專利名稱：生物耐受的低分子量聚氮丙啶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低分子量聚氮丙啶(polyethylenimine)、含有低分子量聚氮丙啶的用于將核酸插入細胞中的載體、及此低分子量聚氮丙啶和載體的制備方法和用途。
在人體的臨床研究方面，體內(nèi)給予DNA至今沒有取得任何顯著成功的治療作用。其原因尤其在于基因轉(zhuǎn)移的低效性和基因信息表達的局限性[Cotton等，酶學方法學(Meth.Enzymol.)217:618-644(1993)]以及所用陽離子載體物質(zhì)生物適應(yīng)性的不足[Choksakulnimitr等，控制釋放雜志(J.Control.Rel.)34:233-241(1995)]。盡管病毒載體，如反錄病毒[Miller，自然(Nature)357:455-460(1992)]或腺病毒[Mulligan，科學(Science)260:926-932(1993)]，在體外試驗中顯示出很有希望的結(jié)果，但由于它們的致炎性和免疫原性，及其在細胞基因組中的誘變和整合，它們在體內(nèi)的應(yīng)用仍受到限制[Crystal，科學(Science)270:404-410(1995)]。非病毒的載體，不僅比病毒系統(tǒng)更易操縱，而且也可用一可靠而有效的方式將DNA匯集到細胞中，它提供了另一種可能的選擇[Tomlinson和Rolland，控制釋放雜志(J.Contr.Rel.)39:359-372(1996)]。
隨著時間的推移，基于水溶性陽離子聚合物如聚合左旋賴氨酸(PLL)[Wu和Wu，生物治療(Biotherapy)3:87-95(1991)]、二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-dextran)[Gopal，生物細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)(5:1183-93(1985)],dendrimers[Haensler和Szoka，生物共軛化學(Bioconjugate Chem.)4:372-379(1993)]或陽離子異丁烯酸衍生物[Wolfert等，人類基因治療(Hum.Gene Ther.)7:2123-2133(1996)]的合成載體已經(jīng)發(fā)展替代了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方式，即采用陽離子類脂化合物[Gao和Huang，基因治療2:710-722(1995)]和兩親性物質(zhì)[Behr，生物共軛化學5:382-389(1994)]的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。采用陽離子聚合物的聚合轉(zhuǎn)染法的突出優(yōu)點在于無數(shù)可能的結(jié)構(gòu)變化，會以理想方式影響聚合物及它們的質(zhì)粒/聚合物絡(luò)合物的物理化學特性和生物特性?，F(xiàn)已有可能通過附加的偶合細胞特異性配體如運鐵蛋白[Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.87:3410-3414(1990)]、脫唾液酸糖蛋白[Wu和Wu，生物化學雜志262:4429-4432(1987)]、各種抗體[Trubetskoy等，生物共軛化學3:323-327(1992)]和碳水化合物[Midoux等，核酸研究21:871-878(1993)]顯著地增加這些載體的效能。
在許多不同的粘著和懸浮細胞系中，具有三維分支結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物聚氮丙啶(PEI)在某些情況下使轉(zhuǎn)染速度大大高于平均值[Boussif等，基因治療3:1074-1080(1996)]。例如，3T3成纖維細胞在體內(nèi)可有高達95％被轉(zhuǎn)化。小鼠腦中體內(nèi)進行的PEI介導的基因轉(zhuǎn)移導致了神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中的報告基因和Bcl2基因的長期表達，其大小與在腺病毒基因轉(zhuǎn)移中相同[Abdallah等，人類基因治療7:1947-1954(1996)]。
PEI與其他文獻記載的聚合陽離子，如PLL[Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.87:3655-3659(1990)]、異丁烯酸衍生物[Cherng等，藥學研究13:1038-1042(1996)]或二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-dextran)[Gopal，分子細胞生物學5:1183-93(1985)]相比具有突出的特性。由于其交聯(lián)結(jié)構(gòu)和高電荷密度，它能高度凝集和絡(luò)合質(zhì)粒。然后能以這些絡(luò)合物的形式將DNA匯集進入細胞。至今尚未最后搞清PEI/質(zhì)粒絡(luò)合物的吸收、細胞內(nèi)過程和溶變性的機制。
PEI主要的優(yōu)點在于其結(jié)構(gòu)的pH依賴性變化，這導致核內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的不穩(wěn)定，因而利于將絡(luò)合物釋放到細胞質(zhì)中。尤其此分子的氨基官能團具有不同的pKa值，使PEI具有明顯的緩沖能力(“質(zhì)子海綿”)，在使核內(nèi)體酸化時，導致聚合物的質(zhì)子化和由此產(chǎn)生的膨脹，從而使小泡膜斷裂。由核內(nèi)體ATP酶介導的質(zhì)子流入可能在此時導致陰離子氯化物被動注入，當PEI存在時，可導致離子總濃度的明顯提高和核內(nèi)體的滲透膨脹[Behr,Chimia 51:34-36(1997)]。由于此原因，轉(zhuǎn)染聚合賴氨酸(PLL)所必需的氯喹之類的溶酶體劑，不會影響轉(zhuǎn)染PEI的速度[Remy和Behr，類脂研究雜志6:535-544(1996)]。
WO9602655A1記載了分子量為5萬道爾頓和80萬道爾頓(Da)的高分子量PEI(摩爾質(zhì)量分別為50,000g/mol和800,000g/mol)，用于細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染DNA的用途。
根據(jù)制造商提供的信息(如Fluka,Neu Ulm)，市售的PEI分子量為60-100萬道爾頓。這樣的高分子量PEI制品(HMW PEI)從濃度0.01mg/ml開始，并經(jīng)3小時的短期孵化后具有顯著的細胞毒性。另外PEI結(jié)構(gòu)不能經(jīng)酶解和水解而分解，因而不能被生物降解。而且，HMW-PEI可能不經(jīng)糞便和腎臟排泄。
因此體內(nèi)給藥至今仍在使用的HMW PEI，如用于基因治療，有相當大的危險。
本發(fā)明涉及分子量小于50,000道爾頓的PEI，優(yōu)選500Da-30,000Da的PEI(低分子量PEI:LMW PEI)；還涉及制備此LMW PEI的方法；以及LMW PEI與病毒和非病毒核苷酸序列或核酸形成絡(luò)合物用以將核苷酸序列插入細胞中的用途；涉及為達到預(yù)防或治療疾病的目的，將這一細胞給哺乳動物的用藥方法；還涉及為達到預(yù)防或治療疾病的目的，將與核苷酸序列形成絡(luò)合物的LMW PEI給哺乳動物的用藥方法。
本發(fā)明涉及一種載體，此載體含有一種低分子量的聚氮丙啶(LMWPEI)和一種核酸(核苷酸序列)，LMW PEI的分子量低于50,000道爾頓。本發(fā)明尤其涉及將核酸結(jié)構(gòu)插入細胞中的載體，此載體含有由分子量小于50,000Da的PEI和核酸組成的絡(luò)合物，核酸優(yōu)選非病毒或病毒核酸結(jié)構(gòu)。
LMW PEI優(yōu)選分子量500至30,000道爾頓。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施例中，LWM PEI分子量1000至5000道爾頓。尤其優(yōu)選分子量大約為2000道爾頓者。
本發(fā)明涉及含有低分子量PEI和核酸的載體，通過向單體氮丙啶的水溶液中加入鹽酸聚合制得LMW PEI聚合物，水溶液中單體氮丙啶的濃度優(yōu)選0.1％至90％，其中加入濃鹽酸(37％)的濃度優(yōu)選0.1％-10％。
本發(fā)明涉及一種含有低分子量PEI和核酸的載體，在0.1M pH4-pH10范圍內(nèi)的不同pH的磷酸鹽緩沖液中進行膨脹研究，LMW PEI不出現(xiàn)任何渾濁或沉淀。
本發(fā)明涉及一種含有低分子量PEI和核酸的載體，當應(yīng)用此載體時，轉(zhuǎn)染率高于1％，優(yōu)選轉(zhuǎn)染率為5％或更高，在特定的實施例中，轉(zhuǎn)染率可達10％或更高。
核酸可以是DNA或RNA。核酸可以是低聚核苷酸(寡核苷酸)或核酸結(jié)構(gòu)。核酸優(yōu)選病毒或非病毒核酸結(jié)構(gòu)。核酸結(jié)構(gòu)優(yōu)選基因或質(zhì)粒。核酸結(jié)構(gòu)可以含有一個轉(zhuǎn)基因。核酸結(jié)構(gòu)可以含有一或多個效應(yīng)基因。效應(yīng)基因可以將藥學活性化合物或其前體藥物形式編碼，和/或?qū)⒚妇幋a。核酸結(jié)構(gòu)優(yōu)選成形為可使基因(如效應(yīng)基因或轉(zhuǎn)基因)特異性表達的形式，例如，病毒特異性(即，例如只在病毒感染的細胞內(nèi))，(靶)細胞特異性，涉及新陳代謝的特異性，細胞周期特異性，涉及進化的特異性；或使基因非特異性表達的形式。在最簡單的例子中，核酸含有一個為所需的蛋白質(zhì)編碼的基因，和基因含有特異的啟動子序列，適當情況下還有調(diào)節(jié)序列。為增強和/或擴大基因表達可以存在例如病毒啟動子序列和/或增強因子序列。例如Dillon,TiBTech11,167(1993)綜述了具有此特性的啟動子序列和/或增強因子序列。這些序列的例子是Rous肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)，巨細胞病毒(CMV)的啟動子和增強因子區(qū)域，腺(病毒)伴隨病毒(AAV)的末端反向重復(fù)(ITR)序列和/或啟動子序列p5、p19、p40，腺病毒的ITR和/或啟動子序列，痘苗病毒的ITR和/或啟動子序列，皰疹病毒的ITR和/或啟動子序列，細小病毒的啟動子序列和乳頭瘤病毒的啟動子序列(上游調(diào)節(jié)區(qū)域)。
LMW PEI與核酸作為兩個起始物質(zhì)通過混合而形成絡(luò)合物。優(yōu)選導致生成具中性或陽性電荷的絡(luò)合物的混合比例。優(yōu)選載體由含有高于50％(重量百分比)的LMW PEI的絡(luò)合物組成。優(yōu)選LMW PEI與核酸的重量比為3∶1或更高的載體，尤其優(yōu)選重量比等于或高于5∶1，或等于或高于8∶1。
效應(yīng)基因可以與一個配體一起表達為一融合蛋白標記物，例如當除效應(yīng)基因序列之外，核酸結(jié)構(gòu)也含有一個編碼配體的序列時。
本發(fā)明普遍涉及一種載體，其含有一種LMW PEI、一種核酸，適當時還有一個配體。此載體的各個組分優(yōu)選以共價鍵和/或吸附鍵連接。如被編碼的蛋白和/或LMW PEI可以與一配體偶合。本發(fā)明尤其涉及一種載體，其中LMW PEI與細胞特異性的(或靶細胞特異性的)配體偶合。
優(yōu)選細胞特異性的或靶細胞特異性的配體。靶細胞特異性配體可以與靶細胞外膜結(jié)合，優(yōu)選動物或人的靶細胞。靶細胞特異性的配體對靶細胞具有高度特異性。含有靶細胞特異配體的載體可以用于核酸的靶細胞特異轉(zhuǎn)移。例如靶細胞可以為內(nèi)皮細胞、肌肉細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、(神經(jīng))膠質(zhì)細胞、造血細胞、腫瘤細胞如白血病細胞、病毒感染細胞、支氣管上皮細胞、或肝細胞，如肝的竇狀細胞。
一種與內(nèi)皮細胞特異性地結(jié)合的配體例如可以選自對內(nèi)皮細胞專一的單克隆抗體或其片段，末端攜帶甘露糖的糖蛋白、糖脂或多糖，細胞因子，生長因子，吸附分子，或特別優(yōu)選來自有內(nèi)皮細胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一種與平滑肌細胞特異性結(jié)合的配體可以選自對肌動蛋白專一的單細胞克隆抗體或其片段，細胞膜受體和生長因子，或尤其優(yōu)選來自有平滑肌細胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一種與巨噬細胞和/或淋巴細胞特異性結(jié)合的配體可以選自對巨噬細胞和/或淋巴細胞上的膜抗原特異的單克隆抗體，完整的免疫球蛋白，或?qū)奘杉毎?或淋巴細胞上的膜抗原特異的單克隆抗體或多克隆抗體的Fc片段，細胞因子，生長因子，末端攜帶甘露糖的肽，蛋白質(zhì)，類脂或多糖，或特別優(yōu)選來自病毒被膜的糖蛋白，尤其是在核苷酸872位置有突變的流感C病毒HEF蛋白或含有催化三聯(lián)體絲氨酸71、組氨酸368或369和天冬氨酸261的流感C病毒HEF斷裂產(chǎn)物。一種與神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性結(jié)合的配體可以選自特異性與神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜結(jié)構(gòu)鍵和的抗體或抗體片段、吸附分子、末端攜帶甘露糖的肽、、蛋白質(zhì)、類脂或多糖、生長因子，或特別優(yōu)選來自具有神經(jīng)膠質(zhì)細胞向性的病毒被膜的糖蛋白。一種與造血細胞特異性結(jié)合的配體可以選自對干細胞因子受體特異的抗體或抗體片段、IL-1(尤其是Ⅰ或Ⅱ類受體)、IL-3(尤其是α或β受體)、IL-6或粒細胞巨噬集落刺激因子(GM-CSF)，也可以是顯示此特異性的完整的免疫球蛋白或可結(jié)晶片段(FC fragments)和生長因子，如干細胞生長因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-6或粒細胞巨噬集落刺激因子及其與有關(guān)受體結(jié)合的片段。一種與白血病細胞特異性結(jié)合的配體可以選自抗體、抗體片段、免疫球蛋白或特異性與白血病細胞膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的Fc片段，如分化簇13(CD13)、CD14、CD15、CD33、細胞粘著分子(CAMAL)、sialosyl-Le、CD5、CD1e、CD23、M38、IL-2受體、T細胞受體、CALLA或CD19，也可以是生長因子或由此衍生的片段，或類視色素。一種特異性地與病毒傳染細胞結(jié)合的配體可以選自抗體、抗體片段、完整的免疫球蛋白或?qū)Σ《究乖刑禺愋缘腇c片段，病毒感染后它在被感染的細胞膜上表達。一種特異性地與支氣管上皮細胞結(jié)合的配體可以選自運鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白如脫唾液酸血清類粘蛋白、新糖蛋白或半乳糖、胰島素、末端攜帶甘露糖的肽、蛋白質(zhì)、類脂或多糖、完整的免疫球蛋白或特異性與靶細胞結(jié)合的Fc片段，或特別優(yōu)選來自特異性地與靶細胞結(jié)合的病毒被膜的糖蛋白。歐洲專利0790312和0846772公開了配體的其他詳細的例子。
本發(fā)明進一步涉及通過氮丙啶(單體氮丙啶)的開環(huán)聚合作用制備基于聚氮丙啶的低分子量、陽離子性的共軛聚合物(LMW PEI)的方法。
在此申請中，優(yōu)選按Wenker(JACS 57:2328(1935))法從乙醇胺制備氮丙啶。沸點優(yōu)選在55.0℃-56.0℃。
德國專利申請665,791(1938)公開了通過向單體氮丙啶液體中加入如酸或三氟化硼等催化劑合成PEI的方法。根據(jù)此發(fā)明，在單體氮丙啶水溶液中加入鹽酸使其聚合，這與Dick等發(fā)表在《大分子科學雜志》A4:1301-1314(1970)上的方法相似。
為了進行聚合反應(yīng)，攪拌下在蒸餾水中制備0.1％-90％氮丙啶(單體)溶液并加入0.1-10％濃鹽酸(37％)作為催化劑。聚合反應(yīng)進行1-30天，優(yōu)選4天，反應(yīng)溫度30℃-70℃，優(yōu)選50℃。
以13C-NMR光譜分析法、粒度分離色譜法、光散射法和/或粘度測定法表征此聚合物。B.Vollmert(1962)“Grundriss derMakromolekularen Chemie(高分子化學概述)”，SpringerVerlag,Berlin,Pages216-225闡述了用光散射法測定分子量的方法。優(yōu)選以光散射法測定分子量，尤其優(yōu)選用分光光度計進行激光散射測定法，如將樣品直接注入一K5測定池后用Wyatt Dawn DSP分光光度計在633nm測定。可以用在甲苯中測定的標準常數(shù)和已知的初始樣品重量確定分子量。
所述的方法可以用于制備分子量在500道爾頓-50,000道爾頓的LMW PEI。因此LMW PEI的分子量顯著低于HMW PEI，并顯著低于5萬Da這一腎臟的閾值，這意味著能夠確保LMW PEI的腎排泄。
出乎意外地，就其作為將核酸或核酸結(jié)構(gòu)插入細胞的載體的效能和其生物相容性而言，LMW PEI顯著優(yōu)于HMW PEI。分子大小在1000Da至30,000Da的LMW PEI最適用。LMW PEI可以結(jié)合DNA，凝聚DNA，并增強DNA的正電荷特性。當與含有報告基因的DNA絡(luò)合后，分子量約為2000道爾頓的LMW PEI(在血清中)導致在哺乳動物細胞中報告基因的不同水平的表達(如在小鼠成纖維細胞(3T3)和人內(nèi)皮細胞(ECV304)中)，這比市售高分子量(HMW)PEI的效果高100倍。同時，LMW PEI對成纖維細胞的細胞毒性顯著低于HMW PEI。
本發(fā)明因此涉及分子量小于50,000道爾頓的聚氮丙啶，優(yōu)選分子量為500-30,000道爾頓者(LMW PEI)，涉及制備這種LMW PEI的方法，及LMW PEI與病毒和非病毒核苷酸序列形成的絡(luò)合物用于將核苷酸序列插入細胞中的用途，涉及將此細胞用于哺乳動物以達到預(yù)防或治療疾病目的的給藥方法，還涉及將與核苷酸序列形成絡(luò)合物的LMW PEI用于哺乳動物以達到預(yù)防或治療疾病目的的給藥方法。
本發(fā)明涉及分子量小于50,000道爾頓的LMW PEI，優(yōu)選用本申請公開的方法制備的LMW PEI。
本發(fā)明還涉及分子量小于50,000道爾頓的LMW PEI，優(yōu)選1000-30,000道爾頓，尤其優(yōu)選2000道爾頓的LMW PEI的用途。LMW PEI可以用于將核酸插入細胞，用于制備將核酸插入細胞的載體，或用于制備一種藥物和/或用于基因治療。
本發(fā)明進一步涉及制備將核酸插入細胞的載體的方法。例如可以通過將適量的LMW PEI與適量的核酸混合制備此載體。LMW PEI與核酸優(yōu)選在水溶液中混合。
本發(fā)明進一步涉及此載體的用途。例如此載體可以用于將核酸插入細胞或靶細胞(轉(zhuǎn)染或聚合轉(zhuǎn)染)，或制備藥物和/或用于基因治療。本發(fā)明優(yōu)選涉及此載體將非病毒或病毒核酸結(jié)構(gòu)插入細胞的用途，和涉及將此轉(zhuǎn)染細胞用于病人以達到預(yù)防或治療疾病的目的的用途，這類轉(zhuǎn)染細胞可以是內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、肝細胞、成纖維細胞、肌肉細胞或上皮細胞，可以把這些細胞局部注入皮膚、皮下、肌肉內(nèi)、傷口中、體腔內(nèi)、器官或血管中。在另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及載體在預(yù)防或治療疾病中的用途，例如，可以將載體局部注入皮膚、皮下、肌肉內(nèi)、傷口中、體腔內(nèi)、器官或血管中。
LMW PEI或含有LMW PEI的載體，可以用于將核酸插入細胞/靶細胞，此細胞/靶細胞可以是內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、肝細胞、成纖維細胞、肌肉細胞或上皮細胞。
本發(fā)明進一步涉及將這些細胞與LMW PEI和/或載體一起孵化制備轉(zhuǎn)染細胞或靶細胞的方法。優(yōu)選在體外進行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還涉及含有LMW PEI和/或本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)染細胞或靶細胞。本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)染細胞作為藥物的用途，或用于制備藥物和/或用于基因治療的用途。
本發(fā)明進一步涉及含有一種LMW PEI和/或一種本發(fā)明載體和/或一種轉(zhuǎn)染細胞的藥物。本發(fā)明也涉及將一種核酸與LMW PEI混合，適當時加入其它附加劑，制備藥物的方法。
由于本發(fā)明LMW PEID的結(jié)構(gòu)分支遠遠少于HMW PEI，并因此比HMW PEI含有更多的氨基，與HMW PEI相比有更多的機會將LMWPEI與細胞特異的配體偶合。本發(fā)明因此涉及LMW PEI與有細胞特異性的配體偶合，并涉及此偶合產(chǎn)物與病毒或非病毒序列形成絡(luò)合物，將核苷酸序列插入細胞中的用途，或涉及為達到預(yù)防、治療疾病的目的將此絡(luò)合物給哺乳動物藥用的用途。專利申請EP97101506.0和DE19649645.4已詳細公開了細胞特異性配體的制備和偶合的可能性。這些專利申請在此作為參考。
LMW PEI(適當時與細胞特異性配體偶合)與病毒或非病毒核酸結(jié)構(gòu)形成的絡(luò)合物構(gòu)成一種基因治療的載體。在一優(yōu)選的實施例中，這些載體給病人局部外用或內(nèi)用于體腔、組織、血液循環(huán)、呼吸道、胃腸道或尿道，或肌肉內(nèi)或皮下用藥。
由本發(fā)明載體可以以一種非細胞特異或細胞特異的方式將效應(yīng)基因匯集入靶細胞，此處的效應(yīng)基因優(yōu)選為藥物活性化合物編碼或為使一種活性化合物的非活性前體裂解為活性化合物的酶編碼的基因?？梢赃x擇效應(yīng)基因使藥物活性化合物或酶與配體一起表達為融合蛋白標記物，此配體與細胞表面結(jié)合，如增殖內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞。
本發(fā)明也涉及已由本發(fā)明的LMW PEI將核酸結(jié)構(gòu)插入其中的酵母或哺乳動物細胞。在特別優(yōu)選的實施例中，用本發(fā)明的LMW PEI將核酸結(jié)構(gòu)引入細胞系中，這些細胞系在轉(zhuǎn)染后，可以用于表達轉(zhuǎn)基因。這些細胞因此可以制備用于病人的藥物。與核酸結(jié)構(gòu)形成絡(luò)合物的本發(fā)明LMW EPI的優(yōu)選的用途是制成藥劑治療疾病，該制劑包括核酸結(jié)構(gòu)在靶細胞中的插入，及此結(jié)構(gòu)以病毒特異或靶細胞特異或代謝特異或非特異方式和細胞周期特異性方式的表達。
本發(fā)明進一步涉及哺乳動物細胞的用藥方法，其中用本發(fā)明的LMW PEI將核酸結(jié)構(gòu)插入細胞中，以制備一種治療疾病的藥物。如，可以從血液中分離內(nèi)皮細胞，在體外用本發(fā)明載體處理，然后以靜脈注入的方式進入人體。
這些在體外被轉(zhuǎn)染的細胞，也可以與本發(fā)明載體組合給病人用藥。這種組合意指細胞和載體，分別同時或在不同時間，在同一或不同部位用藥或注射用藥。
實施例1)方法a)低分子量聚氮丙啶(LMW PEI)的制備通過采用酸催化劑將氮丙啶在水溶液中進行開環(huán)聚合反應(yīng)得到LMW PEI。對此，向10％氮丙啶單體水溶液(5ml氮丙啶單體+45ml蒸餾水，攪拌溶解)中加入1％(0.5ml)濃鹽酸(37％)催化劑，在50℃攪拌4天，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并在室溫真空干燥。直接將LMW PEI注入一K5測定池中，用激光色散測定法(Wyatt Dawn DSP分光光度計)在633nm測定分子量。根據(jù)在甲苯中測定的標準常數(shù)和已知的初始樣品重量計算克分子量。
用分光分析法測定的分子量為2000道爾頓。用分光分析法測定的市售PEI(Fluka,Neu Ulm)的分子量為791kDa(HMW PEI)。
將LMW PEI與HMW PEI兩種試樣進行對照試驗。b)聚核苷酸絡(luò)合物的制備按Boussif等(Boussif等，Proc.Natl.Acad.Sci.92:7297-7301(1995))的方法將DNA質(zhì)粒與PEI絡(luò)合。9mg50％市售HMW PEI溶液或9mgLMW PEI溶于9ml雙蒸水中用1NHCl將pH調(diào)節(jié)到7.4，然后以水定溶到總體積10.0ml。制得的溶液經(jīng)過濾滅菌(0.2μm)，可以在4℃儲存較長時間。
對于制備絡(luò)合物，10μg質(zhì)粒和不同量的PEI儲備液均以150mMNaCl稀釋到250μl，在渦流器中混合。表1給出了制備絡(luò)合物的混合比例和當量比。在室溫保溫10分鐘后，聚合物溶液分份地滴加到質(zhì)粒溶液中并在渦流器中混合。將絡(luò)合物再保溫10分鐘后，將其加入細胞培養(yǎng)介質(zhì)中。c)瓊脂糖遷移測定法在瓊脂糖遷移測定法中檢驗不同PEI與質(zhì)粒結(jié)合的能力。方法為，將1.35-27μgHMW PEI和2.7-90μgLMW PEI均分別與10μg質(zhì)粒絡(luò)合(表1)。將50μl的等分試樣加載于厚度約0.5cm的1％(w/v)瓊脂糖凝膠上，在80mV電壓下，在pH7.4的三(羥甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)緩沖液中展開2小時。與溴化乙錠反應(yīng)后，在254nm觀測DNA的位置。
為從絡(luò)合物中顯示質(zhì)粒，在生成絡(luò)合物30分鐘后向每10μgDNA絡(luò)合物中加入50μl或100μl葡聚糖硫酸鹽溶液(Mw5000,10mg/ml,Sigma,Deisenhofen)。d)細胞培養(yǎng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準條件下進行L929小鼠成纖維細胞培養(yǎng)。將這些細胞散布在96孔的細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度為8000個細胞/孔，培養(yǎng)24小時后進行細胞毒性試驗。
在標準條件下以同樣方法培養(yǎng)3T3成纖維細胞。
自發(fā)地轉(zhuǎn)化的胞外病毒(ECV)304(ATCC,Rockville,MD USA)，附著于被顯性正?？刂拼a確定的人內(nèi)皮細胞系，將其在Dulbecco's改良Eagle’s介質(zhì)(DMEM)(Gibco,Eggenstein)中培養(yǎng)，此介質(zhì)含5％胎牛血清(FCS)、5％馬血清和1％N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷(氨)酰胺(均來自Gibco,Eggenstein)。
在37℃、相對濕度95％和5％二氧化碳條件下孵化的此細胞，達到融合后，用胰蛋白酶/乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)溶液(2.5％胰蛋白酶儲備液，50mM乙二醇四乙酸溶液，pH7.4磷酸緩沖鹽溶液，1∶1∶8)進行細胞傳代每周兩次。由于細胞以細胞簇的形式而非單個從培養(yǎng)基脫落，因此可分別進行1/8傳代。
按照Bowman等[(1983)神經(jīng)病學年刊(Ann.Neurol.)14:392-402]和Mischek等[Mischek等，細胞組織研究(Cell.Tiss.Res.)256:221-226(1989)]的方法分離和培養(yǎng)大腦毛細血管內(nèi)皮細胞。為了進行轉(zhuǎn)染實驗，在分離后立即將其散布在6孔細胞培養(yǎng)皿中直至約50％融合。e)細胞毒性研究按照Mosmann等的方法[Mosmann，免疫法雜志，65:55-63(1983)]，在L929小鼠成纖維細胞上，采用MTT測定法測定聚合物的細胞毒性。在極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中用10％FCS和2mM谷(氨)酰胺制備聚合物的系列稀釋液，然后過濾滅菌(0.2μm,Schleicher&Schuell,Dassel)。需要時調(diào)整溶液的pH和滲透壓。細胞預(yù)孵化24小時后，聚合物溶液與細胞混合，并孵化1、3、12和24小時。用紫外分光光度法測定甲(formazan)濃度以對細胞生存能力定量。
在第二組試驗中，只溫和地用聚合物處理細胞1小時，然后清洗，在無PEI的細胞培養(yǎng)介質(zhì)中再培養(yǎng)3、12、24小時。按上述方法定量測定。f)轉(zhuǎn)染將散布在3cm2培養(yǎng)皿中的ECV304細胞和3T3小鼠成纖維細胞，及散布在6孔培養(yǎng)皿中的初級內(nèi)皮細胞，在試驗前即刻以pH7.4磷酸鹽緩沖液清洗，并提供新鮮的血清補充介質(zhì)。在每孔或每盤中加入相當于3.33μgDNA的HMW PEI和LMW PEI絡(luò)合物，在37℃孵化1小時。然后將細胞孵化60小時，類似于章節(jié)9的方法和按廠商說明書測定熒光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。[HMW PEI和LMW PEI絡(luò)合物為相應(yīng)的載體，它們分別含有HMW PEI和LMW PEI，和核酸，此處為DNA質(zhì)粒]。例2結(jié)果a)PEI的物理化學性質(zhì)用在pH4-10范圍內(nèi)不同pH值的0.1M磷酸鹽緩沖溶液進行的膨脹研究，闡明聚合物在核內(nèi)體/溶酶體區(qū)室內(nèi)的反應(yīng)特點。當HMW PEI在pH9和pH10溶解時，形成澄清無殘渣的溶液，在pH8及以下則可以看到高度渾濁。這種渾濁在pH7及pH8基本穩(wěn)定。幾小時后才出現(xiàn)沉降。相反，在pH酸性范圍，在30分鐘內(nèi)形成易于再次懸浮的沉積物。在同樣條件下，LMW PEI不產(chǎn)生任何渾濁或沉淀，而形成澄清溶液。b)細胞毒性研究在L929小鼠成纖維細胞上進行體外PEI細胞毒性測定，各種標準化組織推薦此成纖維細胞為用于測定聚合物的細胞毒性和生物相容性的標準細胞培養(yǎng)模型。預(yù)試驗確定所形成的甲(formazan)的吸收和在1×103-3×104范圍內(nèi)細胞數(shù)量之間的直接、線性的比例關(guān)系。在24小時生長階段后，8000細胞/孔與聚合物溶液混合，并孵化1、3、12和24小時。在0-1.0mg/ml范圍內(nèi)，可觀察到的HMW PEI和LMW PEI的毒性效應(yīng)在24小時內(nèi)呈時間和濃度依賴性，高分子量和低分子量PEI的細胞毒性曲線顯示顯著的不同。因此，對于HMW PEI,IC50在0.06mg/ml(1小時孵化)和0.04mg/ml(24小時孵化)之間，而濃度在0.1和1.0mg/ml之間的LMW PEI只在孵化12小時后才有毒性，只有當濃度約為0.1mg/ml的LMW PEI經(jīng)24小時孵化后才能夠測得其IC50值。c)瓊脂糖凝膠遷移測定法為確定質(zhì)粒和PEI之間的最佳結(jié)合和數(shù)量比例，將一定量的質(zhì)粒(10μg)按規(guī)程與不同濃度的HMW PEI和LMW PEI絡(luò)合，然后進行電泳分析。表1給出了所測定的絡(luò)合物的混合比例、所用儲備液體積和PEI的絕對量。
表1a)
b)
表1含有a)HMW PEI和b)LMW PEI用于電泳和轉(zhuǎn)染的絡(luò)合物混合比例圖經(jīng)溴化乙錠染色顯示質(zhì)粒與其絡(luò)合物的位置。DNA形成兩個與質(zhì)粒的超螺旋環(huán)形形態(tài)相對應(yīng)，并向陽極方向遷移的熒光帶。用溴化乙錠不能測得HMW PEI和LMW PEI。
以1+1比例進行的DNA和HMW PEI的絡(luò)合導致部分而非全部阻礙加樣處質(zhì)粒的遷移。降低總加樣量和/或增加加樣直徑，會阻止形成的絡(luò)合物在凝膠基質(zhì)中的遷移。
按1+6到1+20比例的絡(luò)合物不能檢出，因為它們不顯示任何熒光；這提示溴化乙錠受質(zhì)粒排斥，因為其結(jié)構(gòu)受到HMW PEI的充分凝聚和物理性壓縮。對于這些絡(luò)合物，陰電荷/陽電荷比例從1∶1.2(1+6)至1∶4(1+20)。因此絡(luò)合物總體帶有正電荷。
2.7μgLMW PEI幾乎可以全部結(jié)合和阻止10μg質(zhì)粒。然而，此絡(luò)合物總體為負電荷，并向陽極遷移。然而只在LMW PEI≥54μg時能觀察到完全的陽離子和DNA的凝聚。
為驗證高和低分子量PEI的凝聚效應(yīng)，用過量的葡聚糖硫酸鹽從已形成的絡(luò)合物中代替DNA，將葡聚糖硫酸鹽與陽離子聚合物進行競爭性反應(yīng)。對于HMW PEI和LMW PEI,DNA可以再次從絡(luò)合物中釋放，全部或部分DNA可以遷移進入凝膠基質(zhì)。溴化乙錠可以再次進入DNA結(jié)構(gòu)中，因此可以用熒光法測得DNA。d)體外轉(zhuǎn)染效能用細胞系(3T3小鼠成纖維細胞和人內(nèi)皮細胞系ECV304)和初級培養(yǎng)物(豬腦毛細血管內(nèi)皮細胞)測定PEI絡(luò)合物的轉(zhuǎn)染效能。Promega市售的pGL3控制載體，它在SV40啟動子和增強因子控制下攜帶熒光素酶基因，可以作為報告基因。在絡(luò)合物中混合的質(zhì)粒和聚合物的比例與進行電泳的絡(luò)合物相同。
測定了1.35μg至27μg HMW PEI/10μgDNA的濃度。在18μgHMW PEI得到最大轉(zhuǎn)染。進一步增加聚合物濃度只導致熒光素酶表達的較小的降低。
對于LMW PEI，測定了20-80μgLMW PEI/10μgDNA的濃度。與HMW PEI的情況相反，當增加LMW PEI濃度時，在ECV細胞中測得了轉(zhuǎn)染效能的穩(wěn)定性增強。在80μgLMW PEI/10μgDNA時，測得報告基因活性約比用18μgHMW PEI/10μgDNA測得的活性約大100倍，這是顯示的最大的活性。用最高濃度的LMW PEI進行觀測，未觀察到在用HMW PEI情況下出現(xiàn)的熒光素酶表達的下降。用3T3和ECV細胞進行的實驗得出了相同的結(jié)果。
為進行對比，也在內(nèi)皮初生細胞培養(yǎng)物上進行了β-半乳糖酶作為報告基因的轉(zhuǎn)染研究，并采用了最大可耐受的無細胞毒性的劑量(MTD)的HMW PEI和LMW PEI絡(luò)合物。體外MTD值為13.5μgHMW PEI/10μgDNA和90μgLMW PEI/10μgDNA。幾乎不可能對培養(yǎng)的豬大腦毛細血管內(nèi)皮細胞進行轉(zhuǎn)染，這種細胞是用包含10μgDNA和13.5μg HMW PEI的絡(luò)合物進行培養(yǎng)的。每個培養(yǎng)孔中只有2-3個細胞在細胞核部位顯示特異性的蘭色反應(yīng)。經(jīng)處理的細胞僅少于10％成功地進行了轉(zhuǎn)染。相對而言，用含有90μgHMW PEI的和10μgDNA的絡(luò)合物進行孵化導致內(nèi)皮細胞中標識蛋白的顯著表達。每孔中蘭染細胞與總細胞數(shù)的百分比，即轉(zhuǎn)染成功率，在5％-10％。用光學顯微鏡沒有觀察到聚合物/DNA絡(luò)合物對細胞有任何毒性效應(yīng)。
權(quán)利要求
1．一種用于將核酸插入細胞內(nèi)的載體，其特征在于其含有一種低分子量聚氮丙啶(LMW PEI)和一種核酸，其中LMW PEI的分子量小于50,000道爾頓。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于LMW PEI的分子量為500至30,000道爾頓。
3．根據(jù)權(quán)利要求1和2中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于LMW PEI的分子量為1000至5,000道爾頓。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于LMW PEI的分子量約為2000道爾頓。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于核酸是病毒或非病毒核酸結(jié)構(gòu)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于核酸結(jié)構(gòu)含有一個或多個效應(yīng)基因。
7．根據(jù)權(quán)利要求1至6中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中至少一種效應(yīng)基因為一種藥學活性化合物或其藥物前體編碼。
8．根據(jù)權(quán)利要求1至7中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中至少一種效應(yīng)基因為一種酶編碼。
9．根據(jù)權(quán)利要求1至8中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中至少一種效應(yīng)基因與一種細胞特異的配體一起表達為一種融合蛋白標記物。
10．根據(jù)權(quán)利要求1至9中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中的LMW PEI與一個細胞特異的配體偶合。
11．根據(jù)權(quán)利要求1至10中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中的細胞特異的配體與靶細胞外膜結(jié)合。
12．根據(jù)權(quán)利要求1至11中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中的靶細胞為內(nèi)皮細胞、肌肉細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、造血細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞、支氣管上皮細胞或肝細胞。
13．根據(jù)權(quán)利要求1至12中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中LMW PEI與核酸的重量比為3∶1或更多。
14．根據(jù)權(quán)利要求1至13中的一個或多個權(quán)利要求所述的載體，其特征在于其中LMW PEI與核酸的重量比為8∶1或更多。
15．一種制備分子量小于50,000道爾頓的低分子量聚氮丙啶的方法，其特征在于此方法包括通過加入鹽酸使單體氮丙啶在水溶液中聚合。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于水溶液中單體氮丙啶的濃度為0.1％-90％，濃鹽酸的濃度為0.1％-10％。
17．根據(jù)權(quán)利要求15和16一個或多個權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在30℃-70℃進行聚合反應(yīng)。
18．根據(jù)權(quán)利要求15至17的一個或多個權(quán)利要求所述的方法，其特征在于反應(yīng)時間為1-30天。
19．一種分子量小于50,000道爾頓的低分子量聚氮丙啶，其特征在于它是由權(quán)利要求15-18的一個或多個權(quán)利要求所述的方法制備的。
20．一種分子量小于50,000道爾頓的低分子量聚氮丙啶的用途，其特征在于它用于制備如權(quán)利要求1至14一個或多個權(quán)利要求所述的載體。
21．一種制備權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體的方法，其特征在于它包括將適量的LMW PEI與適量的核酸在水溶液中混合。
22．根據(jù)權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體的用途，其特征在于用于將核酸插入細胞中。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體的用途，其特征在于所述的細胞為內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、肝細胞、成纖維細胞、肌肉細胞或上皮細胞。
24．一種制備轉(zhuǎn)染細胞的方法，其特征在于它包括將權(quán)利要求1至14的一或多個權(quán)利要求所述的載體與這一細胞在體外孵育。
25．一種轉(zhuǎn)染細胞，其特征在于含有權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體。
26．一種根據(jù)權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)染細胞的用途，其特征是用于制備一種藥物。
27．一種根據(jù)權(quán)利要求19所述的低分子量聚氮丙啶的用途，其特征是用于制備一種藥物。
28．一種根據(jù)權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體的用途，其特征是用于制備一種藥物。
29．一種根據(jù)權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體的用途，其特征是用于制備一種用于基因治療的藥物。
30．一種制備藥物的方法，其特征在于它包括將一種核酸與一種LMW PEI混合。
31．一種藥物，其特征在于含有一種根據(jù)權(quán)利要求1至14中的一或多個權(quán)利要求所述的載體。
32．一種藥物，其特征在于含有一種如權(quán)利要求19所述的LMWPEI。
33．一種藥物，其特征在于含有一種如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)染細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及低分子量聚氮丙啶,含有低分子量聚氮丙啶的用于將核酸插入細胞中的載體,及此低分子量聚氮丙啶和載體的制備方法和用途。本發(fā)明涉及將核酸插入細胞中的一種載體,此載體含有一種低分子量的聚氮丙啶(LMWPEI)和一種核酸,LMWPEI的分子量低于50,000道爾頓。
文檔編號C08G73/00GK1221796SQ9812059
公開日1999年7月7日 申請日期1998年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者T·吉塞爾, D·菲舍, H－P·伊爾薩斯, T·彼伯 申請人:德國赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司