎng)，直至原生質體密度為6.3×104個/ml。三天后，每個皿的培養(yǎng)基用0.3倍體積的新鮮K培養(yǎng)液稀釋，再在24℃，3000勒克司下溫育4天。經(jīng)過這7天后，將原生質體的各個克隆傾入培養(yǎng)皿底，該培養(yǎng)基用含10mg/l氯霉素的1%瓊脂糖固化。然后在培養(yǎng)皿內，黑暗下，用念珠型培養(yǎng)法培養(yǎng)〔見Plant cell Reports，2期，244-247(1983)〕。每隔5天用同樣的新鮮培養(yǎng)液置換。
在含氯霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3～4周后，將直徑2～3cm的抗性愈傷組織轉移到瓊脂固化的LB培養(yǎng)基中〔Physiol plant 18，100-127(1965)〕，LB培養(yǎng)基含0.05mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸，2mg/l 1-萘乙酸，0.1mg/l 6-芐胺基嘌呤，0.1mg/l激動素和10mg/l氯霉素。通過在含10mg/l和0.2mg/l 6-芐胺基嘌呤的LS培養(yǎng)基上誘發(fā)出莖，隨后在T培養(yǎng)基上誘發(fā)出根，從而得到了抗氯霉素的煙草小哈瓦那SRI植物?！惨奡cience 163，85-87(1969)〕。
選擇氯霉素抗性的愈傷組織和植株主要是根據(jù)De Block等人所敘述的方法來進行。(1984)例7篩選抗阿特拉津的葉綠體轉化體a.愈傷組織在濃度為1-10μM具有不同光密度的阿特拉津的條件下測定未轉化的愈傷組織的阿特拉津毒性曲線。將從假定的葉綠體轉化體和對照分離的愈傷組織培養(yǎng)在某阿特拉津濃度和光密度的營養(yǎng)瓊脂平皿上，對照組織的葉綠素完全脫色。對阿特拉津的抗性可通過肉眼觀察抗性組織不斷變綠來測定。
b.整株植物由葉綠體轉化體衍生而來的植株對阿特拉津抗性的試驗可通過以下方法進行用熒光誘導葉中葉綠素，當光合系統(tǒng)Ⅱ還原端的電子傳遞被阿特拉津抑制時，葉綠素吸收的輻射光則以熒光的方式重新放射出來。這種熒光可在葉表被探測到。如Malkin等人(1981年)所述的方法，可通過一個透明的有機玻璃窗來觀察夾住的葉子園片上發(fā)出的熒光。通過一個dc-發(fā)射器供應發(fā)射光，濾光，得到一個光密度約為10n E×cm-2×S-1的500～600nm的光化性的光波。激發(fā)光的時間為3ms。激發(fā)光方向與葉面垂直，通過柔韌的光導纖維從葉表收集熒光，通過一個切口濾光裝置(濾過660nm波長的光)導向一個對紅光敏感的光放大器。透過的熒光被記錄在示波器上，并被直接照象。
c光調節(jié)浮動當從葉子剪下的葉園片浮在含表面活性劑的磷酸緩沖液上時，隨著光合作用發(fā)生，胞間空隙，O/CO保持著高比率，它們繼續(xù)浮動。如果將其放在黑暗中，或加入抑制光合作用的除草劑到緩沖液中，則葉子園片迅速失去浮力而凹陷。正如Hensley(1981)敘述的測定阿特拉津抗性的方法那樣，將葉子園片轉移到含阿特拉津溶液的試管中，再將其置于真空。溶液迅速進入葉片，葉片陷入溶液底部。然后解除真空，加入碳酸氫鹽，再將試管照光。光合作用不被阿特拉津抑制時，光合作用其組織內制造氧氣，恢復了浮力，葉園片浮到水面，而對阿特拉津敏感的葉園片仍在底部。
例8蕪菁Just Right細胞的轉化用合適的滲透劑洗蕪菁原生質體，并以每毫升5×106的群體密度懸在根據(jù)原生質體83制備的培養(yǎng)液中(見Proceedings Experientia Supplementum，Birdhauser Verlag，Basel，Vol，45，P44-45(1983))將分子量為6000的40%聚乙二醇(PEG)溶于修飾的F溶液中(pH5.8)，與原生質體混合，使PEG終濃度為13%，立即將含有用內切酶SalⅠ酶解的50微克的質粒pBRCAT或p32CAT溶液加到上述混合液中，再加60微升水。偶爾攪動，將混液在20～25℃下溫育30分鐘。將3×2ml修飾的F溶液(共6ml)和2×2ml的培養(yǎng)液(共4ml)，以5分鐘的間隔加入。將原生質體懸液轉入10cm直徑的培養(yǎng)皿中，再加培養(yǎng)液使其總體積達20ml。將這些原生質體在26℃，黑暗中溫育45分鐘。以100g速度沉降5分鐘，分離出原生質體，然后制作瓊脂糖凝膠培養(yǎng)基，用念珠型培養(yǎng)法(bead type culture method)培養(yǎng)〔見Plant Cell Reports，2，P244～247(1983)〕。4天后在第一個細胞分裂發(fā)育階段，以10mg/l的濃度加入氯霉素。用含氯霉素的新鮮營養(yǎng)液，每隔4天換一次瓊脂糖凝膠周圍的液體培養(yǎng)基。四周后，分離出抗氯霉素的克隆，再每周換一次含10mg/l氯霉素的營養(yǎng)液進一步培養(yǎng)。
例9多花黑麥草禾本科植物原生質體的轉化將多花黑麥草(意大利regrass)的原生質體以每毫升2×106個的密度分散在pH5.8，0.4摩爾甘露醇溶液中。再加入懸浮在修飾的F溶液中(pH5.8)，分子量為6000的40% PEG0.5ml〔Nature 296，72-74(1982)〕和含50微克質粒p32CAT或pBRCAT的水溶液65微升。將混液溫育在26℃下，30分鐘，偶爾攪動，如〔Nature 296(1982)，72-74〕所述，用F液稀釋，離心分離原生質體(100g，5分鐘)，轉移到4毫升cc培養(yǎng)液〔見Potrgkus，Harmsand Lorz，“從玉米細胞培養(yǎng)原生質體形成愈傷組織”，刊在〔Theor，Appl，Genet.54期，209-214頁(1969)〕，在24℃，黑暗下溫育。14天后，將細胞培養(yǎng)液轉到含氯霉素10mg/l的同樣培養(yǎng)基。將抗氯霉素的細胞群落轉移到瓊脂培養(yǎng)基(氧霉素10mg/l，無滲透劑的上述同樣的培養(yǎng)基)，每個群落達幾克鮮重后，測定是否存在細菌基因及基因的生物活性。
例10用電擊法轉移質粒p32CAT，pUCHl或pBRCAT來轉化煙草培養(yǎng)細胞沉降50ml對數(shù)生長期硝酸還原酶缺陷變異型的煙草細胞株nia-115懸液得到其原生質體〔見Müller，A.J.和R.Grafe，Mol.Gen.Genet.161期，67-76頁(1978)〕，將其懸在20ml的酶溶液中，〔將2%纖維素酶Onoxuka R-10，1% Macerozyme RO19和0.5% Driselase(從Chemishe Fabrik Schweizerhalle，Basel得到)酶溶在0.3M甘露醇，0.04M氯化鈣和0.5% 2-(N-嗎啉代)乙基磺酸洗液)，置于回轉式搖床上，24℃，溫育3小時。然后將其通過100mm目篩過濾，將原生質體與未酶解的組織分開。加入等體積的0.6M蔗糖，100g，離心10分鐘。收集浮在表面的原生質體，在洗液中洗3次。
通過電擊轉化，先用70%乙醇，再用100%乙醇洗，使Dialog“Porator”的空室(從Dialog Gmbh，Harffstr.34，4000 Dusseldorf，West Germany得來)滅菌，再通過片狀通風櫥的無菌氣流干燥空室。以1×106個/ml的濃度將原生質體懸在0.4M的甘露醇溶液中，用氯化鎂供其調整能抗1.4Kohm，以10微克/毫升的濃度加入pBRCAT，PUCHI或p32CAT質粒DNA。每次用0.38ml原生質體懸液，分三次，每次10秒間隔，置于1000V或2000V電壓下，然后將原生質體以1×105個/ml的濃度培養(yǎng)在3ml的AA-CH液中〔見Glimelius的AA液，見K等人發(fā)表在physoil.plant，44期273-277(1978)〕，通過增加肌醇濃度到100mg/l，蔗糖濃度到34g/l以及加0.05ml/l的2-(3-甲基-2-丁烯基)腺嘌呤修飾的AA培養(yǎng)液，然后加0.6%瓊脂糖固化培養(yǎng)基(從Sea Plaqne，F(xiàn)MC Corp.，Marine Colloids Division，P.O.Box 308，Rockland，Maine 04841，USA得到)。一周后，將含原生質體的瓊脂糖層轉到30ml內含10mg/l氯霉素的液體AA-CH培養(yǎng)基。每周用同樣成分的新鮮培養(yǎng)液換一半培養(yǎng)中的培養(yǎng)液，3周后可用肉眼觀察到轉化了的細胞群落。轉移到含氯霉素的培養(yǎng)基后四周，將細胞群落轉到含0.8%瓊脂，10mg/l氯霉素的AA培養(yǎng)基〔Glimelius，K.等人，見Physiolo.Plant.44，273-277(1978)〕，進一步培養(yǎng)和觀察。
用蕪菁和多花黑麥草原生質體作的同樣試驗，也得到成功的轉化。
例11電擊轉移供體DNA以轉化煙草葉綠體的細胞。
如例10所述方法準備電擊液，如例6所述準備用于轉化的原生質體，將煙草的原生質體以1.6×106個/ml的濃度重懸在0.4M的甘露醇液(將甘露醇懸在0.5%W/V的2(N-嗎啉代)乙烷磺酸緩沖液，pH5.6)。原生質體懸液的抗性在“Porator”空室(0.38ml)中測定，用氯代鎂溶液(0.3M)將懸液調到1-1.2Kohm。每個5ml體積的帶蓋塑料管中加入0.5ml樣品，再在每管中先加含8mg供體DNA，20mg小牛胸腺DNA的水溶液40微升，再加入0.25ml PEG溶液(懸在甘露醇中24%(W/V)的PEG)。加入DNA后9分鐘，取0.38ml混液傾入電沖擊室，加入DNA后10分鐘，將室內原生質體懸液以1000-2000伏，每隔10秒電擊3次。處理后的懸液傾入直徑6cm的培養(yǎng)皿中，置于20℃下10分鐘。然后將含0.7%(W/V)的sea plaqne瓊脂糖的K3培養(yǎng)液3ml加入每個皿中，將每個皿內混液充分混合。固化每個皿的混液后，先在24℃，黑暗下培養(yǎng)一天，再照光培養(yǎng)6天將含瓊脂糖的原生質體分為四分，裝入液體培養(yǎng)基。用念珠型培養(yǎng)液培養(yǎng)原生質體。用氯霉素選擇轉化的材料，得到愈傷組織，從它再生的植物含有CAT酶(氯霉素乙?；D移酶)，該酶是CTA基因的產(chǎn)物。
電擊與非電擊法比較誘導的轉化率高5～10倍。用蕪菁C.V.Just Right和多花黑麥草作同樣試驗都以同樣數(shù)量級增加轉化率。
例12用熱振蕩轉移CAT基因來轉化煙草細胞。
根據(jù)例6和例10所述方法從煙草細胞培養(yǎng)物或葉子分離原生質體。再將其用前面例子所述方法轉移到滲透基質中。將原生質體懸液保存在45℃下，5分鐘，用冰冷卻10秒，然后如例6和10所述，加入質粒pBRCAT，pUHI或p32CAT。熱振蕩處理比未經(jīng)處理的轉化率高出10倍或更多。
例13先將原生質體和基因混合再結合各種處理轉移CAT基因來轉化不同的植物細胞。
植物的原生質體煙草C.V.小哈瓦那SRT(A)蕪菁Just Right(B)和多花黑麥草(C)分別分離出來，如例11所述轉移到滲透基質中去。將各原生質體懸液與質粒pUH1，p32CAT，或pBRCAT，用例6，例9的方法混合，但不同時用PEG處理，將各原生質體懸液用例12方法熱振蕩處理，再用例6到例9方法用PEG處理，最后用例11方法電擊。轉化率為10到10，根據(jù)處理的條件，有時可達1～2%。
參考資料
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權利要求
1.將含有一個或多個具有在質體或線粒體中行使功能啟動子的基因的DNA直接引入到植物細胞原生質體中的質體或線粒體中的方法。該方法包括將上述DNA暴露于懸浮在基質中的原生質體，在該基質中DNA在足夠的時間內滲入原生質體和原生質體中的質體或線粒體，而不必將原生質體暴露于病源菌。
2.根據(jù)權利要求
1的方法，包括從轉化原生質體再生植物細胞的步驟。
3.根據(jù)權利要求
2的方法，進而包括從植物細胞再生整株植物。
4.根據(jù)權利要求
1的方法，其中DNA是線性的。
5.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA是一個質粒。
6.根據(jù)權利要求
5的方法，其中質粒含或不含一個或多個T-DNA邊緣區(qū)。
7.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA含有一個能給質體和線粒體提供除草劑抗性的基因。
8.根據(jù)權利要求
7的方法，其中的除草劑是阿特拉津。
9.根據(jù)權利要求
7的方法，其中的DNA提供除草劑抗性和第二個農(nóng)學上有的性狀(特征)。
10.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA包括一個可選擇的標記基因和一個提供農(nóng)學上有用性狀的基因。
11.根據(jù)權利要求
10的方法，其中可選擇的標記基因提供抗生素抗性。
12.根據(jù)權利要求
11的方法，其中的抗生素是氯霉素或卡那霉素。
13.根據(jù)權利要求
10的方法，其中農(nóng)學上有用的性狀是抗除草劑。
14.根據(jù)權利要求
13的方法，其中的除草劑是阿得拉津。
15.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的基因是嵌合體。
16.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA包括一個復制信號。
17.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA包括一個整合信號。
18.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的植物細胞原生質體是一個葉細胞原生質體。
19.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的基質是一種滲透性穩(wěn)定的原生質體培養(yǎng)基。
20.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的基質包括植物耐受的二價陽離子。
21.根據(jù)權利要求
20的方法，其中的二價陽離子是鎂離子或鈣離子。
22.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的基質包括多元醇，這種多元醇能修飾原生質體膜和促進細胞融合。
23.根據(jù)權利要求
22的方法，其中的多元醇是聚乙二醇，聚丙烯乙二醇或聚乙烯醇。
24.根據(jù)權利要求
23的方法，其中的多元醇是聚乙二醇。
25.根據(jù)權利要求
24的要求方法，其中的聚乙二醇分子量為1000到10，000。
26.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA和原生質體接受熱振蕩。
27.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的DNA和原生質體接受電擊。
28.根據(jù)權利要求
1的方法，其中DNA引進原生質體是通過至少結合下述方法的兩個完成的聚乙二醇處理，熱振蕩和電擊。
29.根據(jù)權利要求
28的方法，其中的基因轉移首先是通過將外源基因和原生質體導入某一溶液，然后將懸液先接受熱振蕩，再用聚乙二醇處理完成的。
30.根據(jù)權利要求
28的方法，其中的基因轉移是通過先將外源基因和原生質體導入某一溶液，然后將懸液先接受熱振蕩，再用聚乙二醇處理，最后接受電擊。
31.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的基質包括能用來修飾原生質體膜而促進細胞融合的多元醇，DNA和原生質體至少接受電擊或熱振蕩一種處理。
32.根據(jù)權利要求
1的方法，進而包括使細胞外核酸酶失活的步驟。
33.根據(jù)權利要求
1的方法，其中的原生質體來自禾木科，茄科，十學花科的植物細胞。
34.根據(jù)權利要求
33的方法，其中的原生質體來自禾本科植物的細胞。
35.根據(jù)權利要求
34的方法，其中的禾本科的植物細胞是能產(chǎn)生谷類作物的細胞。
36.根據(jù)權利要求
35的方法，其中的谷類是玉米，小麥，水稻，大麥，燕麥，粟，裸麥或高粱。
專利摘要
本發(fā)明是關于將含有一個或多個基因的DNA直接插入植物細胞原生質體中的質體或線粒體的方法，這些基因含有在質體或線粒體中行使功能的啟動子。該方法包括將DNA暴露于基質中的原生質體，經(jīng)過足夠的時間，DNA進入原生質體及原生質體中的質體或線粒體，而不需將原生質體暴露于病源菌。
文檔編號C12R1/91GK86107908SQ86107908
公開日1987年9月30日 申請日期1986年11月21日
發(fā)明者英格·波特里庫斯, 雷蒙德·道格拉斯·希利托, 馬麗·戴爾·奇爾頓 申請人:希巴-蓋吉股份公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan