專利名稱：交聯(lián)顆粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于輸送藥物的交聯(lián)顆粒。具體地講，本發(fā)明涉及在脊椎動物體內(nèi)使這些顆粒穩(wěn)定，并控制攝取和藥劑釋放的方法。
背景技術：
在腫瘤藥物治療的開發(fā)和改進中，藥劑向活性位點的有效輸送及達到可接受的藥劑釋放速率是由來已久的問題。具體地講，已充分意識到脊椎動物的胃腸道給治療劑的成功給藥設置了若干物理和化學屏障。例如，治療劑必須得忍受內(nèi)源性酶、胃酸和腸道堿性的攻擊，而不喪失活性，然后再穿過胃腸粘膜，進入血流并到達需要此活性的作用位點。此外，所有這些必須以適當?shù)乃俾蔬M行，以保證輸送正確的治療劑量。
以前，嘗試了很多方法試圖解決這些問題。例如，使用特別高劑量的活性試劑，以確保至少一些試劑達到需要的活性位點而不降解方面可能是有效的。此方法使用腸溶劑的情況下明顯成問題并且不經(jīng)濟。在某些情況下，提供簡單的機械載體，如壓片或腸溶包衣，以改善相應藥劑的腸溶耐受性，并調(diào)整藥物釋放速率可能是合適的。最近對開發(fā)脂質(zhì)體或脂質(zhì)微囊泡(microbubble)也已進行了相當?shù)难芯浚鼈兛梢杂糜诮亓艋钚栽噭?。但這些方法不是在所有條件下都成功的。
可以截留藥劑以提供保護并調(diào)整其釋放速率的微?；蚝廖⒓夘w粒描述于美國專利5352461。此專利涉及自裝配顆粒藥物輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)由2，5-二酮基-3，6-二(4-琥珀酰氨基丁基)哌嗪形成，該系統(tǒng)是pH敏感形的，在高pH條件下崩解并釋放內(nèi)部截留的藥劑。用作截留藥物試劑，如胰島素和肝素，并保護這些分子不受胃酸和胃酶破壞，并將其釋放進血流的其它顆粒，描述于國際專利申請WO88／01213中?；陔p酰胺二羧酸的自裝配性質(zhì)的自裝配pH可滴定顆粒系統(tǒng)描述于Bergeron等的“美國化學會志”1995，117，6658-6665中。這些顆粒也具有低pH下穩(wěn)定而pH增高時不穩(wěn)定的性質(zhì)。
國際專利申請WO96／29991描述了自裝配顆粒的形成，該顆?；诰郯被?，更具體地講是基于聚亮氨酸-谷氨酸。由中性氨基酸制備的這些顆粒有可控制粒度的特點，并在很寬的pH范圍內(nèi)都穩(wěn)定。
截留藥劑的顆粒，特別是截留肽或蛋白質(zhì)也可通過多種陰離子聚合物與陽離子聚合物的聚電解質(zhì)絡合反應形成。陰離子聚合物可以包括天然物質(zhì)，如藻酸鈉、羧甲基纖維素、瓜拉那(guaran)、聚谷氨酸及其衍生物。其它聚陽離子和聚陰離子詳述于專利EP 671169、US 4835248和US 5041291，將它們整體引入作為參考。
遺憾的是，本領域中進行藥物輸送的顆粒的效果是有限的，因為現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)非腸道或經(jīng)腸給藥的很多情況下這些顆粒會快速釋放其中截留的藥物試劑。因此，人們通過使用戊二醛交聯(lián)努力開發(fā)穩(wěn)定的微粒。然而，此交聯(lián)方法的缺點是可導致被截留藥劑的變性，這顯然是不利的。另一個缺點是這種交聯(lián)最好在堿性條件下進行，在此條件下很多pH敏感顆粒會快速釋放所截留的藥劑。
因此，適于與pH敏感顆粒一起使用，并可以在不(或很少)改變所截留的藥劑前提下進行的顆粒穩(wěn)定化處理實用方法，是非常需要的。具體地講，迫切需要輸送藥劑的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的之一是提供顆粒穩(wěn)定化處理的實用方法，該方法降低或消除了所截留藥劑的變性現(xiàn)象。
本發(fā)明的另一個目的是提供輸送藥劑的方法，該方法降低或消除了所截留藥劑的變性現(xiàn)象。
為完成上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供交聯(lián)的顆粒，其可用下列組分制備a)能形成顆粒的一種或多種聚合物，各自都含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基；及b)含有兩個或多個反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物；其中通過在聚合物(一種或多種)和間隔物的羧基與酰肼基、氨基和／或巰基之間通過碳二亞胺連接達到交聯(lián)。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，提供含截留在交聯(lián)顆粒中的藥劑的藥物組合物，其中交聯(lián)顆粒含有a)能形成顆粒的一種或多種聚合物，各自都含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基；及
b)含有兩個或多個反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物；并且其中交聯(lián)是在藥劑的存在下，并通過聚合物(一種或多種)和間隔物的羧基與酰肼基、氨基和／或巰基之間借助碳二亞胺催化進行的。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，提供了制備交聯(lián)顆粒的方法，該方法包括在適當?shù)臈l件下使下列組分反應a)能形成顆粒的一種或多種聚合物，各自都含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基；及b)含有兩個或多個反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物；并且其中通過在聚合物(一種或多種)和間隔物的羧基與酰肼基、氨基和／或巰基之間通過碳二亞胺連接達到交聯(lián)。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，提供了制備含一種或多種藥劑的藥物組合物的方法，該方法包括將交聯(lián)顆粒與一種或多種藥劑反應，其中顆粒含有a)能形成顆粒的一種或多種聚合物，各自都含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基；及b)含有兩個或多個反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物；并且其中通過在聚合物(一種或多種)和間隔物的羧基與酰肼基、氨基和／或巰基之間通過碳二亞胺連接達到交聯(lián)。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，提供了在患者體內(nèi)控制藥劑釋放的方法，該方法包括給所述患者使用有效量的組合物，該組合物中含有截留在交聯(lián)顆粒中的藥劑，其中交聯(lián)顆粒含有a)能形成顆粒的一種或多種聚合物，各自都含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基；及b)含有兩個或多個反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物。
在這些實施方案中，間隔物優(yōu)選下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈烷基或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。此間隔物也可選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼、谷氨酸二酰肼、天門冬氨酸二酰肼、蘋果酸二酰肼、酒石酸二酰肼、對苯二甲酸二酰肼、間苯二甲酸二酰肼及鄰苯二甲酸二酰肼。
在另一個實施方案中，間隔物可以選自丙二酸、馬來酸、蘋果酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物，其中所述烷基衍生物的烷基最多含10個碳原子。
在另一個實施方案中，該間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。此間隔物還可以含有至少一個生物可降解的鍵。此生物可降解的鍵可以是酯鍵，例如此間隔物是氨基酸的2-氨基乙基酯。在優(yōu)選的實施方案中，此間隔物是甘氨酸或苯丙氨酸的2-氨基乙基酯，或其二琥珀酰亞氨基衍生物。在優(yōu)選的實施方案中，甘氨酸和苯丙氨酸的2-氨基乙基酯的二琥珀酰亞氨基衍生物選自N，N′-二琥珀酰亞氨基-(2-氨基-2-芐基-乙酸酯)、N，N′-二琥珀酰亞氨基-2-氨基乙基-乙酸酯和乙二醇雙[琥珀酰亞氨基琥珀酸酯]。
此交聯(lián)顆?？梢怨矁r連接于靶化合物上。在另一個實施方案中，此藥劑選自肽和蛋白質(zhì)藥物、DNA、RNA、抗體、疫苗、造影劑、激素、多糖、抗生素、抗凝劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞毒試劑、甾類、消充血劑、麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑。在優(yōu)選的實施方案中，此藥劑選自降鈣素、促紅細胞生成素、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、LHRH類似物、促生長素抑制素、胰島素、干擾素和纖溶酶原激活物抑制劑。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點在下面的詳細描述中是顯而易見的。但是應理解，詳細描述和特定的實施例表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，它們的給出僅僅是舉例而已，因為對本領域技術人員來說，根據(jù)此詳細描述，在本發(fā)明實質(zhì)和范圍內(nèi)進行的多種變化和改進都是顯而易見的。
附圖簡述

圖1顯示靜脈使用胰島素和截留在明膠和羧甲基纖維素(CMC)形成的交聯(lián)顆粒中的胰島素后，雄性Wistar鼠中血糖的變化曲線。該曲線顯示隨時間的血糖百分濃度變化(相對于時間為0時的血糖濃度)。在給藥后0、1、2、3、4、5和6小時進行血液分析。給這些鼠使用高度交聯(lián)的顆粒、中度交聯(lián)的顆粒、低度交聯(lián)的顆?；蛞葝u素對照物。每只鼠使用100μg胰島素或含100μg胰島素的顆粒制劑。
圖2顯示靜脈使用胰島素和截留在明膠和聚谷氨酸[Gel／P-Glu]或明膠和己二酰酰肼基[Gel／AH-P-Glu]形成的交聯(lián)顆粒中的胰島素后，雄性Wistar鼠中血糖的變化曲線。該曲線顯示了隨時間的血糖百分濃度變化(相對于時間為0時的血糖濃度)。在給藥后0、1、2、3、4、5和6小時進行血液分析。給這些鼠使用了高度交聯(lián)的顆粒、中度交聯(lián)的顆粒、低度交聯(lián)的顆?；蛞葝u素對照物。每只鼠使用100μg胰島素或含100μg胰島素的顆粒制劑。
圖3顯示使用含胰島素顆粒對鼠葡萄糖水平的作用。用EDAC和AH交聯(lián)大大降低了胰島素從顆粒中釋放的速率。
圖4顯示增加脂酶可裂解交聯(lián)劑的量后，對體內(nèi)AH-CMC毫微顆粒中胰島素釋放速率的作用。
圖5顯示口服結(jié)合維生素B12的含胰島素的IBCA毫微顆粒后，鼠血糖的降低。
發(fā)明詳述交聯(lián)顆粒有利于藥劑輸送，不然這些藥劑因不穩(wěn)定、不適于攝入或釋放速率不當將喪失效力。具體地講，本發(fā)明包括的藥劑含肽和蛋白質(zhì)藥物，這些藥物受蛋白質(zhì)水解降解作用，在胃和小腸中不穩(wěn)定。
總之，治療劑優(yōu)選的給藥方法是經(jīng)腸，并特別是口服途徑。這樣使給藥容易，并能得到更高的患者順從性。但是，目前很多治療劑不能有效地通過口服途徑給藥。這些試劑的實例包括肽和蛋白質(zhì)藥物，包括降鈣素、促紅細胞生成素、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、LHRH類似物、生長激素釋放抑制因子、胰島素、干擾素和纖溶酶原激活物抑制劑、重組抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明的上下文中，術語“藥劑”不限定于肽和蛋白質(zhì)藥物，而是包括任何治療、預防或診斷試劑，其輸送可得力于使用本發(fā)明的交聯(lián)顆粒。例如，DNA和RNA物種(有義或反義)、抗體、疫苗以及更多的傳統(tǒng)化療劑的輸送。術語“藥劑”應理解為包括簡單的有機或無機化合物、營養(yǎng)劑和造影劑，如金屬、放射性同位素、不透射線的或透射線試劑。“傳統(tǒng)”化療劑的實例包括激素、多糖，如肝素、抗生素、消炎化合物、抗病毒劑、血管活性和神經(jīng)活性劑、抗凝劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞毒試劑、甾類、消充血劑、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑及任何為治療、預防或診斷目的需要給患者使用的其它試劑。此表中例舉的藥劑種類不是窮舉。
此外，本發(fā)明的藥劑可以以多種形式出現(xiàn)，例如，帶電或不帶電分子的形式、分子復合物的組分、鹽、胺、醚、酯或酰胺的形式，或相應試劑的其它衍生物或前藥形式。
本發(fā)明不限于藥劑的經(jīng)腸輸送。例如，藥劑的非腸道給藥也可得益于本發(fā)明，例如，當藥劑必須穿過體內(nèi)屏障(胃腸道粘膜以外的)以達到靶器官或靶位點時。血腦屏障是此種屏障的一個實例。此外，藥劑可以輸送到特定的活性位點并在該處緩釋。
本發(fā)明的文本中，術語“交聯(lián)”指在顆粒內(nèi)的聚合物中和／或之間引入共價鍵連接。交聯(lián)增加了該顆粒的穩(wěn)定性，于是給截留的藥劑提供了更好的保護，并改善了控制水平以致于可在長時間內(nèi)釋放，還改善了藥劑釋放的速率。
可以用于任何類型的顆粒的本發(fā)明的交聯(lián)技術或是已知的，或可在未來設計出，只要顆粒的聚合物組分含有，或可以改性含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基。術語“反應性”在本文中指優(yōu)選存在于顆粒外表面的基團，并且不被其它官能團阻礙，由此可允許本發(fā)明涉及的交聯(lián)反應發(fā)生。
術語“顆?！边€包括用于藥劑輸送的所有顆粒，不論其三維形狀或構象如何。本發(fā)明的顆?？梢匀炕虿糠纸亓羲巹┗?qū)⑺巹┙亓粼陬w粒的聚合物骨架中。按照上述分類為微級或毫微級顆粒的顆粒包括在此定義中，故平均顆粒直徑可以為約10nm至900μm。例如，作為埋植的顆粒，將定位于身體的特定區(qū)域以實現(xiàn)藥劑的控釋，其適宜的平均直徑為400-800μm，而需要進入細胞內(nèi)或通過胃腸道粘膜的顆粒平均直徑可小于約10μm。相反，皮下給藥的顆粒的平均直徑大于10μm是適當?shù)?，這樣可防止這些顆粒再進入體循環(huán)中。
所用顆粒的形狀和三維構象依賴于相應顆粒的用途而定。具體地講，依據(jù)被輸送的藥劑的三維形狀或構象的知識來選擇顆粒的形狀或構象。
全部引入作為參考的下列文獻說明了多種類型的顆粒，它們可用于、或經(jīng)改進適于本發(fā)明有關用途。其中公開的文獻表及顆粒的類型并不只限于此。美國專利5352461；國際專利申請WO88／01213；Bergeron等，“美國化學會志”，1995，117，6658-6665；國際專利申請W96／29991；歐洲專利6712169及美國專利4835248和5041291。
總之，并也不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍，借助很多方法可形成輸送藥劑的顆粒，其中一些方法如下(ⅰ)溶劑蒸發(fā)在此技術中，將溶解于一種溶劑的化合物分散進不互溶的溶劑中，并將第一種溶劑蒸發(fā)。以此形式形成的顆粒用于一些水不溶性化合物的非腸道給藥。此系統(tǒng)的實例可以是聚乳酸-乙醇酸毫微顆粒的形成，其中截留抗真菌劑灰黃霉素。
(ⅱ)去溶劑化在此方法中，將化合物溶解于第一種液體(溶劑)和第二種液體(第二種溶劑與第一種溶劑互溶，但是此化合物在其中不溶)。隨著第二種溶劑加入的增多，該化合物出現(xiàn)去溶劑化作用。在此去溶劑化的過程中，富含化合物相(凝聚層)含有濃縮量的化合物，它在化合物缺乏相中以微滴的形式分散。在此階段，凝聚的物質(zhì)可以通過適當?shù)慕宦?lián)劑進行化學交聯(lián)以形成微顆?；蚝廖㈩w粒。明膠或BSA的毫微顆粒就是以此方式制備的。通過加入硫酸鈉或硫酸銨溶液將這些蛋白質(zhì)的溶液去溶劑化。在去溶劑化作用點，濁度增加，此時通過加入適當?shù)慕宦?lián)劑，如戊二醛或丁二酮可形成毫微顆粒。
(ⅲ)復合團聚在此方法中，將帶有相反電荷的兩種聚電解質(zhì)在含水介質(zhì)中混合，以便發(fā)生自發(fā)液／液相分離。此現(xiàn)象限于具有適當離子電荷密度和鏈長的聚合物。一般通過向聚陽離子，如明膠或聚賴氨酸中加入聚陰離子如聚谷氨酸、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、藻酸或聚磷酸形成這些微球。
(ⅳ)聚合物／聚合物不相容性此方法基于發(fā)現(xiàn)兩種化學特性不同的聚合物溶解于普通溶劑中，常常是不相容的。因此此混合物有變?yōu)閮上嗟内厔?。例如，通過加入聚乙烯從環(huán)己烷中沉淀乙基纖維素。
(ⅴ)界面聚合在此技術中，兩種反應劑(每種都溶解于互不溶混液體中)，向兩種液體之間的界面擴散，在此它們反應形成膠囊壁。這種膠囊形成的實例出現(xiàn)在癸二酰氯溶解于油相的混合物被乳化進入含乙二胺的水相時。
從上述描述中可以看出，多種不同類型的聚合物能形成可以用于藥劑輸送的顆粒。
本發(fā)明的顆粒交聯(lián)的方法是通過形成顆粒的聚合物或多種聚合物上的羧基、酰肼基、氨基和／或巰基之間反應，同時與含兩個或多個羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的間隔物化合物反應進行，該反應一般由于存在至少一種碳二亞胺而被催化。優(yōu)選的交聯(lián)反應包括在肼和羧基之間生成酰肼鍵；在胺和羧基之間形成酰氨鍵；在羧基和巰基之間形成硫代酯；及在巰基之間形成硫醚鍵。本領域技術人員應清楚地理解如果選擇的顆粒系統(tǒng)的聚合物或多種聚合物不含有反應性羧基、酰肼基、氨基和／或巰基，則需要進行化學修飾以便能夠反應。在典型的反應中，通過聚合物與二酰肼基間隔物和適當?shù)奶级啺贩磻蓪⒑然木酆衔镉悯ｋ禄〈?見實施例7和8，及Russell-Jones等，“生物結(jié)合作用化學”，6，459-465)。
適用于本發(fā)明的聚合物包括(但不限于)聚氨基酸，如聚谷氨酸、聚天門冬氨酸和聚賴氨酸；聚(N-酰基羥基丙炔酯；聚癸二酸、聚富馬酸；聚乳酸；聚羥基乙酸；聚乳酸-共-羥基乙酸；羧甲基纖維素；阿拉伯膠；藻酸鹽；聚磷酸；肝素；明膠；癸二酸和富馬酸的共聚物；雙羧基苯氧基丙烷和癸二酸的共聚物；聚(羧基苯氧基乙)酸；聚(羧基苯氧基戊)酸；聚-ε-己內(nèi)酯和相應的聚酯(聚-ε-己內(nèi)酯-共-δ-戊內(nèi)酯；聚-ε-己內(nèi)酯-共-DL-乳酸；透明質(zhì)酸；殼多糖；脫乙酰殼多糖；葡聚糖；羧基-葡聚糖；膠原；白蛋白；血纖蛋白原；以及其它天然聚合物。
方案1表示本發(fā)明的反應方案的實例。在此方案中，三羧酸，檸檬酸先與2倍摩爾的過量EDAC和NHS反應。然后，將所得二琥珀酰亞氨基酯與己二酰肼修飾的聚合物反應，形成共價交聯(lián)聚合物(見實施例8)。
下列方案2表明了本發(fā)明總反應方案的另一個實例。在方案2中，聚合物上的羧酸與EDAC在1／2當量的己二酰肼的存在下反應，形成共價交聯(lián)聚合物(見實施例3)。
按照本發(fā)明，對用于本發(fā)明的碳二亞胺的類型無特別限制，但特別優(yōu)選的一些碳二亞胺為N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(稱為EDC或EDAC)、N，N′-二環(huán)己基-碳二亞胺(DCC)、N′-二異丙基-碳二亞胺、N′，N′-二叔丁基碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1，3-二-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(β-二乙基氨基乙基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺(Sheehan等，“有機化學雜志”，21，439-441(1956))。實際上，可以使用可產(chǎn)生活性酯的任何偶合劑，例如，BOP、PyBOP、TSTU、HBTU、TBTU、HBPyU、DPPA、IIDQ、EEDQ。這些偶合劑是肽合成領域熟知的。
本發(fā)明包括的二酰肼包括(但不限于)如下通式ⅠNH2NHCO-R-CONHNH2式Ⅰ其中R代表價鍵，或者直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基。R優(yōu)選最多含10個碳原子。
優(yōu)選的二酰肼選自(但不限于)草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、蘋果酸二酰肼、降冰片烯二酰肼、鄰苯二甲酸二酰肼、酒石酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、谷氨酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼。也可以使用肼。
可以用于本發(fā)明的羧酸間隔物包括丙二酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物。
間隔物還可能含有兩個以上的羧基、酰肼基、氨基和／或巰基，或甚至根據(jù)存在于聚合物(一種或多種)上的反應性基團的性質(zhì)含有羧基、酰肼基、氨基和／或巰基的聯(lián)合形式。即如果在聚合物(一種或多種)上只存在反應性羧基，則可以使用只含有酰肼基、氨基或巰基反應性基團的間隔物，反之亦然。如果聚合物(一種或多種)含有羧基和酰肼基，對于間隔物來說，也含有這些反應性基團是合適的。
總之，根據(jù)要求的交聯(lián)水平，進行交聯(lián)反應必須使用的條件為簡單地提供約等摩爾量的間隔物和碳二亞胺即可。然后，需要讓其反應約2至24小時，優(yōu)選至少4小時，以便交聯(lián)進行完全。此交聯(lián)的截留顆?？赏ㄟ^用蒸餾水，或用其它適宜的緩沖液如PBS、生理鹽水、HEPES等透析復原。
在顆粒形成時可在顆粒內(nèi)摻混藥劑，優(yōu)選將藥劑加入到制備顆粒需要的組分的混合物中。另外，在通過聚電解質(zhì)絡合反應等形成納米級顆粒的情況下，依其溶解度，藥劑可以加入到聚陽離子或聚陰離子相中，并將此混合物慢慢加入到沉淀相中(見實施例1和2)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，間隔物包括生物可降解的鍵，可以加以控制的方式在特定的環(huán)境中降解。例如，可將其摻混入將在特定的環(huán)境中裂解的間隔鍵單元，以便該生物可降解鍵發(fā)生裂解，使顆粒釋放其截留的藥劑。這些生物可降解的鍵可以量身定制，以便在需要的環(huán)境中能將該鍵裂解。一些生物可降解鍵的實例包括二硫鍵、偶氮基和酯，它們可在特定的條件下裂解。適宜的硫醇可裂解連接基包括胱胺、胱氨酸和氧化的谷胱甘肽，后兩種可以被NHS和碳二亞胺活化，然后用于連接酰肼基。可以直接與酰肼基側(cè)基反應的其它硫醇可裂解的交聯(lián)連接基包括雙-[β-(4-疊氮基水楊酰氨基)乙基]二硫化物、二硫代雙-(琥珀酰亞氨基丙酸)、3，3′-二硫代雙丙酰雙亞胺酸二甲酯、3，3′-二硫代雙(磺基琥珀酰亞氨基丙酸)、磺基琥珀酰亞氨基2-(間-疊氮基-鄰-硝基苯甲酰氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸，N-琥珀酰亞氨基6-(4′-疊氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸和磺基琥珀酰亞氨基-2-(對-疊氮基-水楊酰氨基)乙基-1，3-二硫代丙酸。
適宜的脂酶裂解鍵包括由已知氨基酸的2-氨基乙基酯形成的，包括胱氨酸的2-氨基乙基酯、苯丙氨酸的2-氨基乙基酯及其二琥珀酰亞氨基衍生物，包括N，N′-二琥珀酰亞氨基-(2-氨基-2-芐基)-乙酸酯、N，N′-二琥珀酰亞氨基-2-氨基-乙基-乙酸酯和乙二醇二[琥珀酰亞氨基琥珀酸酯]。
按照本發(fā)明的另一個方案，本發(fā)明的交聯(lián)顆粒與通過胃腸道粘膜主動吸收或結(jié)合至小腸上皮細胞的化合物(下文中稱為“靶化合物”)連接是可能的。例如，本發(fā)明的顆粒可與維生素B12或其類似物連接，其使它們可以與內(nèi)因子(IF)結(jié)合，使此復合物在小腸主動吸收。這些靶化合物的用途描述于WO87／02251、PCT／AU94／00273和PCTAU94／00274，將它們?nèi)恳胱鳛閰⒖肌?br> 本發(fā)明的顆粒也可通過病毒粘附素、菌絲、毒素結(jié)合亞單位、血凝集素、植物凝集素或細菌侵染素連接，它們大量存在于細菌和病毒表面，并能特異性與小腸上皮結(jié)合。于是，與這些試劑結(jié)合導致靶向小腸上皮(延遲運送藥物至小腸)，或其可導致誘發(fā)吸收和目標分子的胞轉(zhuǎn)，使藥物依附于小腸上皮細胞壁。
細菌粘附素的一些實例包括從不同鏈球菌種中分離的蛋白質(zhì)，如IgA結(jié)合蛋白(ARP2，ARP4，bac；Fischetti，ASM News，62，405-410(1996))、從B組鏈球菌分離出的IgA結(jié)合蛋白(Russell-Jones等，1984)；特別針對免疫球蛋白結(jié)合細胞(ibc)抗原的B組鏈球菌的蛋白質(zhì)抗原，Russell-Jones等，J．Exp．Med．，160，1476-1484(1984)；纖維蛋白原結(jié)合蛋白(Mrpe，Sfb，PrtF，fnbA，fnbB，F(xiàn)nBP，F(xiàn)nBp；Fischetti，1996，出處同上)，以及膠原結(jié)合因子(cna)和得自S．a(chǎn)ureus的凝集因子(clfA)。
看來與細菌和上皮表面粘附有關的其它結(jié)構為纖絲狀表面粘附素或菌毛。這些粘附素包括K88、K99(Mouricout等，Infect．Immun．，58，98-106(1990))，F(xiàn)41和987P菌毛發(fā)現(xiàn)于新生牛仔和豬仔中的E．coli，CFA1，而CFAⅡ菌毛發(fā)現(xiàn)于引起人腹瀉的E．coli菌株和銅綠假單胞菌PAK菌毛(Irvin等，Infect．Immun．，57，3720-3726(1989))Doig等，Infect．Immun．，58，124-130(1990))。還有從E．coli菌株中分離的“P”型菌毛，其與人腎盂腎炎有關(Isberg，Science，252，934-938(1991))。1型和2型菌毛分別發(fā)現(xiàn)于A．viscosis和A．naeslundii，它們也在粘附和這些細菌的隨后內(nèi)化中起重要作用(Fischetti，1996，出處同上)。同樣，淋病奈瑟氏球菌的表面上的36kDa蛋白質(zhì)參與這些生物與人上皮細胞上的表面乳糖基神經(jīng)酰胺的結(jié)合中，并可能對這些生物通過上皮細胞攝取起作用(Paruchuri等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87，333-337(1990))。
除菌毛外，很多細菌具有的表面結(jié)構顯示對這些細菌的侵入起作用，稱為細菌侵染素，其可以用于本發(fā)明。例如，內(nèi)化素(internalin)，一種由單核細胞增生利斯特氏菌的inlA基因編碼的表面蛋白，其對利斯特氏菌屬在小腸上皮細胞內(nèi)的內(nèi)化起作用(Cossart，“細胞生化雜志補編”B001，pp36(1994))Falkow，“細胞”，65，1099-1102(1991)；Mengaud等，“細胞”，84，923-932(1996))Lingnau等，“感染免疫”63；3896-3903(1995))；Drevet等，“感染免疫”，63；4268-4276(1995))。利斯特氏菌屬的內(nèi)化在內(nèi)化素與上皮細胞的E-鈣粘著蛋白結(jié)合后被激發(fā)(Falkow，1991，出處同上；Mengaud等，1996，出處同上)。與內(nèi)化素具有類似功能的蛋白發(fā)現(xiàn)于假結(jié)核耶爾森氏菌的表面；此蛋白質(zhì)，侵染素，是位于假結(jié)核耶爾森氏菌外膜中的986個氨基酸的蛋白質(zhì)(Falkow，1991，出處同上；Isberg，1985，出處同上)。由假結(jié)核耶爾森氏菌編碼的單個基因位點允許大腸埃希氏桿菌K-12培養(yǎng)的動物細胞的侵入。此蛋白質(zhì)在其它革蘭氏陰性細菌如E．coli K12表面的表達使這些細胞充分連接于上皮細胞，并被該細胞內(nèi)化(Falkow，1991，出處同上；Isberg等，1985，出處同上)。同樣，被內(nèi)化素包被的乳液顆粒被培養(yǎng)的哺乳動物細胞內(nèi)化(Isberg，1991)。得自假結(jié)核耶爾森氏菌的第二種蛋白，ail基因產(chǎn)物，對這些生物與很多真核細胞的結(jié)合起作用，但是只促進少數(shù)細胞的攝取(同前)。
適于與本發(fā)明顆粒連接的其它結(jié)構／蛋白，包括得自多種病毒的表面蛋白，稱為血凝集素，它們在病毒表面結(jié)合后接近小腸或呼吸上皮。這些特異性結(jié)合蛋白在輪狀病毒(VP7)、腺病毒、Norwalk病毒上存在(Fukuhara等，“病毒學雜志”，62，2209-2218(1998))；Yolken，in lennette(Ed．)Vol．6；273-291(1985))。同樣，在開始結(jié)合并攝入流感病毒后，表面血凝集素也已暗示了誘發(fā)酸誘導的病毒與膜融合(Wharton等，J．Biol．Chem．，263；4474-4480(1998))。
其它血凝集素分子存在于病毒如輪狀病毒的表面，其有助于這些病毒通過小腸上皮細胞的結(jié)合、內(nèi)化和胞轉(zhuǎn)(Keljo等，J．Ped．Gastroenterol．Nutrition，7，249-256(1998))。但是，有證據(jù)表明在一些病毒與細胞內(nèi)含物結(jié)合后，表面血凝集素可裂解產(chǎn)生融合蛋白，其通過直接的細胞膜透過依次使病毒進入細胞，而不是通過胞轉(zhuǎn)(Kaljot等，J．Virol，62，1136-1144(1998))；Fukuhara等，1998，出處同上)。這些分子可在向小腸上皮細胞靶輸送藥物中具有一些應用，但是可能不適于向循環(huán)系輸送藥物，藥物細胞內(nèi)含物可能不胞轉(zhuǎn)。
除了粘膜吸收和粘附素，如菌毛和病毒血凝集素的輸送，還發(fā)現(xiàn)能在多種毒素和植物凝集素的結(jié)合亞單位上共價連接分子，并引發(fā)連接分子口服后吸收。與本發(fā)明的引發(fā)受體介導的吸收最相關的毒素是由Abn亞單位結(jié)構組成的那些，其中A亞單位起毒性作用，而B亞單位起毒素的特定結(jié)合單元的功能。這些毒素包括霍亂毒素樣分子，如E．coli熱不穩(wěn)定毒素、霍亂毒素、彎曲桿菌屬jejuni熱不穩(wěn)定毒素、C．botulinum C2毒素、破傷風毒素、白喉毒素和假單胞菌外毒素A(Sears等，“微生物綜述”60，167-215(1996)；Waksman等，“生物化學生物物理學報”，604，249-296(1980))、病毒毒素(verotoxin)、志賀毒素(Okerman，Veterinary Microbiol．，14，33-46(1987))。所有這些毒素具有共同的性質(zhì)，即它們必須先結(jié)合至膜，并再通過膜以發(fā)揮其毒性活性。結(jié)合至上皮細胞并通過上皮細胞內(nèi)化是這些毒素的能力，這使這些分子作為其進入并通過上皮細胞的適宜的載體。
一些總結(jié)構AB的植物毒素也鑒定為具有結(jié)合細胞并內(nèi)化的潛力，并且是本發(fā)明目標的適宜分子。所有這些毒素口服有效，并具有結(jié)合腸細胞(enterocyte)并被該細胞內(nèi)化的能力。這些毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、槲寄生毒素、modeccin和volkensin，其結(jié)合D-半乳糖(Stripe等，F(xiàn)EBS，195，1-8(1986))?？山Y(jié)合至小腸上皮細胞并引起吸收的其它A-B毒素包括肉毒毒素(得自C．botulinum)(Blaustein等，F(xiàn)EBS，225，115-120(1987))。
重要的是，本發(fā)明還涉及在患者體內(nèi)控制藥物釋放的方法，其中給該患者使用含被本發(fā)明的交聯(lián)顆粒截留或包囊的藥劑的組合物。廣義地講，此方法可以用于治療、預防或診斷任何脊椎動物，但優(yōu)選該動物是哺乳動物。特別優(yōu)選的實驗動物為小鼠、豚鼠、兔，家畜，如貓和狗，農(nóng)場動物如馬、牛、綿羊、山羊、豬，捕獲的野生動物如獅子、虎、象或靈長類，如人、黑猩猩、狒狒和無尾猿。
當與本發(fā)明的交聯(lián)顆粒相結(jié)合形式給藥時，此藥劑的有效量依賴于多種因素。這些因素的本質(zhì)對本領域技術人員是顯而易見的。例如，相關因素包括相關脊椎動物的類型、年齡和性別，該動物患有或傾向于患有的疾病，該動物的高度和體重，以及所輸送藥劑的類型。該劑量還依賴于這些交聯(lián)顆粒是否連接有助于吸收的其它試劑，以及此顆粒的穩(wěn)定性和對截留或包囊的藥劑的控釋水平，其與劑量的性質(zhì)和程度有關。當本領域技術人員考慮了所有這些因素時，可以確定適當?shù)膭┝?。用于確定此藥劑的最佳或適當量的常規(guī)劑量方案是本領域技術人員熟知的。
本發(fā)明的組合物還可以與一種或多種藥用載體和／或賦形劑結(jié)合給藥。載體或賦形劑的性質(zhì)將依賴于以下因素，如給藥途徑、交聯(lián)顆粒的性質(zhì)及相關藥劑的性質(zhì)。對適當?shù)乃幬镙d體和賦形劑的全面討論見“藥物賦形劑手冊”，第二版，1994，Wade和Weller編輯，The，Pharmaceutical Press，London，將其全部引入作為參考。
如上所述，本發(fā)明的組合物可以通過經(jīng)腸或非腸道途徑給藥。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，通過口服給藥，但是，例如，通過直腸給藥，或胃，或小腸直接給藥也是可能的。此外，本發(fā)明的組合物可以肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、耳內(nèi)、陰道內(nèi)、局部給藥，直接進入器官或通過其它非腸道方式給藥。本領域技術人員可領會通過這些方式給藥要求此組合物以適當?shù)膭┝颗c載體和／或賦形劑一起提供，如“藥物賦形劑手冊”(同上)所述。
通過參考下列實施例將更容易總體上理解上述本發(fā)明，這些實施例只是舉例說明而不是要限制本發(fā)明。實施例1用明膠和羧甲基纖維素通過聚電解質(zhì)絡合反應合成含胰島素的毫微級顆粒將羧甲基纖維素(低粘度，50-200 cps)以5％的濃度溶解于蒸餾水(DW)中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將明膠(Bloom 175)以5％的濃度溶解于DW中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mM HCl中，并將其加入已加熱至60℃的4．0ml明膠中400μl。將此胰島素／明膠混合物緩慢加入到0．2ml羧甲基纖維素(5％)中，同時劇烈攪拌。攪拌繼續(xù)15分鐘，此時加入12ml DW。將己二酰肼(48mg，在DW中濃度為100mg／ml)加入此溶液，隨后加入48mg EDAC(100mg／ml)。將此溶液攪拌4小時以上，隨后用DW徹底透析。實施例2通過聚電解質(zhì)絡合反應制備含胰島素的明膠／聚谷氨酸毫微級顆粒將聚谷氨酸(17500 MW)以0．25％的濃度溶解于蒸餾水(DW)中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將明膠(Bloom 175)以1．0％的濃度溶解于DW中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mM HCl中并將其加入已加熱至60℃的4．0ml明膠中350μl。將此胰島素／明膠混合物緩慢加入到4．0ml羧甲基纖維素(0．25％)中，同時劇烈攪拌。攪拌繼續(xù)15分鐘，此時加入8ml DW。將己二酰肼(5mg，在DW中濃度為100mg／ml)加入此溶液，隨后加入5mg EDAC(100mg／ml)。將此溶液攪拌4小時以上，隨后用DW徹底透析。實施例3通過聚電解質(zhì)絡合反應制備含胰島素的明膠／藻酸鹽毫微顆粒將藻酸鈉(低粘度，250 cps)以1．25％的濃度溶解于蒸餾水(DW)中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將明膠(Bloom 175)以1．25％的濃度溶解于DW中，并用1M HC1將pH調(diào)節(jié)至3．9。將胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mM HCl中，并將其加入已加熱至60℃的5．0ml明膠中1ml。將此胰島素／明膠混合物緩慢加入到10．0ml藻酸鹽(1．25％)中，同時劇烈攪拌。攪拌繼續(xù)15分鐘，此時加入15ml DW。將己二酰肼(60mg，在DW中濃度為100mg／ml)加入此溶液，隨后加入60mg EDAC(100mg／ml)。將此溶液攪拌4小時以上，隨后用DW徹底透析。實施例4給鼠靜脈注射后從明膠／CMC聚電解質(zhì)復合毫微級顆粒中體內(nèi)釋放胰島素將雄性Wistar鼠置于固定架上，并從意識清醒的鼠尾靜脈采集血樣。然后，給鼠靜脈注射100μg胰島素或含100μg胰島素的明膠／CMC毫微級顆粒制劑的生理鹽水溶液。注射后在60、120、180、240和300分鐘從尾靜脈給鼠采血。并讓此血樣在4℃凝集，此后通過離心從血塊中分離出血清。用標準葡萄糖測試儀如Sigma出售的(#GAGO-20)檢測血糖水平。結(jié)果見圖1。實施例5通過改變EDAC和己二酰肼濃度改進胰島素從聚電解質(zhì)復合物(PEC)毫微級顆粒中的釋放通過改變用于交聯(lián)上述所有方法形成的PEC毫微級顆粒中EDAV和己二酰肼的濃度，改進胰島素從PEC毫微顆粒中的釋放速率。降低交聯(lián)劑的濃度使釋放速率升高；相反，增加交聯(lián)劑的濃度則降低釋放速率(見圖2)。實施例6制備酰肼基-聚谷氨酸將聚谷氨酸以25．8mg／ml的濃度溶解于DW中。以體積比2∶5將己二酰肼(87mg／ml在DW中)加入到聚谷氨酸中。向此溶液中加入固體EDAC(4mg／ml的聚谷氨酸)并反應2小時。將所得溶液用DW充分透析并凍干。實施例7制備酰肼基-羧甲基纖維素將羧甲基纖維素以25mg／ml的濃度溶解于DW中。以體積比2∶5將己二酰肼(87mg／ml在DW中)加入到聚谷氨酸中。向此溶液中加入固體EDAC(4mg／ml的羧甲基纖維素)并反應2小時。將所得溶液用DW充分透析并凍干。實施例8制備含胰島素的PEC毫微級顆粒，由己二酰肼基-聚谷氨酸和明膠形成將己二?；?酰肼基-聚谷氨酸以2．5mg／ml的濃度溶解于DW中，并用1M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。等胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mMHCl中，并將其加入到已加熱至60℃的明膠溶液(Bloom 175；10mg／ml在DW中，pH3．9)中。將此溶液加入到等體積的己二酰及-酰肼基-聚谷氨酸的溫熱(60℃)溶液中，同時快速攪拌。攪拌15分鐘后，將此溶液在DW中1∶3稀釋。將檸檬酸(100mg／ml)與等重量的NHS(100mg／ml在丙酮中)混合并通過與2倍重量過量的EDAC反應形成NHS酯?；罨?0分鐘后，將NHS2-檸檬酸酯加入到微粒中，其重量等于己二酰基-酰肼基-聚谷氨酸。將此反應持續(xù)過夜，之后用DW將此物質(zhì)充分透析。實施例9制備PEC毫微顆粒，其中含有胰島素并由酰肼基-羧甲基纖維素和明膠形成將己二?；?酰肼基-羧甲基纖維素以25mg／ml的濃度溶解于DW中，并用1．0M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mM HCl中，并加入到明膠溶液(Bloom 175；8mg／ml在DW中，pH 3．9)中，得到濃度為0．8mg／ml的胰島素明膠溶液。將此溶液加入到一半體積的己二酰基-酰肼基-羧甲基纖維素的溫和(60℃)溶液中，同時快速攪拌。攪拌15分鐘后，將此溶液在DW中1∶3稀釋。將檸檬酸(100mg／ml)與等重量的NHS(100mg／ml在丙酮中)混合，并通過與2倍重量過量的EDAC反應形成NHS酯?；罨?0分鐘后，將NHS2-檸檬酸酯加入到微粒中，其重量與己二?；?酰肼基-羧甲基纖維素相等。將此反應持續(xù)過夜，之后用DW將此物質(zhì)充分透析。實施例102-氨基乙基-2-氨基乙酸(AEAE)的制備(a)Boc-甘氨酸與Boc-乙醇胺偶聯(lián) 將Boc-甘氨酸(12．0g，0．068mol)和羰基二咪唑(12．1g，0．074mol)溶解于DMF(50ml)中，急劇放出二氧化碳，并將此溶液室溫下攪拌1小時。將Boc-乙醇胺(10．0g，0．062mol)的DMF(10ml)溶液滴加至活性酯溶液中，隨后加入DIEA(11．9ml，8．80g，0．068mol)并室溫下繼續(xù)攪拌過夜。將此溶液倒入水(200ml)中，并用乙醚(3×75ml)萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液(1×100ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)并除去溶劑，得到產(chǎn)物(18．1g，92％)，為無色油狀物，不經(jīng)進一步純化直接使用。
(b)除去Boc保護基并琥珀酰基化在0℃將粗品二-Boc酯(22．9g，0．072mol)溶解于三氟乙酸(20ml)中，此時急劇放出二氧化碳，并將此溶液在0℃攪拌1小時。減壓除去三氟乙酸，并將此殘余物溶解于乙腈(30ml)并再次除去溶劑。將此粗品雙-TFA鹽溶解于THF(20ml)，并加入固體無水碳酸鉀(20g)，并將此混合物在室溫下攪拌1小時。將此溶液干燥(硫酸鈉)并將此溶液濾進琥珀酸酐(22．7g，0．23mol)的THF(120ml)溶液中。加入DIEA(30ml，22．3g，0．17mol)得到堿性溶液，并在室溫下繼續(xù)攪拌。在1小時的間隔內(nèi)，加入兩個等分的DIEA(5ml，3．70g，0．029mol)并繼續(xù)攪拌24小時。減壓除去大部分THF并將此懸浮液倒入兩相的飽和碳酸氫鈉水溶液(200ml)和乙酸乙酯(100ml)中。除去有機層，并用乙酸乙酯(100ml)再次萃取，用鹽酸(10M)將水層酸化到pH=1，并用乙酸乙酯(3×150ml)萃取，干燥(硫酸鈉)并除去溶劑。將此殘余物懸浮于乙醚(50ml)中，冷卻至0℃并過濾得到產(chǎn)物(6．01g，25％)，為細小針狀物。
(c)二酰肼基酯交聯(lián)劑的制備 向上述二酸(987mg，3．10mmol)的DMF(20ml)溶液中，加入PyBOP(3．72g，7．15mmol)和酰肼基甲酸叔丁基酯(950mg，7．19mmol)，隨后加入DIEA(2．20ml，1．65g，0．013mol)，并在室溫下繼續(xù)攪拌過夜。將此溶液倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(100ml)中，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取，干燥(硫酸鎂)并除去溶劑得到油狀物，將其溶解于TFA(10ml)中并室溫下攪拌1小時。加入乙醇(20ml)，并減壓除去溶劑得到二酰肼，為黃色油狀物(506mg，47％)。實施例112-氨基乙基-2-氨基-2-芐基乙酸(AEABE)的制備(a)Boc-苯丙氨酸與Boc-乙醇胺偶聯(lián) 將Boc-苯丙氨酸(15．7g，0．059mol)和羰基二咪唑(10．1g，0．062mol)溶解于DMF(60ml)中，急劇放出二氧化碳，并將此溶液室溫下攪拌1小時。將Boc-乙醇胺(9．35g，0．058mol)的DMF(10ml)溶液滴加至活性酯溶液中，隨后加入DIEA(12．0ml，8．9g，0．069mol)并室溫下繼續(xù)攪拌過夜。將此溶液倒入水(200ml)中并用乙醚(3×75ml)萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液(1×100ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)并除去溶劑得到產(chǎn)物(18．13g，92％)，為無色油狀物，最終固化，并不經(jīng)進一步純化直接使用。
(b)除去Boc保護基并琥珀?；?在0℃將粗品二-Boc酯(9．83g，0．024mol)溶解于三氟乙酸(20ml)中，此時急劇放出二氧化碳，并將此溶液在0℃攪拌1小時。減壓除去三氟乙酸，并將此殘余物溶解于乙腈(30ml)并再次除去溶劑。將此粗品雙-TFA鹽溶解于THF(20ml)，并加入固體無水碳酸鉀(20g)，并將此混合物在室溫下攪拌1小時。將此溶液干燥(硫酸鈉)，并將其濾進琥珀酸酐(4．98g，0．050mol)的THF(30ml)溶液中。加入DIEA(20ml，14．8g，0．11mol)得到堿性溶液，并在室溫下繼續(xù)攪拌24小時。減壓除去大部分THF，并將此懸浮液倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(200ml)和乙酸乙酯(100ml)兩相液中。除去有機層，并用乙酸乙酯(100ml)再次萃取，用鹽酸(10M)將水層酸化為pH=1，并用乙酸乙酯(3×150ml)萃取，干燥(硫酸鈉)并除去溶劑。將此殘余物用乙酸乙酯／己烷重結(jié)晶得到產(chǎn)物(2．04g，22％)，為無色粉末。實施例12用異丁基氰基丙烯酸酯(IBCA)和羧甲基纖維素合成含胰島素的毫微級顆粒將胰島素以100mg／ml的濃度溶解于0．1M HCl。將一份胰島素(120μl)與等體積的Miglyol混合。將此溶液快速旋渦攪動，加入12ml乙醇并將此溶液再次旋渦攪動。最后，加入120μl IBCA，并將此溶液緩慢滴入24ml 0．25％PE6800中。15分鐘后，向此溶液中加入6ml 0．25％ CMC，將其進一步攪拌90分鐘。然后，將此溶液分為兩個相等的體積份，并將24mg己二酰肼(AH)和48mg EDAC加入到其中一份溶液中。在給鼠實驗前此顆粒交聯(lián)過夜。在圖3中看出，向毫微級顆粒中加入EDAC和AH大大降低了胰島素的釋放速率，這是通過血糖的改變判斷的。實施例13制備含有與脂酶可裂解的AEABE交聯(lián)的胰島素聚電解質(zhì)毫微級顆粒將己二?；?酰肼基-羧甲基纖維素以2．5mg／ml的濃度溶解于DW中，并用1．0M HCl將pH調(diào)節(jié)至3．9。將胰島素以20mg／ml的濃度溶解于20mM HCl中，并將其8mg加入到2ml濃度為2．5mg／ml的明膠溶液(pH3．9)中。將此溶液加入到16ml己二酰及-酰肼基-羧甲基纖維素的溫和(60℃)溶液中，同時快速攪拌。攪拌15分鐘后，將此溶液分為4個等份。將AEABE(40mg，100mg／ml)與30mg NHS(100mg／ml在DMF中)混合，并通過與60mg的EDAC反應形成NHS酯?；罨?0分鐘后，將20、10和5mg的(NHS)2-AEABE加入到毫微級顆粒中。將此反應持續(xù)過夜，然后給鼠靜脈給藥后檢測。如圖4所示，加入高量脂酶可裂解的交聯(lián)劑，導致胰島素體內(nèi)釋放降低。實施例14口服含有與脂酶可裂解的AEABE交聯(lián)的胰島素IBCA毫微級顆粒將胰島素以100mg／ml的濃度溶解于0．1M HCl中。將胰島素等分樣(120μl)與等體積的Miglyol混合。將此溶液快速旋渦攪動，加入12ml乙醇并將此溶液再次旋渦攪動。最后，加入120μl IBCA并將此溶液緩慢滴入24ml 0．25％PE6800中。15分鐘后，向此溶液中加入6ml 0．25％己二?；?酰肼基-CMC，將其攪拌過夜。將此顆粒濃縮至22ml。將AEABE(60mg，100mg／ml)與60mg NHS(100mg／ml在DMF中)混合，并通過與60mg的DCC(二環(huán)己基碳二亞胺，在DMF中103mg／ml)反應形成NHS酯?；罨?0分鐘后，將5和40mg的NHS2-AEABE等分樣加入到11ml的毫微級顆粒中。將此反應持續(xù)過夜。然后用DW充分透析此顆粒除去游離的AEABE。再將每個樣本一分為二。將己二酰肼-eVB12(20mg)加20mg EDAC加入到一個樣本中，同時將TSTU-活化的-eVB12(20mg)加入到另一個樣本中，并反應2小時。然后將這些樣本用蒸餾水透析，并給鼠口服后進行實驗。如圖5所示，在口服給藥5小時的時間內(nèi)，實驗顆粒制劑使血糖降低。
在本文中，除非上下文另外需要定義，應理解術語“含有”或該動詞變化形式指包括所述基元或整體，或者一組基元或整體，但是不包括任何其它基元或整體，或者一組基元或整體。
權利要求
1．含有至少一種能形成顆粒的聚合物的交聯(lián)顆粒，其中所述聚合物含有ⅰ)選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團，所述基團共價連接于ⅱ)含有至少兩個選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團的間隔物上。
2．權利要求1所述的交聯(lián)顆粒，其中間隔物為下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。
3．權利要求2所述的交聯(lián)顆粒，其中間隔物選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼、谷氨酸二酰肼、天門冬氨酸二酰肼、蘋果酸二酰肼、酒石酸二酰肼、對苯二甲酸二酰肼、間苯二甲酸二酰肼及鄰苯二甲酸二酰肼。
4．權利要求1所述的交聯(lián)顆粒，其中所述間隔物選自丙二酸、馬來酸、蘋果酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物，其中所述烷基衍生物的烷基最多含10個碳原子。
5．權利要求1所述的交聯(lián)顆粒，其中所述間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。
6．權利要求1所述的交聯(lián)顆粒，其中所述間隔物含有至少一個生物可降解的鍵。
7．權利要求1所述的交聯(lián)顆粒，其中所述顆粒與靶向化合物共價結(jié)合。
8．含有截留于交聯(lián)顆粒中的藥劑的組合物，其中該交聯(lián)顆粒含有至少一種能形成顆粒的聚合物，所述聚合物含有ⅰ)選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團，所述基團共價連接于ⅱ)含有至少兩個選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團的間隔物上。
9．權利要求8所述的組合物，其中間隔物為下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。
10．權利要求9所述的組合物，其中間隔物選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼。
11．權利要求8所述的組合物，其中所述間隔物選自丙二酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物，其中所述烷基衍生物的烷基最多含10個碳原子。
12．權利要求8所述的組合物，其中所述間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。
13．權利要求8所述的組合物，其中所述間隔物含有至少一個生物可降解的鍵。
14．權利要求8所述的組合物，其中所述生物可降解的鍵是酯鍵。
15．權利要求8的組合物，其中所述間隔物是氨基酸的2-氨基乙基酯。
16．權利要求15的組合物，其中所述間隔物選自甘氨酸和苯丙氨酸的2-氨基乙基酯，及甘氨酸和苯丙氨酸的2-氨基乙基酯的二琥珀酰亞氨基衍生物。
17．權利要求16的組合物，其中所述甘氨酸和苯丙氨酸的2-氨基乙基酯的二琥珀酰亞氨基衍生物選自N，N′-二琥珀酰亞氨基-(2-氨基-2-芐基-乙酸酯)、N，N′-二琥珀酰亞氨基-2-氨基-乙基-乙酸酯和乙二醇雙[琥珀酰亞氨基琥珀酸酯]。
18．權利要求8的組合物，其中所述藥劑選自肽和蛋白質(zhì)藥物、DNA、RNA、抗體、疫苗、造影劑、激素、多糖、抗生素、抗凝劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞毒試劑、甾類、消充血劑、麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑。
19．權利要求18的組合物，其中所述藥劑選自降鈣素、促紅細胞生成素、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、LHRH類似物、生長激素釋放抑制因子、胰島素、干擾素和纖溶酶原激活物抑制劑。
20．權利要求8的組合物，其中所述交聯(lián)顆粒與靶向化合物共價連接。
21．制備交聯(lián)顆粒的方法，包括將至少一種能形成顆粒的聚合物與間隔物反應，其中聚合物和間隔物各含有至少兩個反應性基團，其選自羧基、酰肼基、氨基和巰基；且所述交聯(lián)是用碳二亞胺作為交聯(lián)劑實現(xiàn)的。
22．權利要求21所述的方法，其中間隔物為下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。
23．權利要求22所述的方法，其中間隔物選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼。
24．權利要求22所述的方法，其中所述間隔物選自丙二酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物。
25．權利要求22所述的方法，其中所述間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。
26．權利要求22的方法，其中所述碳二亞胺選自N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(稱為EDC或EDAC)、N，N′-二環(huán)己基-碳二亞胺(DCC)、N′-二異丙基-碳二亞胺、N′，N′-二叔丁基碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1，3-二-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(β-二乙基氨基乙基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺和1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺。
27．權利要求22所述的方法，其中所述間隔物含有至少一個生物可降解的鍵。
28．權利要求22的方法，其中所述交聯(lián)顆粒與靶向化合物共價連接。
29．制備含截留在交聯(lián)顆粒中的藥劑的組合物的方法，其中所述交聯(lián)顆粒含有至少一種能形成顆粒的聚合物，所述聚合物含有ⅰ)選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團，所述基團共價連接于ⅱ)含有至少兩個選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團的間隔物上，并且其中通過至少一種聚合物與間隔物在所述藥劑的存在下反應，而形成所述顆粒。
30．權利要求29所述的方法，其中間隔物為下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。
31．權利要求30所述的方法，其中間隔物選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼。
32．權利要求30所述的方法，其中所述間隔物選自丙二酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物，其中所述支鏈烷基鏈的烷基最多含10個碳原子。
33．權利要求30所述的方法，其中所述間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。
34．權利要求30的方法，其中所述聚合物與所述間隔物之間的反應由碳二亞胺催化進行，其中碳二亞胺選自N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺、N，N′二環(huán)己基-碳二亞胺、N′-二異丙基-碳二亞胺、N′，N′-二叔丁基碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1，3-二-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(β-二乙基氨基乙基)碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺和1-環(huán)己基-3-(4-二乙基氨基環(huán)己基)碳二亞胺。
35．權利要求30所述的方法，其中所述間隔物含有至少一個生物可降解的鍵。
36．權利要求30的方法，其中所述藥劑選自肽和蛋白質(zhì)藥物、DNA、RNA、抗體、疫苗、造影劑、激素、多糖、抗生素、抗凝劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞毒試劑、甾類、消充血劑、麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑。
37．權利要求30的方法，其中所述藥劑選自降鈣素、促紅細胞生成素、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、LHRH類似物、生長激素釋放抑制因子、胰島素、干擾素和纖溶酶原激活物抑制劑。
38．權利要求30的方法，其中所述交聯(lián)顆粒與靶向化合物共價連接。
39．在患者體內(nèi)達到藥劑控釋的方法，包括給所述患者使用有效量的特定組合物，該組合物中含有截留在交聯(lián)顆粒中的藥劑，其中所述交聯(lián)顆粒含有至少一種能形成顆粒的聚合物，且所述聚合物含有ⅰ)選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團，所述基團共價連接于ⅱ)含有至少兩個選自羧基、酰肼基、氨基和巰基的反應性基團的間隔物上。
40．權利要求39所述的方法，其中間隔物為下式NH2NHCO-R-CONHNH2，其中-R-是價鍵，或R是直鏈、支鏈或環(huán)烷基、烯基、炔基或芳基，且其中烷基、烯基或炔基最多含10個碳原子。
41．權利要求40所述的方法，其中間隔物選自肼、草酸二酰肼、丙二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼、戊二酸二酰肼、己二酸二酰肼、馬來酸二酰肼、富馬酸二酰肼或丁二烯酸二酰肼。
42．權利要求40所述的方法，其中所述間隔物選自丙二酸、馬來酸、檸檬酸、谷氨酸、天門冬氨酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸、二甲基戊二酸、草酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸及其支鏈烷基衍生物。
43．權利要求40所述的方法，其中所述間隔物含有至少一個反應性羧基和至少一個反應性酰肼基。
44．權利要求40的方法，其中所述間隔物含有至少一個生物可降解的鍵。
45．權利要求40的方法，其中所述藥劑選自肽和蛋白質(zhì)藥物、DNA、RNA、抗體、疫苗、造影劑、激素、多糖、抗生素、抗凝劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞毒試劑、甾類、消充血劑、麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑。
46．權利要求45的方法，其中所述藥劑選自降鈣素、促紅細胞生成素、血小板生成素、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、LHRH類似物、生長激素釋放抑制因子、胰島素、干擾素和纖溶酶原激活物抑制劑。
47．權利要求40的方法，其中所述交聯(lián)顆粒與靶向化合物共價連接。
全文摘要
提供了用于輸送藥劑的交聯(lián)顆粒。這些顆粒含有至少一種聚合物和間隔物化合物,其中聚合物和間隔物化合物各自含有反應性羧基、酰肼基、氨基和/或巰基。這些顆粒通過分別存在于聚合物和間隔物上的反應性基團共價連接。公開了含有截留在這些顆粒中的藥劑組合物。還提供了制備截留藥劑的所述顆粒的方法,及使用這些顆粒對患者體內(nèi)的藥劑進行控釋的方法。
文檔編號C08B15/10GK1290283SQ98810583
公開日2001年4月4日 申請日期1998年8月28日 優(yōu)先權日1997年8月29日
發(fā)明者G·J·魯塞爾－瓊斯, S·M·斯塔林, J·F·麥埃萬 申請人:澳洲生物科技公司