專利名稱：治療慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病的方法和藥用組合物。
慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病(CPVSD)是一種好幾個常見疾病的并發(fā)癥，這些折磨發(fā)達(dá)國家的常見疾病包括糖尿病的糖尿癥、高血壓、各種高脂血癥等。目前解決CPVSD的治療方式是針對根本原因?yàn)槟康?。令人遺憾的是，對大多部分都沒有治愈或者在一般人口中對它們的控制很難實(shí)現(xiàn)。另外，CPVSD經(jīng)常不僅容易產(chǎn)生而且病情發(fā)展很快，直到目前才對其根本原因給予醫(yī)療關(guān)注。因此人們正嘗試治療第二并發(fā)癥，其中CPVSD是最嚴(yán)重的，這是因?yàn)樗鼤?dǎo)致腎衰竭、中風(fēng)、心臟病和致盲。
CPVSD一般是以血管平滑肌細(xì)胞的變化為特征的。主要變化之一是數(shù)量的增長和它們結(jié)合的結(jié)締組織類型的改變。這會導(dǎo)致疤痕和功能上的顯著變化。在血管中，這會導(dǎo)致彈性的喪失，造成血管不能擴(kuò)張和收縮并且血管具有增厚的管壁和變窄的管腔。最終結(jié)果是降低血流或完全阻塞。以這些病理生理過程為特征的血管疤痕疾病的例子包括慢性進(jìn)行性腎小球疾病如糖尿病誘發(fā)的腎小球硬化癥(疤痕)；移植后的進(jìn)行性腎衰竭；提供給用血液透析治療的腎衰竭晚期患者血液進(jìn)入的支路閉塞；其他慢性小血管疾病(如在一些高血壓患者中)；已進(jìn)行過冠狀動脈分流術(shù)患者的狹窄復(fù)發(fā)和糖尿病性的視網(wǎng)膜病。
對CPVSD的任何療法的治療目的必須是減少已經(jīng)形成的額外的細(xì)胞外基層(疤痕)以恢復(fù)正常血管的開放和功能，或者至少預(yù)防或?qū)嶋H上減慢進(jìn)程。但是，目前沒有直接干擾平滑肌組織代謝異?；蛘哒{(diào)整結(jié)締組織合成的方法，盡管它們在慢性進(jìn)行性疾病中是非常中重要的?，F(xiàn)已把這些疾病的進(jìn)程看作是不可避免的和不可逆的。
所以，開發(fā)CPVSD的治療方法尤其重要，優(yōu)選該方法包括口服一種低毒的藥物，該藥物通過引起已建立的損傷退化和降解來治療和逆轉(zhuǎn)CPVSD是有效的。
戊聚糖多磺酸酯(PPS)是一種高度磺化的半合成多糖，分子量為大約1,500到6,000道爾頓，這取決于分離的方法。PPS是在肝素和類肝素的相同的大類中，但在化學(xué)結(jié)構(gòu)上、衍生的方法上和理化特性方面PPS與肝素存在許多不同。其中肝素一般是從哺乳動物組織如牛和豬的肌肉、肝臟和腸中分離得到，而PPS是一種半合成的化合物，它的多糖骨架木聚糖是從山毛櫸的皮中或其他植物源提取出來，然后用磺化劑如氯磺酸或三氯磺酰和酸處理得到的?；腔螅琍PS一般用氫氧化鈉處理以獲得鈉鹽。
下式對應(yīng)于肝素和戊聚糖多磺酸酯，肝素戊聚糖多磺酸酯肝素是一種重復(fù)雙糖單體(D)-葡糖胺和(D)-葡糖醛酸(都是6-碳己糖)的磺化聚合物，在葡糖胺上帶有氨基功能團(tuán)；PPS是一個重復(fù)單一單體(D)-木糖的磺化的線性聚合物，其中5-碳木糖是其吡喃糖環(huán)形式。當(dāng)肝素旋轉(zhuǎn)平面極性光為右旋方向時，PPS旋轉(zhuǎn)光為左旋方向。
在生化特性方面，PPS能夠延長部分促凝血酶原激酶并已經(jīng)用于預(yù)防深度靜脈的血栓形成，但它只有肝素抗凝效力的十五分子一(主要參見，Wardle，醫(yī)學(xué)研究雜志，20361-370，1992)?，F(xiàn)在也公開了PPS用于治療尿道感染和間質(zhì)性膀胱炎(US 5,180,715)，并且與一種血管擴(kuò)張性甾體化合物結(jié)合用于治療血管生成和毛細(xì)血管、細(xì)胞或膜的泄漏(US 4,820,693)。
一些研究者已經(jīng)證實(shí)PPS能夠抑制平滑肌細(xì)胞的增生并且能夠降低高脂血癥，在此基礎(chǔ)上暗示PPS能夠用于預(yù)防有限的動脈粥樣硬化斑塊的形成，抑制腎小球系膜細(xì)胞的增生并且能夠預(yù)防膠原的形成和腎小球硬化癥(Paul等，血栓研究，46793-801，1987；Wardle，ibid.)。但是，沒有人曾經(jīng)注意到CPSVD如動脈粥樣硬化的疤痕方面(與抑制細(xì)胞增生相反)或者證實(shí)它可適用于中止和/或可逆血管疤痕，即在這方面沒有人想到PPS。而且，沒有現(xiàn)有技術(shù)通過在完整動物所產(chǎn)生的任何實(shí)質(zhì)性的科學(xué)試驗(yàn)的療效數(shù)據(jù)來支持PPS可能用于疤痕疾病的提示，但替代的是以體外動物組織的試驗(yàn)為主，而體外動物試驗(yàn)經(jīng)常不能預(yù)見體內(nèi)功效。
盡管目前已有記載PPS在抑制纖維變性和疤痕形成方面的用途的公開出版物(參見，如Roufa等，US 5,605,938)，但是這些教導(dǎo)解決的是抑制皮膚的成纖維細(xì)胞對皮膚和相鄰組織區(qū)域的侵害，但是沒有平滑肌細(xì)胞的疤痕疾病，它們在病因?qū)W和病理學(xué)上是完全不同的。
本發(fā)明的目的是提供一種治療CPVSD的方法，該方法不僅能夠中止疾病的進(jìn)程而且還能實(shí)質(zhì)性地逆轉(zhuǎn)該進(jìn)程并引起現(xiàn)存的疤痕或損傷退化。本發(fā)明的另一個目的是提供這樣一種治療方法，即用一種通常可得到的藥物，該藥物用常規(guī)方法給藥，該藥物無毒并不會引起嚴(yán)重的副作用，在治療CPVSD方面是非常有效的。
為了使這些目的和其他目的在本文后逐漸清楚，簡要地說，本發(fā)明是涉及治療患有CPVSD的哺乳動物患者的方法，該方法能夠中止該疾病的進(jìn)程并能夠使在受影響的器官或血管系統(tǒng)中已經(jīng)形成的疤痕或纖維性損傷消除或減小，該方法包括給患者服用一種含有有效治療血管疤痕疾病用量的戊聚糖多磺酸酯或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物。給藥方式優(yōu)選以例如片劑、膠囊或液體形式口服PPS。
附圖的簡要描述

圖1表示了在十分之一的來自正常5周齡小鼠的腎小球上，通過競爭性PCR得到的α1IV膠原mRNA的量(如下列實(shí)施例1中所述的)，描述a)在其頂部中，PCR擴(kuò)增后反應(yīng)路線和相應(yīng)的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色的凝膠；和
b)在較低的部分中，繪制了一幅每個腎小球中突變的膠原CDNA與輸入含有所有PCR試劑的9個試管中每個中突變的cDNA的量的比。
圖2描述了a)在上部中，來自兩個腎切除術(shù)的腎癌樣本的PAS-染色的切片(A-正常的腎小球組織學(xué)；B-顯著的硬化)；b)在中部中(C-D)，免疫熒光顯微術(shù)，在相同的腎中抗體對IV型膠原；和c)在較低部分中(E)，一幅圖反映了在相同腎中的硬化系數(shù)；在50個顯微解剖的腎小球庫中通過競爭性的PCR定量法測定α2IV膠原CDNA(值是145±22對1046±74×10-4阿托摩爾數(shù)/腎小球數(shù))。
圖3是一幅反映沒有腎小球硬化的5名患者相對于硬化的5名患者腎中的硬化系數(shù)的圖，用腎小球相對細(xì)胞數(shù)和α2IV膠原cDNA的含量表示。
圖4是一幅反映患有膜性腎小球腎炎(MN)和糖尿病性腎病(DM)以及患有腎小球硬化的腎切除(NX GS)和沒有腎小球硬化的腎切除患者的α2/α3IV膠原mRNA比率的圖。
圖5是一幅反映PPS鈉對正常腎小球系膜細(xì)胞DNA合成的作用圖，其中所述作用是通過滴定胸苷插入法(24小時培養(yǎng))測定的并按照每103個細(xì)胞每分鐘的滴定數(shù)對PPS鈉的濃度(μg/ml)繪成的圖。
圖6是一幅反映PPS鈉對正常腎小球系膜的細(xì)胞中細(xì)胞生長的作用圖，該圖是用培養(yǎng)三天后的細(xì)胞數(shù)對所加的PPS鈉的濃度(μg/ml)繪成的。
圖7是一幅反映在溫育三天和五天后PPS鈉和肝素(用一個未治療的對照組)對正常腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞生長的作用的對比圖。
圖8是一幅反映用血漿和PPS鈉培養(yǎng)的細(xì)胞與僅用血漿培養(yǎng)的對照細(xì)胞相比隨著時間正常腎小球系膜細(xì)胞的增生圖。
圖9是一幅不同時期和逆轉(zhuǎn)錄的暴露于PPS鈉(10μg/ml)的正常腎小球系膜細(xì)胞層的MRNA值的表，它反應(yīng)了在α1IV和α1-I膠原mRNA、膠原酶(金屬蛋白酶)72KDa和92KDa mRNA、生長因子TGF-βmRNA和細(xì)胞蛋白質(zhì)β-肌動蛋白mRNA的含量增長、下降或沒有變化。
圖10是一幅反映α1IV膠原/GAPDH比率的圖，該比率是通過競爭性PCR測定的，分別詳細(xì)描述了把PPS鈉飲用水給GH基因轉(zhuǎn)移小鼠服用10-12周的腎小球和接受沒有處理的水的對照GH小鼠的腎小球。
圖11描述了未處理對照組中的無痛苦死亡的Watanabe兔和其他用皮下PPS鈉(Elmiron)治療組中的Watanabe兔的腹主動脈縱切片照片。
圖12是一幅反應(yīng)只接受高膽固醇飲食的Watanabe兔的各種主動脈的支脈的內(nèi)膜縱切面區(qū)和從接受含有高膽固醇飲食和PPS鈉的飲用水的其他組的Watanabe兔得到的可比較的縱切片的內(nèi)膜區(qū)的圖。
圖13是一幅反應(yīng)只接受高膽固醇的Watanabe兔主動脈的不同支脈內(nèi)至中膜交叉區(qū)的比例和在從其他組中接受含有高膽固醇飲食和PPS鈉的飲用水的Watanabe兔得到的縱切片中所測定的可對照的比例圖。
本發(fā)明涉及一種治療患有慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病(CPVSD)的哺乳動物患者的方法，該方法能夠在受影響的血管系統(tǒng)尤其是在動脈如主動脈中中止或客觀地使該疾病的進(jìn)程減緩并且能夠引起已經(jīng)形成的疤痕損傷消除和/或減小。該方法包括給患者服用一種含有有效治療血管疤痕用量的戊聚糖多磺酸酯(PPS)或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物。
按照該新方法治療的疾病包括但不限定為慢性進(jìn)行性腎小球疾病包括疤痕型糖尿病誘發(fā)的腎小球硬化癥；由動脈硬化引起的動脈疤痕，包括動脈硬化癥；由腎移植后間質(zhì)疤痕引起的進(jìn)行性腎衰竭；提供給用血液透析治療的腎病晚期患者血液進(jìn)入的支路閉塞；其他慢性疤痕小血管疾病(如在一些高血壓患者中)；已進(jìn)行過冠狀動脈分流術(shù)患者的疤痕狹窄復(fù)發(fā)和糖尿病性的視網(wǎng)膜病。
由于這些疾病的流行和危害，采用新方法治療慢性動脈硬化疤痕病理來逆轉(zhuǎn)或預(yù)防該疾病的進(jìn)程并解決現(xiàn)存的血管疤痕和損傷是特別重要的。例如，按照本發(fā)明服用PPS能夠中止和逆轉(zhuǎn)主要血管的動脈硬化，使得受動脈粥樣硬化斑塊的動脈壁中包括的已經(jīng)形成的疤痕消除和/或減少并實(shí)質(zhì)性地增加縱切內(nèi)膜區(qū)以使更大的血液通過血管腔。
本文所用的術(shù)語“有效治療血管疤痕用量”指的是摻入藥用組合物中的PPS或其鹽的用量，其中的藥用組合物在給藥期每天一次或多次給藥時能夠有效中止和逆轉(zhuǎn)CPVSD的進(jìn)行性癥狀。在人類患者中，大約5到30mg/kg患者體重，或者成人每天大約350到大約2,000mg，并優(yōu)選大約500到大約1,500mg的PPS或其鹽的每日總劑量以一次到四次相等的分開劑量給藥可以有效達(dá)到治療和逆轉(zhuǎn)CPVSD的治療目的。在較小的哺乳動物中，劑量范圍可以按照體重、品種和狀況性質(zhì)向下調(diào)節(jié)。
新治療方法的優(yōu)選實(shí)施方案是對患者服用含有有效量的PPS和至少一種藥學(xué)上可接受的惰性成分的藥用組合物。該組合物可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的藥用劑型，但優(yōu)選口服劑型。
口服劑型包括常規(guī)的片劑、包衣片、膠囊或小丸，持續(xù)釋放的片劑、膠囊或小丸，錠劑、液體、酏劑或任何其他藥學(xué)領(lǐng)域已知的口服劑型。
作為藥學(xué)上可接受的惰性成分，包括不干擾PPS治療CPVSD活性的填充劑、粘合劑、溶劑等。如果需要的話，如粘土或硅質(zhì)土類的填充劑也可以調(diào)節(jié)劑型的大小。
對賦予劑型所需的物理特性，其他的成分如賦型劑和載體也是必需的。例如這種物理特性是釋放率、特征和大小。用于口服劑型的賦型劑和載體的例子有蠟類如蜂蠟、蓖麻蠟、糖蠟和巴西蠟棕蠟，纖維素化合物如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素，聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂醇、硬脂酸單甘油酯、異丁烯酸酯化合物類如聚甲基丙烯酸酯、異丁烯酸甲酯和二異丁烯酸乙二醇酯，聚乙二醇和親水膠。
在本發(fā)明的組合物中，PPS活性成分理想地是在每個單位劑量以大約50和大約300mg之間的量存在的。給每個患者服用的精確劑量將是被治療病情和患者的生理特性如年齡和體重的函數(shù)。
藥物活性成分能夠是PPS或其藥學(xué)上可接受的鹽如鈉鹽。用于本發(fā)明方法的一種優(yōu)選口服劑型是Elmiron明膠膠囊(Baker Norton制藥公司，Miami，佛羅里達(dá))，它含有100mg的PPS鈉和作賦型劑的微晶纖維素和硬脂酸鎂。
盡管優(yōu)選口服給藥，本發(fā)明治療方法也包括通過腸胃外、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜途徑或通過其他醫(yī)療和藥學(xué)領(lǐng)域中已知的常用的給藥途徑服用PPS或其鹽。類似的，本發(fā)明組合物可在藥學(xué)上可接受的胃腸外、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜或其他常規(guī)的載體和劑型中包括PPS及適當(dāng)?shù)亩栊匀軇?、賦型劑和附加劑。這類藥學(xué)上可接受的載體的許多例子能夠在Remington藥物科學(xué)(第17版(1985))和其他標(biāo)準(zhǔn)課本中找到。無論使用那種給藥途徑或藥物劑型，PPS活性成分的劑量范圍都是從大約5到大約30mg/kg患者體重或大約350到大約2,000mg，并優(yōu)選大約500到大約1,500mg，盡管在胃腸外給藥時應(yīng)當(dāng)適當(dāng)使用該范圍較低端的劑量。
用于本發(fā)明方法的藥用組合物可以包括除PPS或其鹽的其他活性成分例如其他可用于治療CPVSD的藥物。
該新方法能夠方便、安全和有效地治療患有各種形式的CPVSD患者，在許多情況下，這種疾病可以威脅人的生命或器官，通過這種方法，使用已被證實(shí)具有低毒和副作用低發(fā)病率的藥物能夠不僅中止長期被認(rèn)為是無法制止的慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病，而且實(shí)質(zhì)上阻止和/或逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的疤痕損傷從而使正常血管潛力和功能恢復(fù)正常。
下列實(shí)施例包括(a)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中公開的試驗(yàn)的描述，這些試驗(yàn)證實(shí)了在給疤痕型膠原mRNA的定量中使用的某些競爭性的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)以及腎小球中的相關(guān)因素；并證實(shí)了相應(yīng)的腎小球細(xì)胞數(shù)與生產(chǎn)疤痕型的膠原量無關(guān)；(b)在發(fā)明人的監(jiān)督下進(jìn)行的試驗(yàn)，用來證實(shí)體內(nèi)和體外PPS在下調(diào)疤痕型膠原和細(xì)胞生長因素和上調(diào)膠原酶活性來降解存在的疤痕膠原的沉積方面的功效；以及(c)在發(fā)明人監(jiān)督下的試驗(yàn)，它用來證實(shí)體內(nèi)PPS在逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化的功效，包括實(shí)質(zhì)上減少動脈粥樣硬化斑塊在受影響的血管中的量和分布。這些試驗(yàn)的目的不是用來設(shè)定為了實(shí)施本發(fā)明而必須使用的材料、技術(shù)或劑量范圍，或者以任何方式限定本發(fā)明。
實(shí)施例1膠原的定量如Penten等在美國生理學(xué)雜志，32F951-957(1992)，用下列方法給小鼠腎小球中的α1IV和α2IV的膠原定量在好幾只試管的每一只里加入正常5周齡小鼠的十分之一的腎小球中代表mRNA的cDNA的量和標(biāo)準(zhǔn)量的α1IV和α2IV的膠原引物，其中試管中含有所有來自GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒(PerkinElmer Cetus，Norwalk，Connecicut)的PCR試劑。向擴(kuò)增前的這種混合物中加入含有一種新的限制酶切割位點(diǎn)或者是缺失的突變cDNA的連續(xù)稀釋液(如圖1所示的步驟，頂部條帶)。在一個設(shè)定在托架等點(diǎn)(y＝1)上的前試驗(yàn)中測定突變體的濃度。
在PCR擴(kuò)增后，把整個反應(yīng)基質(zhì)直接裝載到H5 Horizon凝膠裝置(Life Technologies)中的4％的NusieveSeakem(3∶1)(FMCBioproducts，Rockland，ME)瓊脂凝膠上并使其電泳。用溴化乙錠染色并紫外光透明化來使DNA的電泳條帶可見。用55 Polaroid的正/反膠片(Polaroid，Cambridge，MA)照像(見圖1中部條帶)。通過單反光密度測定法掃描凝膠負(fù)向來進(jìn)行競爭性PCR分析(Shimadzu；科學(xué)儀器，哥倫比亞，MD)。
計算試驗(yàn)的密度測定值和突變體條帶并把各反應(yīng)管的比率作為所加入的突變體模板量的函數(shù)繪制成圖(圖1，低部條帶)。對α2IV的膠原突變體來說，在繪制突變體/試驗(yàn)帶比率圖前，用562/479因子校正所測定的密度測定帶的強(qiáng)度。對α2IV的突變體帶來說，在除以原始型(試驗(yàn))帶值前加入它們的密度值。通過線性回歸分析繪制直線。計算試驗(yàn)樣本中的CDNA的量即突變體/試驗(yàn)帶密度比等于1時的量。重復(fù)兩次或三次進(jìn)行競爭性PCR分析。
實(shí)施例2
硬化腎小球的變化如Peten等在實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1761571-1576(1992)所述，從人患者取腎癌單側(cè)腎切除樣本。該患者沒有糖尿病、高血壓或其他與腎小球疾病相關(guān)的全身疾病的歷史。把遠(yuǎn)離明顯腫瘤的皮層組織樣本用甲基丙烯酸樹脂或石蠟包埋后放在Carnoy的固定液中，并用過碘酸-Schiff(PAS)給切片染色。通過PAS-染色材料的組織檢查(圖2，頂部條帶)和在把IV型膠原(PHM-12，Silenus，Westbury，NY)暴露給抗體后對冷凍切片的免疫熒光顯微檢查分別評價用腎小球膜基質(zhì)膨脹定義的腎小球硬化癥(圖2，中部條帶)。
按照實(shí)施例1所述的進(jìn)行競爭性的PCR測定來確定α2IV(疤痕型)細(xì)胞外膠原的量。按照圖2低部條帶中所示測定以前發(fā)現(xiàn)正?；蛴不哪I小球中膠原型的相應(yīng)濃度。
把沒有腎小球硬化的5名患者的腎小球中相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)與患有硬化的5名患者的進(jìn)行比較。如圖3所反映的，各組之間的腎小球相關(guān)數(shù)量的差異沒不具有顯著性(p＞0.8)，而對α2IV膠原cDNA的濃度而言，在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著(0.01＜p＜0.025)。
實(shí)施例3正常和有病腎的腎小球中相對膠原的mRNA比使用實(shí)施例1和2中所述的方法，給腎小球中α2/α3IV膠原mRNA的相對比進(jìn)行定量，其中的腎小球取自于患有粘膜性腎小球腎炎(MN)和糖尿病型腎病(DM)的人患者和患有伴有腎小球硬化癥腎切除(NXGS)和不伴有腎小球硬化癥的腎切除(NX NI)的人患者的診斷性活組織檢查。如圖4所反應(yīng)出來的，α2/α3IV膠原mRNA的比在DM和在NSGS中比在NX NI中顯著更高。(**p＝0.0002，*p＝0.02)。
實(shí)施例4用PPS的體外試驗(yàn)試驗(yàn)A試驗(yàn)設(shè)計把正常腎小球膜細(xì)胞(8)以2-2.5×104個細(xì)胞/孔的密度平板接種在24孔平皿(Nunc，PGC Scientific Corp.，Gaithersburg，MD)中加有20％胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Gibco，Grand Island，NY)。在24小時時，去掉培養(yǎng)基，用PBS把細(xì)胞洗滌兩次并在含有0.1％牛血清白蛋白(RIA級，Sicjma)的無血清培養(yǎng)基中溫育24-72小時。把該培養(yǎng)基用加有含或不含5-100μg/ml的PPS的20％胎牛血清的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換或者與標(biāo)準(zhǔn)肝素(100μg/ml)作對照。用胰蛋白酶消化兩份孔中的細(xì)胞并在+3和+5天用一臺Elzone細(xì)胞計數(shù)器(Particle Data Inc.，Elmhurst，IL)計數(shù)。在平行孔中，通過加入1μCi/孔的[3H]胸苷([甲基-3H]胸苷)；2.0Ci/mM；DuPont NEN，Boston，MA)來測定胸苷的摻入。在第1天或第3天測定數(shù)目。結(jié)果在第1天(24小時)中，50μg/ml為最大劑量-反應(yīng)(圖5)，而在第3天，25μg/ml為最大抑制反應(yīng)(圖6)。
在沒有加入(對照)和肝素(100μg/ml)及PPS(100μg/ml)之間進(jìn)行對照，顯示出在基礎(chǔ)摩爾的PPS大約是原始肝素功效的兩倍(圖7)。該反應(yīng)是非?？稍佻F(xiàn)的(誤差非常窄)。
總結(jié)圖(圖8)比較了加到血清中的PPS對僅暴露給血清的對照細(xì)胞的功效。試驗(yàn)B在不同時期把正常腎小球膜細(xì)胞層暴露給PPS(100μg/ml)，并且在第1天測定選擇分子的逆轉(zhuǎn)錄mRNA含量并與第3天和第5天的mRNA的含量對照(參見圖9)，IV型的膠原mRNA沒有變化，I型的膠原mRNA實(shí)際上下降，TGF-βmRNA減少了50％并且92kDa酶活性增加了50％以上。對照是β-肌動蛋白，它沒有變化，在治療細(xì)胞中一直沒有增生。
實(shí)施例5用GH轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計使用特殊的引物對來自尾部活組織檢查的去污劑提取物質(zhì)進(jìn)行PCR分析來鑒別12只6周齡的GH轉(zhuǎn)基因小鼠的牛生長激素cDNA，其中的牛生長激素cDNA不與鼠的GH序列交叉反應(yīng)。在6只GH小鼠的飲用水中加有口服的PPS鈉(Elmiron，Baker Norton制藥公司)來對它們治療10-12周并且在同一時期使6只同齡GH轉(zhuǎn)基因小鼠飲用自來水。在飲用水中PPS鈉的量是大約每千克動物體重100mg。分離腎小球并原位逆轉(zhuǎn)錄在RNase抑制劑存在下，通過顯微切片來分離腎小球。用生理鹽水灌注左腎接著用含有可溶的核糖核酸酶抑制劑的膠原溶液灌注。在膠原酶灌注前除去較低的極性并把酶在干冰上迅速冷凍。在膠原酶酶解后，在氧釩核糖核苷復(fù)合物存在下在4℃分離40-60個腎小球用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)。在原位把RT如上所述進(jìn)行操作，不同的是，在加入RT組份前，用丙酮干冰把腎小球凍融一次并且在2％氘核和4個單位/μl的人胎盤核糖核酸酶抑制劑(Boehringer Mannheim，Indianapolis，NJ)存在下于2℃進(jìn)行超聲處理5分鐘。使用顯微超聲細(xì)胞破碎器(Kontes，Vineland，NJ)在超聲處理過程中冷凍樣品。標(biāo)準(zhǔn)的和競爭性的PCR分析在PCR-Mate(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上合成小鼠α1IV和α1I膠原的引物、α平滑肌細(xì)胞肌動蛋白、β-肌動蛋白、層粘連蛋白B1、韌粘素、92kDa金屬蛋白酶和7kDa金屬蛋白酶mRNAs，以及牛生長激素基因組的DNA。通過大小和通過限制酶分析來證實(shí)各擴(kuò)增產(chǎn)物的一致。通過忽略逆轉(zhuǎn)錄酶來測定引物對mRNA的專一性。用GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)進(jìn)行PCR。開始使用PCR擴(kuò)增的線性對數(shù)部分通過標(biāo)準(zhǔn)PCR來分析來自40-60腎小球/小鼠庫中的cDNA。這是一個快速的非定量的mRNA含量的測定。之后，使用競爭性的PCR來測定α1IV膠原(并且計算α1IV膠原與GAPDH酶的比率來使動物之間的數(shù)據(jù)正常化)、PDGF-B、α平滑肌細(xì)胞肌動蛋白、β-肌動蛋白和層粘連蛋白B1 cDNA，通過使用內(nèi)部少量缺失或新的限制酶部位構(gòu)建各分子的cDNA突變體。用裝有Quantity One圖像分析軟件的PDI密度計進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分析。把競爭性PCR分析重復(fù)進(jìn)行兩次或三次。結(jié)果如圖10所示，在用口服的PPS鈉治療的小鼠組與未治療(對照)小鼠組相比，IV型膠原/GAPDH的平均比小于一半。這種差異表明與未治療動物相比，在治療動物的腎小球中存在顯著少的裂痕型膠原，通過組織檢查和免疫熒光顯微檢查證實(shí)了這一事實(shí)。
實(shí)施例6Watanbe兔試驗(yàn)Watanbe兔1作為天然內(nèi)源性血膽固醇過多的動物模型。用純合子狀態(tài)完全表達(dá)這種性狀，用雜合子狀態(tài)部分表達(dá)并且由于單一基因缺失。純合子Watanabe兔具有比正常日本白兔高8到14倍的血漿膽固醇濃度。
1.該類兔子已知作為Watarabe遺傳高脂血兔子(WHHL)。
Watanabe兔具有非常高的動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)病率尤其在主動脈。給該兔飼喂高膽固醇飲食來增加動脈粥樣硬化的發(fā)展速度和嚴(yán)重性。
進(jìn)行以下兩種試驗(yàn)來證實(shí)PPS對Watanabe兔的抗動脈粥樣硬化活性。試驗(yàn)A對PPS的皮下評估把12只Watanabe兔分成兩組，每組六只(A組和B組)并飼喂高膽固醇飲食(0.5％膽固醇)。對A組動物每天用正常的生理鹽水皮下治療，同時對B組動物每天用10mg/kgPPS鈉(Elmiron)皮下治療。
在試驗(yàn)結(jié)束之前，四只PPS治療的動物(B組)死亡，在第22天一只并且在第80到86天之間三只。在第89天，殺死A組的動物和B組剩余的兩只動物并進(jìn)行尸檢和對它們組織的評價，特別是來自主動脈不同主要支脈的切片。結(jié)果如下表I所示，發(fā)現(xiàn)相對于A組的對照兔，在所有檢查的主動脈縱切片中治療組B的動物具有許多較小的斑塊沉積和較高的平滑肌層與斑塊的比率(高6.8倍)。這些發(fā)現(xiàn)在圖11所示的圖片中直觀地顯示出來。對照組動物的腹部主動脈的縱切片表示幾乎所有橫切片區(qū)具有較高發(fā)生的動脈粥樣硬化斑塊。用PPS鈉治療的動物的腹部主動脈的縱切片顯示出幾乎沒有斑塊的痕跡，盡管用與對照組相同的高膽固醇飲食飼喂治療組。
表1Watanabe兔主動脈病灶的形態(tài)測定
試驗(yàn)B對PPS的口用評估把20只Watanabe兔分成四組A到D，每組5只。所有的兔都用相同的高膽固醇飲食(0.5％膽固醇)飼喂。對A和B組的動物給自來水飲用，而對C和D組的動物給含有0.5mg/ml PPS鈉(Elmiron)的自來水飲用。以試驗(yàn)前動物消耗的水的觀察為準(zhǔn)，在治療組中每只動物各消耗的PPS的每日總劑量為大約30mg/kg。
因?yàn)榕cPPS不相關(guān)的明顯膿腫，在第4天和第11天分別除去治療兔中的兩只。
在試驗(yàn)的第50天殺死A和C組的動物并進(jìn)行尸檢和對它們的主動脈檢查。在A組(對照)動物的內(nèi)膜和C組(治療)動物的內(nèi)膜之間肉眼觀察到顯著差異，后者存在較少的動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生。
在試驗(yàn)的第64天殺死B和D組的兔子并進(jìn)行尸檢。從組織上和內(nèi)膜橫切片區(qū)檢查這些組的主動脈并且測定不同主動脈支脈中內(nèi)膜和中膜層的橫切片區(qū)。
圖12是一幅反映在縱切片中測定的內(nèi)膜平均區(qū)，這些縱切片分別來自對照組(B組)和治療組(D組)兔的主動脈的各種支脈。圖12顯示了在治療動物與未治療動物相比，所檢查的內(nèi)膜區(qū)的各主動脈支脈明顯較少，這說明在治療組的血管組織中實(shí)際存在較少的動脈粥樣硬化的病灶和斑塊的沉積。
圖13顯示了在相同主動脈縱切片中內(nèi)膜至中膜區(qū)的比率平均值，其中的縱切片取自如圖12所述的B和D組的兔。該比率反映了疤痕組織和沉積在靜脈壁上的斑塊(這樣的沉積增加了內(nèi)膜的橫切片區(qū))的相對量。治療兔(D組)與未治療動物(B組)相比，各主動脈支脈中該比率是較低的。
經(jīng)科學(xué)所證實(shí)的試驗(yàn)步驟產(chǎn)生的上述數(shù)據(jù)證實(shí)了PPS在降低額外細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成和特定細(xì)胞生長因子同時增加膠原降解酶活性的功效。這些作用表明PPS在臨床治療CPVSD的逆轉(zhuǎn)特別是動脈硬化和動脈粥樣硬化中是高效的。
這樣，通過所提供的方法和組合物完成了本發(fā)明的各種目的，并且很好適用于實(shí)際使用的狀況。
因?yàn)楦鞣N可能的實(shí)施方案組成了本發(fā)明，并且因?yàn)樵谏鲜鰧?shí)施方案中可以作各種變化，所以，應(yīng)當(dāng)理解為本文所述的所有內(nèi)容是為了詳細(xì)地解釋發(fā)明而不是限定。
權(quán)利要求
1.治療患有慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病(CPVSD)的哺乳動物患者的方法，其中該疾病使受影響的血管系統(tǒng)引起血管腔的狹窄和擴(kuò)張性下降，該方法能夠中止該疾病的進(jìn)程并能夠引起消除或減少已經(jīng)形成的疤痕損傷，該方法包括給患者服用含有對血管疤痕疾病有效治療量的戊聚糖多硫酸酯(PPS)或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中受影響的血管系統(tǒng)是動脈血管。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中該動脈是主動脈或其主要支脈。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中該疾病是已疤痕為特征的動脈硬化的一種形式并且其中的動脈硬化疤痕過程是可以被該方法逆轉(zhuǎn)的。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，該動脈硬化形式是動脈粥樣硬化并且該疤痕包括受動脈粥樣硬化斑塊影響的動脈血管壁。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中把足夠用量的藥用組合物對患者給藥以提供大約5到30mg/kg患者體重的每日總劑量或大約350到2,000mg的PPS或其藥學(xué)上可接受的鹽。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中該每日劑量為大約500到大約1,500mg。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中以一次到四次等分劑量把該每日劑量給藥。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該藥用組合物是口服劑型。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中該劑型選自于由常規(guī)或持續(xù)釋放片劑、包衣片、膠囊、小丸、錠劑、液體和酏劑。
11.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中該劑型包括至少一種藥學(xué)上可接受的惰性成分。
12.按照權(quán)利要求11所述的方法，其中該惰性成分是填充劑、粘合劑、溶劑、賦性劑或載體。
13.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中該劑型包括每份大約50到大約300mg的PPS或其藥學(xué)上可接受的鹽。
14.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該藥學(xué)上可接受的鹽是鈉鹽。
15.按照權(quán)利要求14所述的方法，其中該組合物是含有PPS鈉、微晶纖維素和硬脂酸鎂的明膠膠囊。
16.按照權(quán)利要求1的方法，其中該患者是人。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療患有慢性進(jìn)行性血管疤痕疾病(CPVSD)尤其是動脈硬化疾病如動脈粥樣硬化的哺乳動物患者的方法,該方法能夠中止或至少使該疾病的進(jìn)程明顯緩慢并能夠引起消除和/或減少已經(jīng)形成的疤痕和損傷。該方法包括給患者服用一種含有有效量的戊聚糖多磺酸酯(PPS)或藥學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物。優(yōu)選口服,PPS或PPS鹽的每日總劑量在大約5到大約30mg/kg患者體重,成人每天大約350到大約2,000mg。
文檔編號C08B37/00GK1259871SQ98805235
公開日2000年7月12日 申請日期1998年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月16日
發(fā)明者G·E·斯特里克, L·J·斯特里克 申請人:(由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部部長代表的)美利堅(jiān)合眾國