專利名稱:氯化血紅素的分離和純化的制作方法
本發(fā)明是關(guān)于用催化結(jié)晶法從水溶液或懸浮液中分離和純化氧化血紅素的方法。而將氯化血紅素從水溶液中結(jié)晶析出通常是不可能的。
在傳統(tǒng)的方法中，只能用數(shù)量上大到不相稱的大量有機溶劑將氯化血紅素從血液或血紅蛋白中分離出來。這些溶劑已經(jīng)成為工業(yè)生產(chǎn)中費用最高的因素，并且引起環(huán)境污染問題。
早在1853年，Teichmann用冰醋酸在氯化鈉存在下作用于血液，得到了以他名字命名的氯化血紅素結(jié)晶。后來Schalfejew將這個血液顯微檢測方法發(fā)展成為一種生產(chǎn)工藝，至今仍然是傳統(tǒng)的制備氯化血紅素的方法(Ullmann，應(yīng)用技術(shù)化學(xué)大全(Encyklopaedie d.tech.Chemie)，第Ⅳ版，11卷，129頁)。在該工藝中，制備1公斤氯化血紅素大約需要800升冰醋酸，此外重結(jié)晶還需要5升吡啶，11升氯仿和70升冰醋酸。純氯化血紅素的產(chǎn)量只有理論產(chǎn)量的70%。僅在重結(jié)晶過程中，就損失約20%。
其它已知的方法是利用甲醇(歐洲專利-B-68537)、乙醇、必要時加入乙二醇或丙三醇的混合物(丹麥專利-A2526596)、二甲基甲酰胺、甲乙酮或丙酮(生理化學(xué)進展80(1912)，35)在酸化的血紅蛋白中分離氯化血紅素和珠蛋白。1公斤氯化血紅素需要200至500升上述有機溶劑，得到的還是雜質(zhì)很多的氯化血紅素。
根據(jù)美國專利4，330，463，在血紅蛋白中加入鹽酸，將混合物噴霧干燥，得到的酸性干血用乙醇/甲醇混合物提取若干次，將氯化血紅素提入溶液。用這個方法每公斤氯化血紅素需要1000升以上溶劑。
本發(fā)明的目的就是提供一個分離和純化氯化血紅素的方法，該方法不用有機溶劑，并以很高的收率獲得純的氯化血紅素。
我們發(fā)現(xiàn)，用本權(quán)利要求
的方法可以達到這個目的。用本方法，在PH0.5-2.5時，借助于陽離子的、非離子的或兩性的表面活性劑或這些表面活性劑的混合物，將它們作為催化劑，氯化血紅素可以從含有氯化物的水溶液或懸浮液中結(jié)晶出來。
一般地說，氯化血紅素得自血紅蛋白，血紅蛋白得自血液。加入催化劑后，由于氯化血紅素的結(jié)晶析出，使血紅蛋白分解成氯化血紅素和珠蛋白的平衡向氯化血紅素移動(因而防止了逆反應(yīng)的發(fā)生)。因此，所涉及的方法主要是氯化血紅素從血紅蛋白和珠蛋白混合物中的結(jié)晶和分離。
如果將含有鹽酸的稀血紅蛋白溶液加熱，立即分出粘稠的沉淀，該沉淀由變性的珠蛋白混合物組成，即已成為不溶的珠蛋白和血紅蛋白。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在這個處理過程中，將適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┳鳛榇呋瘎┘尤耄t蛋白不會沉淀。而且，出人意外地，以實際上定量的產(chǎn)率形成Teichmann氯化血紅素結(jié)晶。一經(jīng)靜置，結(jié)晶就沉淀下來。無色的上層清液由含有鹽酸的純珠蛋白溶液組成。盡管更可取的是在水解前將血紅蛋白溶液稀釋至含有2-8%固體含量(尤其是5%左右)，但這不是絕對必需的。水解以及氯化血紅素的結(jié)晶在濃溶液中也能發(fā)生(如固體含量為15%時)，但是反應(yīng)速度較高，也就是說，如果這樣做，氯化血紅素的分離時間就會變得很短，以致結(jié)晶很小，沉淀很慢。但另一方面，用很稀的溶液是不經(jīng)濟的。
合適的催化劑是前面所述的表面活性劑，即具有疏水和親水基團的表面作用的混合物，陰離子表面活性劑以不同的方式作用。原則上，市場上許多類型表面活性劑都能被使用，在應(yīng)用非離子表面活性劑時，最好使用分子量大的表面活性劑。為了促進表面活性劑和珠蛋白分離(在氯化血紅素結(jié)晶分離后，珠蛋白很容易經(jīng)中和從母液中沉淀出來)，合理的做法是采用這樣的表面活性劑，這些表面活性劑即使在中性PH時仍然留在溶液中。
合適的陽離子表面活性劑的例子是分子中帶有一個或二個長鏈烷基的季銨鹽。特別重要的典型化合物的例子是氯化二甲基-C8-C18-烷基-芐基銨，例如氯化芐基十二烷基二甲銨、氯化十八烷基三甲銨、氯化芐基三甲銨、氯化芐基十四烷基二甲銨、氯化十六烷基吡啶鎓以及氯化二羥乙基甲基油酰銨。其它例子是具有羥聚醚基團的羥基脂肪胺，例如十八烷基二乙醇胺或十二烷基二聚乙二醇胺，還有氮雜環(huán)丙烷和脂肪胺鹽的加成物，2-(脂肪烷基)咪唑啉、2-(脂肪烷基)苯并咪唑和三乙醇胺的脂肪酸單酯。
合適的非離子表面活性劑的例子是天然的和合成的9個碳或更多碳原子脂肪醇的乙氧化物。在這種情況下，非離子表面活性劑最好是具有9到50個乙氧基或丙氧基、尤其是按C9到C11、C12到C15和C16到C20部分的氧乙醇。烷基酚也是有用的，尤其是具有8到50個乙氧基和/或丙氧基的辛基、壬基或十二烷基酚的衍生物。具有8到50個乙氧基的脂肪酸和烷醇胺縮合物的衍生物也是有用的表面活性劑。其它合適的非離子表面活性劑有已知的分子量為500到2，500的環(huán)氧乙烷和1，2-環(huán)氧丙烷的聚合物，分子量為500到8，500的環(huán)氧乙烷和1，2-環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物。
合適的兩性表面活性劑是種類繁多的內(nèi)銨鹽，要求它們有長鏈的疏水基團，如十四烷基內(nèi)銨鹽或磺基牛磺酸基的化合物。
不同的表面活性劑或表面活性劑類型也可混合使用。表面活性劑可在變化很大的濃度范圍使用，根據(jù)所用的溶液或懸浮液，以重量計其濃度范圍從0.005至20%，最好是0.01至5%，最常用的是0.025%。氯離子濃度至少必須足以生成氯化血紅素，實際上(更有利地)高于這個限度。這里沒有明確地規(guī)定上限。
如果加熱反應(yīng)混合物時間長于氯化血紅素結(jié)晶所需要的時間，即使混合物中有表面活性劑，也會離析出變性的珠蛋白。由于這樣做會生成不溶的氯化血紅素和珠蛋白的混合物，所以，這種情況是不希望發(fā)生的。對于更大的規(guī)模，加熱和冷卻都需要更長的時間，因此，最好采用連續(xù)的方法，這樣，加熱的時間較短。為了這個目的，將表面活性劑作為催化劑加入反應(yīng)混合物，用泵輸入到熱交換器，并在此將反應(yīng)物迅速加熱。如果必要，將反應(yīng)物送至體積合適的容器，在已達到的反應(yīng)溫度上在反應(yīng)更長周期，然后送至另一個熱交換器迅速冷卻。任何介質(zhì)如熱水、甘油，油等都可作為加熱介質(zhì)，但是，最好利用蒸汽，蒸汽在大氣壓下冷凝成水，以避免使反應(yīng)的水混合物沸騰，并且使溫度正好略低于沸點。在大工廠中，如果采用適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂?，?dāng)然也可以利用高于大氣壓的蒸汽。在90℃-99℃可得到最有利的結(jié)果，這是因為珠蛋白變性的競爭性沉淀遠低于這個溫度。用泵的速度和反應(yīng)速度配合的方法可以得到最佳控制，這將在實施例2和3中敘述。
加入氯化血紅素晶種，不僅可以保證恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)速度，實際上還大量節(jié)省了表面活性催化劑(最高達99%)。原則上，沒有表面活性催化劑，晶種混懸液也能促使氯化血紅素結(jié)晶。但是，為了這個目的，必須將結(jié)晶速度增加到一定程度，使結(jié)晶在珠蛋白變性前完成，也就是需要較大的晶種表面積。例如，這個方法可能要用大量的氯化血紅素晶種，即為所得氯化血紅素結(jié)晶的10-100倍，也可能需要磨得特別細的、平均直徑小于1微米的晶種，在這種情況下，得到的所生成的氯化血紅素也相應(yīng)地很細，以致離心分離很困難。由于這個問題，這個方法(沒有在這里提出權(quán)利要求
)實際上是不重要的，盡管它的優(yōu)點在于不引入可能污染氯化血紅素或珠蛋白的外來物質(zhì)。雖然本發(fā)明所使用的表面活性催化劑是這樣一種外來的物質(zhì)，但是，它能得到很大的氯化血紅素結(jié)晶，這種結(jié)晶能自動地沉淀，不需要離心。并且，由于表面活性劑和珠蛋白不同，在中和珠蛋白鹽酸溶液時，表面活性劑仍留在溶液中，它們可以很容易地被除去。用水洗滌，可以除去氯化血紅素結(jié)晶中的表面活性劑。
表面活性催化劑也適用于氯化血紅素粗品的重結(jié)晶，并且產(chǎn)物的損耗很小。氯化血紅素粗品不僅指實施例2至4的反應(yīng)產(chǎn)物，而且包括任何其它含有氯化血紅素的殘留物，例如，在血紅蛋白酶法降解(參看實施例8)中的生成物，甚至包括純氯化血紅素。在這種情況下，表面活性劑的濃度選擇高一些是有利的。例如，根據(jù)溶液的情況，以重量計從0.1至20%，最常用的是5%。溶液中的氯化血紅素或沉淀中無定形的氯化血紅素可以直接結(jié)晶，而結(jié)晶氯化血紅素必須先溶于氨水中。也可以用任何別的堿來代替氨，盡管這樣溶液常常更不穩(wěn)定。也可以將氯化血紅素粗品溶于有機溶劑，如二甲基甲酰胺或二甲亞砜，然后加入含有表面活性劑的水，直至混合物主要以水為溶劑，然后使氯化血紅素在混合物中結(jié)晶。
在實施例5至8所述的結(jié)晶法進行純化時，產(chǎn)生特定大小的Teichmann結(jié)晶。如果使用大量的表面活性劑且在結(jié)晶生長期停止攪拌，可得到特別大的結(jié)晶(實施例7)，如果在攪拌下，用少量非離子表面活性劑并加熱(實施例6)，再迅速加入鹽酸，可得特別小的結(jié)晶。此處不必加入晶種。
如果將含有表面活性催化劑的氯化血紅素的氨溶液迅速用鹽酸酸化，則生成含有結(jié)晶不好的氯化血紅素沉淀，如呈針狀或粒狀的彎曲排列。但是，如果使用中性溶液，如二甲基甲酰胺溶液，則生成正常的結(jié)晶。我們已發(fā)現(xiàn)，如果先在PH2至5加熱，再慢慢地加入鹽酸，直到形成初步的結(jié)晶，那么也可以從氨溶液中得到正常晶形。
當(dāng)HCl加入比較快時，結(jié)晶變得比較小和比較尖，從分離過程應(yīng)溫和的觀點看，一般是不希望這樣做的。特定的表面活性劑對結(jié)晶形狀有著可清楚地觀察到的、特定的影響，這些晶形可以比較薄或比較細或比較寬以致開裂，也可呈比較堅實的十字形直至星形等。
為了使氯化血紅素更容易結(jié)晶和分離，如果必要，可以將混有珠蛋白的氯化血紅素粗品酶解。雖然在水中反復(fù)懸浮和沉淀，所得的氯化血紅素純度只有90%，可以進一步用濃度為50-70%的硫酸處理，如實施例5所述，其純度可增加到98%以上。
實施例1在牛血中加入檸檬酸三鈉后，將牛血離心，用水稀釋，使血球濃度保持在固體含量為5%。然后加入濃度為20%的鹽酸，至PH為1.5。
在磁攪拌器上將500毫升該起始液和10克氯化芐基十二烷基二甲銨一起攪拌，在10分鐘內(nèi)加熱至沸。約3分鐘后，紅棕色溶液變?yōu)闊o色，產(chǎn)生小的黑紫色氯化血紅素結(jié)晶沉淀。用水冷卻該混合物，使結(jié)晶沉淀下來。無色的珠蛋白鹽酸上層液可以很容易地傾出。抽濾沉淀的結(jié)晶氯化血紅素，洗滌和干燥，得0.76g(100%理論值)的96.5%純產(chǎn)物。
實施例2實施例1所述起始液10L，PH為1.5，和古柯酰氨基(Cocamido-)-丙基內(nèi)銨鹽(1-C7-C17-烷基酰氨基-3-二甲胺-丙烷-3-羧甲基內(nèi)銨鹽)24g、濃度為4%的晶種懸浮液0.2g一起攪拌，晶種懸浮液按下法制備，在轉(zhuǎn)速為每分400轉(zhuǎn)的碾磨機中，將氯化血紅素結(jié)晶的水懸浮液仔細碾磨6小時(平均顆粒直徑1微米)。
該溶液連續(xù)地用泵輸入，從下方通過一垂直的，有夾套的蒸汽加熱的玻璃管(管長1.40米，直徑20毫米)，然后用實驗室冷凝器冷卻至最高溫度為55℃。調(diào)節(jié)輸送速度，以便輸出的反應(yīng)液不因加熱而成為棕色，這個速度相當(dāng)于在所述條件下每分鐘約80毫升。利用小的連續(xù)離心機(約3，000×g)進行分離，得到10升淡黃色珠蛋白鹽酸溶液和170克含有少量珠蛋白的濕的氯化血紅素粗品。按實施例5所述方法進一步處理。
實施例3將實施例1所述起始液600升，和壬基酚聚乙二醇醚(聚合度30)150克，實施例2的濃度為4%的氯化血紅素晶種20克一起攪拌。
該溶液連續(xù)地用泵輸入，從下方通過一垂直的、蒸汽加熱的管式熱交換器(長度為1米，有46根不銹鋼管，每根管直徑為12毫米)，再通過6升管形后反應(yīng)器以及冷卻面積約為0.1米2的冷卻器，然后進入連續(xù)卸料分離器(有3升轉(zhuǎn)鼓，離心力約5，000×g)。泵的輸送速度約為250升/小時，控制輸入速度以使溶液在進入離心機時不會變成棕色。離心液由600升淡黃色珠蛋白鹽酸溶液組成，殘余物為4.2公斤含有珠蛋白的濕的氯化血紅素粗品。該氯化血紅素粗品按實施例5所述方法處理。
實施例4以五倍量的相同表面活性劑(0.75公斤)和1/10量的晶種(2克懸浮液)重復(fù)實施例3的實驗。反應(yīng)速度與實施例3相同。得到600升含有鹽酸的珠蛋白溶液和4.4公斤濕的氯化血紅素粗品。
實施例5在實施例2至4得到的氯化血紅素粗品中加入水，使之變得可以攪拌，每2升懸浮液加1克胃蛋白酶，在30至40℃攪拌2小時。用冰冷卻混合物至+5℃，加入氨至恰好使其全部溶解。加入壬基酚聚乙二醇醚(聚合度30)和檸檬酸，每種物質(zhì)的量等于預(yù)計的氯化血紅素產(chǎn)量，將混合物在約95℃加熱10分鐘。與所加氨等當(dāng)量的鹽酸加入到攪拌的混合物中，在95℃再慢慢地加入鹽酸，直到氯化血紅素開始結(jié)晶(顯微鏡)。一到兩小時后，無定形的棕黑色快狀物已經(jīng)全部消失，在那些地方生成相應(yīng)數(shù)量的Teichmann氯化血紅素結(jié)晶，這些結(jié)晶大小一致，棱長約0.02毫米。
待結(jié)晶沉淀后，傾出溶液，將濃度為85%的硫酸加入攪拌的殘余物，直至硫酸濃度達到60%。十分鐘后，混合物用兩倍體積的水稀釋，待結(jié)晶沉下后，在抽濾漏斗上用水洗去酸。產(chǎn)量是定量的。純度為98%，在388血紅素毫微米Na OH中測定比消光(1%，1cm)，對于純度為100%的氯化，其值為956。
Fe 計算值8.57%，實測值:8.4%Cl 計算值5.44%，實測值5.3%
利用1/10催化劑量重復(fù)實施例5的重結(jié)晶，生成小得多的氯化結(jié)晶。
實施例6利用1/10催化劑量重復(fù)實施例5的重結(jié)晶，生成小得多的氯化血紅素結(jié)晶。
實施例7混合催化劑由等量實施例1和5的表面活性劑組成，用總量相等的混合催化劑重復(fù)實施例5所述的重結(jié)晶，在結(jié)晶期間停止攪拌。生成大得多的棱長約為0.1毫米的氯化血紅素結(jié)晶。
實施例8實施例1所述起始液40升和10克胃蛋白酶在37℃攪拌16小時，然后將混合物通過轉(zhuǎn)鼓容量為3升的連續(xù)離心機，在離心力為約5，000×g下離心。
得到2公斤含有氯化血紅素的殘余物，該殘余物的固體含量為12%。用2L水稀釋，加入實施例3的催化劑60克，將混合物加熱到95%。加入濃度為20%的鹽酸150ml，開始出結(jié)晶，然后間歇地多次加入鹽酸，每次10ml。后面的步驟與實施例5至7所述相同。
產(chǎn)量60克結(jié)晶氯化血紅素純度98%
權(quán)利要求
1.一個分離和純化氯化血紅素的方法，其中，當(dāng)PH為0.5-2.5時，在作為結(jié)晶催化劑的陽離子、非離子或兩性表面活性劑或它們的混合物存在下，氯化血紅素從含氯化物的水溶液或懸浮液中結(jié)晶析出。
2.如權(quán)利要求
1所聲明之方法，其中，氯化血紅素的結(jié)晶是連續(xù)進行的。
3.如權(quán)利要求
1所聲明之方法，其中，用加入微晶晶種促進催化結(jié)晶。
4.如權(quán)利要求
1所聲明之方法，其中，根據(jù)所使用的溶液或懸浮液，所用的表面活性劑濃度按重量計從0.005至20%。
專利摘要
在作為結(jié)晶催化劑的陽離子、非離子或兩性表面活性劑存在下，用結(jié)晶法從酸性水溶液中分離和純化氯化血紅素。
文檔編號C07D487/22GK87101834SQ87101834
公開日1988年1月6日 申請日期1987年3月12日
發(fā)明者漢斯·舒爾茨 申請人:巴斯福股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan