專利名稱：含聚硫脲的藥物制劑及其使用方法
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本發(fā)明涉及含聚硫脲低聚物的藥物制劑及使用方法。聚硫脲低聚物是陰離子化合物，它尤其在抗人類免疫缺陷病毒活性方面是有益的。并且因此使得這些低聚物可用于治療獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。
本發(fā)明背景為了發(fā)展對(duì)人類和動(dòng)物病毒感染的治療和治愈工作，目前，大量研究正在進(jìn)行中。人類AIDS和AIDS相關(guān)復(fù)征(ARC)的發(fā)病率正以令人驚恐的速度顯著增加。對(duì)于患AIDS的人來(lái)說(shuō)，其五年存活率是令人沮喪的并且由于感染使得免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損的AIDS病人受到許多機(jī)會(huì)致病菌，包括Kaposis sarcoma和Pneumocystiscarninii pneumonia的感染。還不知道怎樣治愈AIDS并且通常的治療大多缺乏足夠的有效證據(jù)，并具有許多不適宜的副作用。由于對(duì)該病的恐懼，已引起社會(huì)對(duì)那些患病或懷疑患病者的排斥和歧視。
在1990年10月31日發(fā)行的南非專利09/0094中已公開了一種精制肝素，一種硫酸化多糖，通過(guò)相互作用結(jié)合到負(fù)責(zé)細(xì)胞認(rèn)別的病毒蛋白質(zhì)上并且對(duì)宿主細(xì)胞感染提供有限的抑制作用。然而，肝素引起某些副作用，明顯的有出血和增加血凝時(shí)間以及血小板減小。對(duì)于患有活動(dòng)性出血，或患有血友病，紫癜，血小板減少癥，顱內(nèi)內(nèi)血，細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，活動(dòng)性結(jié)核病，毛細(xì)血管通透性增加，胃腸道潰瘍性損傷，嚴(yán)重高血壓，先兆流產(chǎn)或內(nèi)臟癌的病人，禁忌使用肝素。血友病患者尤其禁忌使用，而很多這樣的個(gè)體是HIV陽(yáng)性。
很久以來(lái)已認(rèn)識(shí)到，某些合成的水溶性聚合物表現(xiàn)出廣泛的生物活性〔R.M.Ottenbrite在“Biological Activities of Polymers”中，Amer.Chem.Soc.Symp.Ser.，No.182，PP.205-220，eds.C.E.Carraher and C.G.Gebelein(1982)〕。盡管這種水溶性聚合物的作用機(jī)理是未知的，一種假設(shè)為聚合物通過(guò)離子吸引結(jié)合到病毒的膜上，因此使得病毒不能感染宿主細(xì)胞。不幸的是，這些聚合物極端的毒性妨礙了它們的臨床應(yīng)用。這些聚合物也具有高分子量并且不能通過(guò)腎膜。
通過(guò)合成低分子量(1,000-10,000)的脂肪族聚合物，已經(jīng)做了許多嘗試來(lái)防止毒性的發(fā)生和排泄問(wèn)題〔R.M.Ottenbrite在“Biological Activities of Polymers”中，Amer，Chem.Soc.Symp.Ser.，No.182，PP.205-220，eds.C.E.Carraher and C.G.Gebelein(1982)〕。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些聚合物的毒性低，但抗病毒活性大大降低。這些低分子量的脂肪聚合物可歸類為“隨機(jī)盤繞”聚合物。由于骨架連接基團(tuán)的柔韌性，使得這些聚合物具有不可預(yù)見的構(gòu)型。通常，將溶液中隨機(jī)盤繞聚合物的構(gòu)型描述為球形的。認(rèn)為這些隨機(jī)盤繞聚合物的抗病毒活性降低是由于聚合物與病毒膜結(jié)合親和力低。
克服隨機(jī)盤繞聚合物存在問(wèn)題的一種方法是提供具有很少自由度的剛性骨架的聚合物。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些手性陰離子低聚物，它們抑制病毒的復(fù)制并無(wú)肝素和已知聚合物所表現(xiàn)的副作用。這些陰離子低聚物具有有序的陰離子間隔，具有剛性骨架并且是水溶性的。在1991年6月10日提交的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)710,370和1991年7月8日提交的相應(yīng)的PCT申請(qǐng)PCT/US91/04804中，已作為多分散混合物描述了這種陰離子低聚物，將其中公開內(nèi)容引入本文供參考。在1992年1月9日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)818,753中作為窄的多或單分散低聚物描述了這種陰離子低聚物，將其中公開內(nèi)容引入本文供參考。
在同時(shí)提交的一申請(qǐng)中，描述了某些具有剛性骨架并且具有很少自由度的非手性陰離子聚脲低聚物。
在1956年7月31日發(fā)布的比利時(shí)專利544,868中已經(jīng)公開了某些聚硫脲具有抗病毒活性。
本發(fā)明概要現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，聚硫脲低聚物具有抗人類免疫缺陷病毒活性并且因此可用于治療AIDS和ARC。該低聚物包括其可藥用鹽。
因此，本發(fā)明涉及水溶性、剛性骨架的聚硫脲低聚物，它包含下式所示化合物衍生的重復(fù)部分H2N-X-NH2(I)其中X為至少由一個(gè)磺酸基取代的二價(jià)芳香亞烴基。
本發(fā)明的低聚物在陰離子性磺酸基之間具有有序的陰離子間隔。低聚物的數(shù)均分子量Mn小于10,000。
本發(fā)明詳細(xì)描述由下式表示本發(fā)明低聚物 其中R為H，C1-C4烷基，苯基，或由0-2個(gè)R1基團(tuán)和不超過(guò)3個(gè)獨(dú)立地選自氯或溴原子，或C1-C4烷基的取代基取代的苯基；R1代表-SO3R2，-CO2R2，-PO3R2，或-OPO3R2；R2為H或在藥學(xué)上適用的陽(yáng)離子；R3為-R或-X-NHR，其中R如上定義；X代表 Y 代表-CO2-，-C≡C-，-N＝N-， m為整數(shù)0或1，前提條件是，當(dāng)m＝0時(shí)，R1為氫原子，并且n為3-50的整數(shù)。
如下為式I優(yōu)選的條件R和R3為4-甲基苯基；m為1；n為3-15；并且X代表 尤其優(yōu)選
術(shù)語(yǔ)“在藥學(xué)上適用的陽(yáng)離子”指適宜藥用的陽(yáng)離子。在為獲得需要的效應(yīng)而給予的劑量下基本無(wú)毒并且不單獨(dú)具有明顯的藥物活性的那些陽(yáng)離子包括在術(shù)語(yǔ)“在藥學(xué)上適用的陽(yáng)離子”范圍內(nèi)。例如這些鹽包括堿金屬如鈉和鉀；堿土金屬如鈣和鎂；銨；IIIA族輕金屬包括鋁；和有機(jī)伯、仲和叔胺如三烷基胺，包括三乙胺，普魯卡因，二芐胺，N，N’-二芐基乙二胺，二氫樅胺，N-(C1-C4)烷基哌啶和其它適宜的胺的鹽。鈉和鉀鹽是優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上適用的”指適于溫血?jiǎng)游镉绕涫侨祟惤o藥，并包括非毒性的，例如適于藥用并對(duì)溫血?jiǎng)游餆o(wú)毒的。通過(guò)常規(guī)的離子交換方法或通過(guò)用適宜的堿處理R1酸來(lái)制備本發(fā)明低聚物的藥學(xué)上適用的陽(yáng)離子。
當(dāng)本發(fā)明低聚物不是用作藥物時(shí)，可使用不適于藥用的其它鹽。該其它鹽包括鋇，鋅和鈦鹽。
“有序間隔”或“陰離子基團(tuán)間的規(guī)則間隔”指在聚合物的骨架中陰離子磺酸基以所使用的起始物試劑決定的間隔出現(xiàn)，并且陰離子基團(tuán)的出現(xiàn)率可預(yù)控制。盡管不希望受任何理論的約束，但相信該低聚物的磺酸基是結(jié)合到HIV和/或細(xì)胞膜上的部分并因此干擾病毒的復(fù)制能力。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“低聚物”包含所有可能的n值，例如3-50。優(yōu)選的低聚物為n等于整數(shù)3-50，優(yōu)選3-20，更優(yōu)選3-15的線性低聚物。當(dāng)然，n值直接與得到的低聚物的分子量相關(guān)。為了通過(guò)腎排泄膜，必需使這些低聚物的分子量足夠低，但又能夠抑制HIV病毒。通過(guò)試劑的化學(xué)計(jì)算來(lái)控制平均分子量。數(shù)均分子量(Mn)＜10,000，優(yōu)選約500-10,000，并且最優(yōu)選約1,000-6,000。
對(duì)于本發(fā)明的目的，認(rèn)為本文所述的低聚物和其在生理上適用的鹽是等同的。在生理上適用的鹽指那些堿鹽，其中的堿至少與R1基的一個(gè)酸基形成鹽并且當(dāng)按本文所述的方法給藥時(shí)不引起明顯的不良生理作用，例如，適宜的堿包括堿金屬和堿土金屬的氫氧化物，碳酸鹽和碳酸氫鹽，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鎂等等；及氨，伯、仲和叔胺等等。特別優(yōu)選的堿是堿金屬氫氧化物，碳酸鹽和碳酸氫鹽。通過(guò)常規(guī)的離子交換方法或通過(guò)用適宜的堿處理R1酸可制備在生理上適用的鹽。其它鹽的實(shí)例已在本文中描述。
本發(fā)明制劑是固體或液體劑型。這些制劑可以是藥盒形式，這樣在使用前適宜的時(shí)間將組分混合。無(wú)論預(yù)先混合好或作為藥盒形式，通常該制劑都需要藥學(xué)上適用的載體或佐劑。
本發(fā)明低聚物在水中和鹽溶液中是可溶的，尤其在生理PH下和在鹽水溶液中是可溶的。因此本發(fā)明低聚物易于制成適宜的水性藥物劑型。給予本發(fā)明低聚物制劑后，低聚物在體內(nèi)保持可溶性。
通過(guò)用揮發(fā)性弱酸的堿金屬鹽處理可將低聚物的揮發(fā)性胺的銨鹽溶液轉(zhuǎn)化為更優(yōu)選的學(xué)上適用的鹽，如鈉或鉀鹽。當(dāng)通過(guò)蒸發(fā)或凍干來(lái)濃縮溶液時(shí)；可除掉胺和弱酸，并且以堿金屬鹽分離低聚物。在步驟中可轉(zhuǎn)化的銨鹽的實(shí)例為氨，單乙胺，三乙胺，三甲胺或二甲胺的鹽(本文稱作“銨鹽”)。堿金屬鹽的實(shí)例為鈉或鉀的氫氧化物，碳酸氫鹽，醋酸鹽，甲酸鹽或丙酸鹽。
陰離子低聚物的制備用兩種方法來(lái)制備陰離子低聚物。第一種方法產(chǎn)生低聚物的多分散混合物的非特異性方法，它包括將二胺與硫脲前體如硫光氣或硫代羰基二咪唑結(jié)合?？捎锌蔁o(wú)的是單官能團(tuán)封端劑，控制反應(yīng)PH的酸中和劑，和水不混溶溶劑。也描述了一種方法，利用單官能團(tuán)胺反應(yīng)性試劑，或通過(guò)將未封端聚合物與含胺單官能團(tuán)封端劑和硫脲前體結(jié)合，將帶有胺端的未封端的聚硫脲轉(zhuǎn)化為封端的聚合物。
第二種方法包括，通過(guò)連續(xù)加入雙異硫氰酸酯和二胺，逐步增加聚合物鏈。盡管該方法更費(fèi)時(shí)，但得到具有窄分散度的聚硫脲。
如下進(jìn)一步說(shuō)明制備聚硫脲的方法。
二胺本發(fā)明二胺主要是芳香族的，具有前面所描述的化學(xué)式。該二胺至少被一個(gè)在中性條件下帶電的基團(tuán)取代，優(yōu)選磺酸。單價(jià)脂肪族取代基是容許的?？梢允褂靡恍☆悓⒎枷慊B在一起的脂肪族連接基，如反式取代的乙烯和乙炔。優(yōu)選的二胺為其中碳-氮鍵相平行的那些，如2，5-二氨基-1，4-苯二磺酸，4，4’-二氨基-(1，1’-聯(lián)苯)-2，2’-二磺酸，反式-2，2’-(1，2-乙烯二基)雙(5-氨基苯磺酸)和2，5-二氨基苯磺酸。
硫脲前體可以使用各種硫脲前體如硫光氣(二氯硫化碳)，二溴硫化碳和其它脲的前體如硫代羰基二咪唑，六氯丙硫酮，Cl3CSCO2CCl3，CCl3CSCl，和Cl3OCSCl。
酸中和劑可以使用各種有機(jī)堿，如堿金屬或二價(jià)金屬的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽。在加入二官能團(tuán)的親電子試劑前加入所有的堿時(shí)，具有緩沖能力的酸中和劑是優(yōu)選的?？梢允褂糜袡C(jī)堿如三烷基胺，但不是優(yōu)選的。
單官能團(tuán)封端試劑可以使用各種分子量限定試劑。該試劑可以是與二胺或二官能團(tuán)親電子試劑反應(yīng)的脂肪族或芳香族化合物。適宜的單官能團(tuán)試劑的實(shí)例為胺如苯胺，甲苯胺，甲胺，乙胺，丁胺，二乙胺，氨和N-甲苯胺。單官能團(tuán)胺反應(yīng)性試劑的實(shí)例為苯甲酰氯，甲基苯甲酰氯，乙酰氯，異氰酸甲酯，異硫氰酸甲酯，異氰酸苯酯，異硫氰酸苯酯，異硫氰酸對(duì)甲苯酯和氯甲酸苯酯。這些封端試劑也可以含帶電荷的取代基，例如2-磺基苯酚鉀或4-磺基苯胺鉀。
其它添加劑加入表面活性劑是不必要的或不優(yōu)選的，并且可能使分離過(guò)程復(fù)雜化。
溶劑在反應(yīng)溫度下，當(dāng)二官能團(tuán)親電子試劑是液體時(shí)，單一的溶劑-水是優(yōu)選的。這種二官能團(tuán)親電子試劑的實(shí)例為光氣。當(dāng)使用固體、水不溶性反應(yīng)物時(shí)，需要少量水不混溶性共溶劑。該水不混溶性共溶劑的實(shí)例為氯仿，四氯化碳，甲苯和二氯甲烷。典型地，有機(jī)溶劑與水性溶劑的比率為0到1。優(yōu)選0到0.1。
在允許反應(yīng)進(jìn)行的溫度下，典型地為0-100℃下進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選反應(yīng)溫度為0-25℃，當(dāng)使用硫光氣時(shí)，充分?jǐn)嚢枋侵匾?。在手工操作的?jiǎn)單的玻璃裝置MixxorTM中可進(jìn)行小型實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的試驗(yàn)，其中可通過(guò)狹窄的管道使反應(yīng)物來(lái)回流動(dòng)。壓力是不重要的并且典型地使用大氣壓。為保證最適的反應(yīng)過(guò)程，必須小心地維持反應(yīng)的PH。一種考慮是，在小于4的酸性PH值條件下，帶電荷的二胺具有有限的溶解度。在低PH(＜6)下反應(yīng)也是很慢的，同時(shí)在高PH(＞10)下，二官能團(tuán)親電子試劑受氫氧化物或其它堿進(jìn)攻而不穩(wěn)定。在高PH下聚硫脲也可以發(fā)生降解。優(yōu)選PH保持在6-9之間。
當(dāng)使用非封端試劑時(shí)，可通過(guò)小心地調(diào)節(jié)反應(yīng)物的化學(xué)計(jì)量或通過(guò)使用第二種操作來(lái)控制分子量。二胺或二官能團(tuán)親電子試劑都可以過(guò)量使用，例如過(guò)量1-100％摩爾。這種化學(xué)計(jì)量法必須考慮任何在與二胺反應(yīng)前通過(guò)水解破壞的二官能團(tuán)親電子試劑。例如，當(dāng)在高PH下使用硫光氣時(shí)，要求用大量過(guò)量的硫光氣來(lái)補(bǔ)償與破壞它的氫氧化物的快速反應(yīng)。由于該副反應(yīng)的程度難于控制，優(yōu)選使用單官能團(tuán)封端試劑來(lái)控制分子量。當(dāng)使用第一種方法時(shí)，盡管可使用所提到的技術(shù)來(lái)控制數(shù)均分子量，但產(chǎn)物是具有某種分布形式的幾種分子量聚合物的混合物。
反應(yīng)物的加入順序是不重要的。然而，優(yōu)選順序是先加入二官能團(tuán)親電子試劑。當(dāng)使用非緩沖劑性的酸中和劑時(shí)，如氫氧化物，最優(yōu)選的方法是開始先加入一部分以便獲得需要的PH，然后其余部分與二官能團(tuán)親電子試劑同時(shí)加入。
濃度是不重要的，可以為0.5-50wt％，(以二胺的重量與溶劑的重量比表示)。優(yōu)選的范圍為0.5-5wt％。
下面描述為生產(chǎn)具有窄分散度聚硫脲所設(shè)計(jì)的第二種方法。在該方法中，鏈長(zhǎng)每次增加兩個(gè)重復(fù)單位，重復(fù)這種二步循環(huán)。為了說(shuō)明，考慮起始物質(zhì)是簡(jiǎn)單的二胺的情況(在上式中‘n’＝0)。用硫脲前體如硫光氣將二胺轉(zhuǎn)化為雙-異硫氰酸酯(在中式中‘n’＝0)。用過(guò)量的二胺處理雙-異硫氰酸酯，得到具有2個(gè)重復(fù)單位的硫脲低聚物(在下式中‘n’＝2)。為了增加鏈的長(zhǎng)度，按0，2，4，6等等的順序重復(fù)該系列操作。 在該方法中，每步的條件與上述產(chǎn)生多分散聚硫脲的第一種方法中所描述的條件相似。主要的區(qū)別在于在前面的方法中，反應(yīng)物的化學(xué)量接近1∶1。在該方法中，加入大量過(guò)量的試劑(在第一步中的硫脲和在第二步中的二胺)。增長(zhǎng)鏈與所加入試劑的摩爾比大致為1∶3-1∶50，優(yōu)選的范圍為1∶5-1∶10。
在任何步驟，都不必將生長(zhǎng)的鏈分離出來(lái)。優(yōu)選的方法是用過(guò)量的硫脲前體將二胺(或具有胺端的低聚物)處理足夠的時(shí)間，以便將胺端全部轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯。然后，通過(guò)萃取到與水不混溶的溶劑如二氯甲烷中，除去過(guò)量的硫脲前體。用過(guò)量的二胺處理雙-異硫氰酸酯的水溶液。然而，按照實(shí)施例中所描述的一個(gè)具體例子中所做的那樣，將雙-異硫氰酸酯分離是可能的。
可通過(guò)在與水混溶但對(duì)于產(chǎn)物是不良溶劑的溶劑中沉淀反應(yīng)溶液來(lái)分離產(chǎn)物。該溶劑的實(shí)例為丙酮，甲醇，乙醇，異丙醇。
制劑及其使用方法可使用抗HIV的陰離子低聚物來(lái)抑制被HIV-I病毒或其它相關(guān)的、具有g(shù)p120表面蛋白的病毒感染的細(xì)胞中合胞體的形成?？墒褂每笻IV的陰離子低聚物來(lái)治療AIDS和ARC以及其它由逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-I或其它具有g(shù)p120表面蛋白的相關(guān)病毒所引起的疾病。
抑制HIV感染細(xì)胞中合胞體形成所必需的抗HIV陰離子低聚物的量可以是任何有效的量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用濃度為10μg/ml的水性制劑時(shí)，抗HIV的陰離子低聚物可完全抑制合胞體的形成，以及將P24抗原(病毒復(fù)制指示劑)的量減小到300pg/ml以下。治療AIDS或ARC或其它由HIV感染引起的疾病時(shí)所給予的抗HIV陰離子低聚物的量可根據(jù)所使用的特定劑量單位，治療歷時(shí)，病人的年齡和性別，疾病的性質(zhì)和程度，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的人員所公知的因素，在較寬的范圍內(nèi)變化。而且，抗HIV低聚物可以與已知用于治療逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病的其它藥物和已知用于治療與逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的疾病有關(guān)的癥狀和并發(fā)癥的藥物聯(lián)合使用。
根據(jù)本發(fā)明，所給予的抗HIV陰離子低聚物的抗HIV有效量通常為病人體重的約0.1mg/kg到500mg/kg，并且每天可給予一次或多次。
可使用常規(guī)劑量單位形式，口服或非腸道給予抗HIV陰離子低聚物和藥用載體。
對(duì)于口服給藥，可將抗HIV陰離子低聚物制成固體或液體制劑如膠囊劑，丸劑，片劑，糖錠劑，錠劑，含片(melt)，粉劑，溶液，懸浮液或乳濁液。固體單位劑量形式可以是普通的硬或軟殼明膠型的膠囊，它包含例如表面活性劑，潤(rùn)滑劑和惰性填充劑如乳糖，蔗糖，山梨糖醇，磷酸鈣和玉米淀粉。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明陰離子低聚物可以用常規(guī)的片劑基質(zhì)如乳糖、蔗糖和玉米淀粉與賦形劑結(jié)合制片，所述賦形劑包括粘合劑如阿拉伯膠，玉米淀粉或明膠；給藥后有助于片劑崩解和溶解的崩解劑如馬鈴薯淀粉，藻酸，玉米淀粉和胍耳膠；改善片劑顆粒的流動(dòng)并抑制片劑原料粘著到片劑沖摸和沖頭表面上的潤(rùn)滑劑，例如滑石粉，硬脂酸或硬脂酸鎂、鈣或鋅，增強(qiáng)片劑的美觀并使得它們更易于被病人接受的染料、著色劑和矯味劑。在口服液體劑量形式中所使用的適宜的賦形劑包括稀釋劑如水和醇，例如乙醇，苯甲醇和聚乙二醇，和(或不)加入藥學(xué)上適用的表面活性劑，懸浮劑或乳化劑。
本發(fā)明抗-HIV陰離子低聚物可以以在生理適用稀釋劑和藥物載體中陰離子低聚物的可注射劑型通過(guò)非腸道途徑，即皮下、靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥，其中所述稀釋劑和載體可以為無(wú)菌液體或液體混合物如水，鹽水，葡萄糖水溶液和相關(guān)的糖溶液，醇如乙醇，異丙醇或十六醇，二醇如丙二醇或聚乙三醇，甘油酮縮醇如2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇，醚如聚(乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化的脂肪酸甘油酯，其中加入(或不加入)藥學(xué)適用的表面活性劑，如皂或洗滌劑，懸浮劑如果膠，carbomers，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素，或乳化劑和其它藥物佐劑。
可用于本發(fā)明非腸道制劑中的油的實(shí)例為來(lái)源于石油、動(dòng)物、蔬菜或合成油的那些油，例如花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉米油、欖橄油、凡土材和礦物油。適宜的脂肪酸包括油酸，硬脂酸，異硬脂酸。適宜的脂肪酸酯例如為油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。適宜的皂包括脂肪酸的堿金屬、銨和三乙醇胺的鹽，適宜的洗滌劑包括陽(yáng)離子洗滌劑，例如二甲基二烷基鹵化銨，烷基鹵化吡啶鎓和烷基胺乙酸鹽；陰離子洗滌劑，例如烷基、芳基和烯屬磺酸鹽，烷基，烯烴、醚和單甘油酯硫酸鹽和磺基琥珀酸鹽；非離子型洗滌劑，例如脂肪族胺氧化物，脂肪酸鏈烷醇酰胺，和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；和兩性洗滌劑，例如烷基-β-氨基丙酸酯，2-烷基咪唑啉季銨鹽及其混合物。典型地，本發(fā)明非腸道給藥組合物溶液將包含約0.5-25％(重量)的抗HIV陰離子低聚物。也可有利地使用防腐劑和緩沖劑。為了減少或消除注射部位的刺激，該組合物中可以包含具有約12-17親水親油平衡值(HLB)的非離子型表面活性劑。在該制劑中，表面活性劑的量約為5-15％(重量)。表面活性劑可以是具有上述HLB的單一組分或者可以是兩種或多種組分具有所需HLB的混合物。在非腸道給藥制劑中所應(yīng)用的表面活性劑的實(shí)例為聚乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯類，例如，脫水山梨醇單油酸酯。
本發(fā)明陰離子低聚物也可以用于預(yù)防，即預(yù)防病毒從感染個(gè)體傳染給未感染個(gè)體。病毒不但通過(guò)血液交換成比例地傳播，而且也可以通過(guò)其它體液交換傳播。因此，可以將本發(fā)明陰離子低聚物配制成標(biāo)準(zhǔn)的洗滌劑產(chǎn)物供洗滌用，尤其供處理感染個(gè)體血液產(chǎn)品的研究室和臨床實(shí)驗(yàn)室以及醫(yī)院使用。含有本發(fā)明低聚物的制劑可用于洗滌醫(yī)療/手術(shù)設(shè)備和器皿以及衛(wèi)生工作者的手和其它皮膚區(qū)域。本發(fā)明低聚物也可以以液體或粉劑的形式由避孕用具的使用者或者在出售前由生產(chǎn)者應(yīng)用于避孕用具如避孕套的表面。本發(fā)明低聚物也可以配制成灌洗組合物供女性在與感染個(gè)體進(jìn)行性接觸前后使用。本發(fā)明低聚物也可以制成潤(rùn)滑劑和使精子成酸性的凝膠劑和洗液。最后，本發(fā)明低聚物可配制為組合物，加到熱浴盆、旋渦浴和游泳池中滅活可能存在的病毒活性。
本發(fā)明可以由下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，其中所述實(shí)施例僅為本發(fā)明的范例。
定義除非另有說(shuō)明，如下定義本發(fā)明實(shí)施例中所使用的術(shù)語(yǔ)，而且舉出適宜的裝置或樹脂的例子，但也可以使用類似的裝置或不同的參數(shù)或樹脂TCID50-組織培養(yǎng)感染劑量，即在感染后7天使50％細(xì)胞感染有效的培養(yǎng)液的量(50％細(xì)胞致病作用)MTT-四唑鎓還原劑；3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物；RPMI＝一種細(xì)胞培養(yǎng)基；RF和GB8指HIV-1病毒株；MT4，C8166和TM為細(xì)胞系；P24test-Abbott指用通常由Abbott銷售的檢測(cè)試劑盒來(lái)測(cè)定病毒核心抗原的試驗(yàn)。
實(shí)施例1A
用特定的方法制備聚硫脲制備雙-異硫氰酸酯 將4，4’-二氨基聯(lián)苯-2，2’-二磺酸(1.2g，3.48mmol)與15ml水和600μL硫光氣一起劇烈攪拌3小時(shí)。另外加入硫光氣(250μL)，并將反應(yīng)物再攪拌14小時(shí)。通過(guò)用中等孔率的燒結(jié)玻璃過(guò)濾漏斗過(guò)濾來(lái)分離產(chǎn)物，得到70mg不溶性單體殘?jiān)Ｔ诖蠹s10mmHg下和低于50℃下，蒸發(fā)澄清的紅紫色濾液，真空干燥3小時(shí)，得到1.35g，31.5mmol雙異硫氰酸酯二水合物的淡紫色，易潮解固體。通過(guò)質(zhì)子和碳核磁共振及燃燒分析來(lái)確定產(chǎn)物的特性。制備未封端的聚硫脲
將過(guò)量4，4’-二氨基聯(lián)苯-2，2’-二磺酸(6.0g，46.5mmol)與2當(dāng)量NaHCO3(8.2g，97.6mmol)混合，使PH升至7.5。在10分鐘內(nèi)，向該攪拌的溶液中加入以上制備的雙-異硫氰酸酯(2.17g，4.67mmol，PH1.5)的溶液(30ml)。加完后，PH降至6.5并且將反應(yīng)物攪拌14小時(shí)。然后用12M HCl將PH調(diào)至1.8，并在8小時(shí)后將形成的白色固體過(guò)濾，并用25ml冷的0.1MHCl洗滌。將固體真空干燥，得到12.0g來(lái)反應(yīng)起始物(4，4’-二氨基-聯(lián)苯-2，2’-二磺酸)的白色固體。蒸發(fā)濾液，得到10.0g暗紫紅色固體。通過(guò)光譜學(xué)方法鑒別該濾液為幾乎純的聚硫脲(II，n＝0，有少量起始二胺(4，4’-二氨基-聯(lián)苯-2，2’-二磺酸)和NaCl污染)。
未封端聚硫脲的純化讓115g Pharmacia SephadexG-10(40-120μm大小的珠狀物)樹脂在大約500ml蒸餾水中膨脹1小時(shí)，準(zhǔn)備凝膠過(guò)濾柱。將懸浮液在1L量筒中沉降后，從樹脂混合物中傾析澄清液。將玻璃柱用樹脂按淤漿填充法填充并且將500ml蒸餾水通過(guò)柱子，得到2.5×50cm的樹脂床。使用Gilson Minipuls蠕動(dòng)泵保持恒定的流速通過(guò)柱子(流速大約為3-4ml/min)。在310nm(Isco型UA-5紫外檢測(cè)器監(jiān)測(cè)洗脫液中產(chǎn)物的存在。
將上述制備的50mg聚硫脲低聚物溶解在2.5ml蒸餾水中并小心地加到柱子的頂端。用蒸餾水洗脫柱子并收集三份產(chǎn)物流份(每份15ml)。通過(guò)HPLC分析流份表明第一流份中含聚硫脲，其中不含起始物二胺和鹽。
實(shí)施例1B-按照非特異性方法，用硫光氣來(lái)制備未封端的聚硫脲
將4，4’-二氨基聯(lián)苯-2，2’-二磺酸樣品(100mg，0.29mmol)加到50mL水中并緩慢加入大約4ml 0.1M NaOH來(lái)溶解固體。溶液的PH升至6.8。將該溶液加到MixxorTM(便于不混溶液體充分混合的裝置)中，并加入2.21ml(0.29mmol的硫光氣)硫光氣(100μL)在100ml氯仿中的貯備液。混合2分鐘后，通過(guò)加入大約2.5ml 0.1M NaOH將溶液的PH調(diào)至6-7。在45油浴中，將溶液加熱16小時(shí)，并蒸發(fā)掉溶劑。通過(guò)HPLC分析生成物固體表明產(chǎn)生了聚硫脲低聚物的混合物。
實(shí)施例1C用硫羰基-二咪唑來(lái)制備未封端的聚硫脲 將重結(jié)晶的4，4’-二氨基聯(lián)苯-2，2’-二磺酸(1.00g，2.91mmol)加到50ml水中形成淤漿，然后加入硫酸氫鈉(489mg，5.82mmol)。當(dāng)固體溶解時(shí)，生成物的PH達(dá)到6.5。在劇烈攪拌下，將硫羰基二咪唑(600mg，3.37mmol，Aldrich Chemical Co.)加到攪拌的溶液中，產(chǎn)生亮黃色。在5分鐘內(nèi)，顏色褪去并將反應(yīng)物攪拌24小時(shí)。此時(shí)，通過(guò)HPLC觀察到的低聚物的分布不隨時(shí)間而變化。真空(T＝35℃)蒸發(fā)溶劑，得到1.8g粗品硫脲低聚物，通過(guò)HPLC發(fā)現(xiàn)該低聚物所含的最大組分為n＝4(n＝4時(shí)，在254nm處，面積為9.9％)。
從未封端的低聚物制備封端的聚硫脲低聚物 將如上所述制備的未封端的聚硫脲低聚物(400mg)溶解在15mL水中。用5％鹽酸將PH調(diào)至4.5。在攪拌下，加入硫羰基二咪唑(100mg，Alcrich Chemical Co.)并且攪拌15分鐘后獲得PH6.6。HPLC分析表明將低聚物的分布變?yōu)橐幌盗懈H脂性的物質(zhì)(終端異硫氰酸酯)。加入甲苯胺(80mg)立即形成白色沉淀(甲苯胺硫脲)。將淤漿攪拌20分鐘(PH為7.0)后，將溶液過(guò)濾并將母液蒸發(fā)(10-1mm，35°)，得到537mg對(duì)甲苯胺封端的聚硫脲低聚物。HPLC分析表明有少量前體異硫氰酸酯封端的物質(zhì)(甲苯胺封端物質(zhì)是更親脂性的并且在更長(zhǎng)的滯留時(shí)間進(jìn)行系列洗脫)。
未封端聚硫脲低聚物的分級(jí)將上述制備的粗品-未封端的聚硫脲(500mg)溶解在2ml水中，并將溶液加到26mm×90cm大小的G-10排阻凝膠柱上(Pharmacia)。通過(guò)HPLC分析收集到的流份(20ml)，估計(jì)最初兩個(gè)具有紫外活性的流份(254nm)含n＝7.2。將這些合并并蒸發(fā)，得到140mg數(shù)均分散度n＝7.2的產(chǎn)物(通過(guò)1H NMR分析末端基團(tuán)法來(lái)測(cè)定)。結(jié)構(gòu)與13C和1H NMR分析結(jié)果一致。生物資料實(shí)施例I用TM細(xì)胞和GB8病毒株證明抗HIV低聚物防止合胞體形成和P24病毒核心抗原表達(dá)的能力為了顯示本發(fā)明的低聚物阻斷HIV感染，將CD4+T細(xì)胞(JM)暴露于HIV-I的GB8株GB8。病毒先與低聚物保溫15分鐘，然后加入細(xì)胞。吸附2小時(shí)后，去除病毒接種物，將細(xì)胞洗滌三次以除去痕量病毒，然后細(xì)胞在化合物存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后測(cè)定抗病毒活性，將四份培養(yǎng)物中所見合胞體的平均數(shù)與陰離子低聚物或其它試驗(yàn)化合物的濃度對(duì)數(shù)(log10)作圖。還通過(guò)測(cè)定上清液中病毒核心抗原(P24test-Abbott)測(cè)定了低聚物的效力。肝素、硫酸葡聚糖、rs CD4、ATZ和/或ddC數(shù)據(jù)(當(dāng)包含于下列任一表中時(shí))，作為陽(yáng)性對(duì)照。
表I
+抑制GB8病毒株引起的JM細(xì)胞中HIV-I誘導(dǎo)之合胞體形成達(dá)50％時(shí)的有效劑量。用MT-4細(xì)胞和RF病毒株測(cè)定抗-HIV低聚物抑制HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的能力在該試驗(yàn)中，向每個(gè)試管中加入1.5ml RPMI培養(yǎng)基以溶解試驗(yàn)化合物。然后通過(guò)在微量滴定板上將溶液稀釋二倍來(lái)測(cè)定化合物的HIV-I活性。每個(gè)孔中加入5×104個(gè)細(xì)胞和100 TCID50單位的病毒，并將滴定板在37℃下孵育7天。將MTT加入每個(gè)孔中，并將滴定板再孵育2小時(shí)。用酸性異丙醇將藍(lán)色的甲結(jié)晶溶解，并在540nm測(cè)定吸收度。
下表II顯示得到的數(shù)據(jù)。
表II
+在MTT測(cè)定中，對(duì)HIV-1誘導(dǎo)的MT-4細(xì)胞死于RF病毒株感染產(chǎn)生50％抑制作用的有效劑量。
*在MTT測(cè)定中，對(duì)MT-4細(xì)胞產(chǎn)生50％毒性的化合物的細(xì)胞毒性劑量?？?HIV低聚物對(duì)C8166 T細(xì)胞系中HIV-IRF生長(zhǎng)的作用實(shí)驗(yàn)方法在室溫下，用HIV-IRF將C8166細(xì)胞感染1小時(shí)。然后在RPMI中將細(xì)胞洗滌兩次并分配到組織培養(yǎng)板的孔中，其中各孔中含不同濃度的試驗(yàn)化合物或無(wú)試驗(yàn)化合物(對(duì)照)。在37℃下孵育3天后，觀察細(xì)胞中合胞體的含量并且用ELISA測(cè)定不含細(xì)胞的上清液中P24病毒核心抗原的水平。結(jié)果示于下表III和IV中。
表III
表V
<p>+在RF病毒株感染的C98166細(xì)胞中，對(duì)HIV-1誘導(dǎo)的合胞體和P24病毒抗原水平產(chǎn)生50％抑制作用的有效劑量。
權(quán)利要求
1.一種水溶性、剛性骨架的聚硫脲低聚物，它包含由式(I)所表示的化合物衍生的重復(fù)部分H2N-X-NH2(I)其中X為至少由一個(gè)磺酸基取代的二價(jià)芳香族亞烴基。
2.權(quán)利要求1中的低聚物，其中數(shù)均分子量小于10,000。
3.權(quán)利要求1中的低聚物，其中低聚物為其鹽的形式
4.權(quán)利要求1中的低聚物，它符合式(II) 其中R為氫，C1-C4烷基，苯基，或由0-2個(gè)R1基團(tuán)和不超過(guò)3個(gè)獨(dú)立地選自氯或溴原子、或C1-C4烷基的取代基取代的苯基；R1代表-SO3R2，-CO2R2，-PO3R2，或-OPO3R2；R2為氫或藥學(xué)上適用的陽(yáng)離子；R3為-R或-X-NHR，其中R如上所定義；X代表 Y代表-CO2-，-C≡C-，-N＝N-， m為整數(shù)0或1，前提條件為m＝0時(shí)，R1為氫原子，并且n為3-50的整數(shù)。
5.權(quán)利要求4中的低聚物，其中R為氫，m為1，R和R3為4-甲基苯基；n為3-15；并且X代表
6.權(quán)利要求4中的低聚物，其中m為1，R和R3為4-甲基苯基；n為3-15；并且X代表
7.含權(quán)利要求1或4的低聚物和藥學(xué)適用載體的藥物制劑。
8.含權(quán)利要求1-6中任一低聚物和洗滌劑的藥物制劑。
9.權(quán)利要求7中的藥物制劑，其為液體、粉劑、灌洗劑、凝膠劑或洗劑。
10.診斷和/或治療溫血?jiǎng)游锛膊〉姆椒ǎo予所述溫血?jiǎng)游镉行Я康臋?quán)利要求7的藥物制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述疾病為AIDS和/或ARC。
12.制備聚硫脲低聚物的方法，包括將芳香二胺與硫羰基二咪唑反應(yīng)。
13.制備聚硫脲低聚物的方法，包括在酸中和劑存在下，將芳香二胺與雙官能團(tuán)親電子試劑反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明的低聚物為具有3-50個(gè)由陰離子基團(tuán)取代的芳香二胺衍生的重復(fù)單位并且數(shù)均分子量小于10,000的聚硫脲。這些低聚物是水溶性的，優(yōu)選具有剛性骨架，并且是藥學(xué)上適用的。該低聚物可用于治療和/或診斷AIDS。
文檔編號(hào)C08G18/71GK1138323SQ95191138
公開日1996年12月18日 申請(qǐng)日期1995年1月3日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月3日
發(fā)明者M·J·穆里斯, W·A·福里德斯, W·J·克魯皮爾, N·P·皮特, A·D·加爾尼 申請(qǐng)人:默里爾藥物公司, 陶氏化學(xué)公司