專利名稱:抗菌素a42125及其生產(chǎn)方法
本發(fā)明涉及新的抗菌素A42125和產(chǎn)生這種抗菌素的新菌株產(chǎn)氣群諾卡氏菌(Nocardia aerocolonigenes)NRRL。18049。A42125是一種對(duì)產(chǎn)生甲烷的微生物具有特殊意義的抗菌活性的抗菌劑。由于在模擬瘤胃條件的實(shí)驗(yàn)中，A42125使甲烷的產(chǎn)量減至最低程度，所以A42125可以提高飼料效率，同時(shí)又促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長。
本發(fā)明的另一個(gè)方面就是深層有氧發(fā)酵條件下培養(yǎng)新菌株產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049直至基本上產(chǎn)生抗菌素，以生產(chǎn)A42125的方法。A42125是通過將其吸附在樹脂上并用極性有機(jī)溶劑洗脫，從發(fā)酵肉湯中提取得到的。采用公認(rèn)技術(shù)，如離子交換色譜法，對(duì)A42125進(jìn)行分離和進(jìn)一步純化。
因?yàn)楫a(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049是最新發(fā)現(xiàn)的菌株，所以本發(fā)明進(jìn)一步涉及該種微生物的生物純化培養(yǎng)。
附圖表示A42125在KBr中的紅外吸收光譜。
在獸醫(yī)領(lǐng)域里仍有需要繼續(xù)改進(jìn)抗菌素。促進(jìn)動(dòng)物生長是這些抗菌素的一個(gè)目的，促進(jìn)生長可以通過減少疾病和提高飼料的利用效率來實(shí)現(xiàn)。促進(jìn)諸如牛、羊這一類的反芻動(dòng)物的生長在商業(yè)上有著特殊的興趣。
在反芻動(dòng)物的瘤胃中，微生物使碳水化合物降解以產(chǎn)生能夠進(jìn)行代謝的化合物，例如丙酸鹽。但是，有些微生物對(duì)該系統(tǒng)的效率具有不利的影響。例如，甲烷微生物或產(chǎn)生甲烷的微生物可以降低反芻動(dòng)物對(duì)飼料的利用效率。A42125的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)就是抑制產(chǎn)生甲烷的微生物，從而能夠用以促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長。
盡管產(chǎn)生甲烷的微生物(原始細(xì)菌)在反芻動(dòng)物的消化系統(tǒng)中是不需要的，但是他們對(duì)世界的環(huán)境而言卻有重要的貢獻(xiàn)，因?yàn)樗麄冊诎褟U的生物物質(zhì)分解為甲烷的最終階段中起著催化作用。此外，甲烷可以用作燃料，借此有助于解決能源問題。因此甲烷微生物和增產(chǎn)甲烷的方法是重要的。
增加甲烷生產(chǎn)的一種途徑是發(fā)展甲烷微生物中的遺傳交換系統(tǒng)，為了完成此項(xiàng)研究，可選擇的特征如選擇有抗菌素抗性的特征是重要的。這些特征通常是通過對(duì)能正常殺死微生物的抗菌素具有抗性的突變體的選擇而發(fā)現(xiàn)的?？上Ъ淄槲⑸飳?duì)大多數(shù)抗菌素具有天然的抗性。因此，A42125抑制甲烷微生物的這一事實(shí)可用于找出一種可選擇的特征以利于在甲烷微生物中的遺傳交換。
A42125的特征抗菌素A42125具有下述生理化學(xué)特征狀態(tài)白色結(jié)晶(由水中結(jié)晶)熔點(diǎn)149-150℃紫外光不吸收紅外光(Kbr)見附圖;
吸收頻率(厘米-1)寬峰，包括3423，3413，3409，3403，3398和3386;2937，1720，1602，1453，1408，1379，1290，1192，1120，1090，1064，971，830和802。
滴定(80%二甲基甲酰胺水溶液)pKa5.2，8.7和10.5。
分子量2023(場致解吸質(zhì)譜分析)實(shí)驗(yàn)式C101H184N2O38元素分析
元素 實(shí)測值%碳 59.51氫 9.05氮 1.44氧 30.08氨基酸未找到溶解度溶于水生物自顯影測定華特曼一號(hào)濾紙用0.95N Na2SO4和0.05N NaHSO4.H2O浸漬，一個(gè)含有1.5%NaCl的80%乙醇水溶液的溶劑系統(tǒng)，用藤黃細(xì)球菌(Micrococcus luteus)檢測，A42125的Rf值約為0.46。
根據(jù)其滴定特征，似乎A42125可以具有生成鹽類的羧基、胺類官能團(tuán)和酚基。
這類鹽可用于分離、純化和釋放出抗菌素，因此，42125鹽類是本發(fā)明的一部分?？勺魉幬镉玫柠}類尤其有用，例如可用的鹽類有堿金屬，堿土金屬胺和酸加成鹽。
具有代表性的可用堿金屬和堿土金屬鹽包括;鈉、鉀、鋰、銫、銣、鋇、鈣和鎂鹽。可用的胺鹽包括銨及伯、仲和叔C1-C4烷基銨以及羥基-C2-C4烷基銨鹽。所述的胺鹽包括由A42125與氫氧化銨、甲胺、仲丁胺、異丙胺、二乙胺、二異丙胺、乙醇胺、三乙胺、3-氨基-1-丙醇等反應(yīng)生成的那些鹽。
有代表性的酸加成鹽包括由與有機(jī)酸和無機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)生成的那些鹽，有機(jī)酸和無機(jī)酸例如有硫酸、鹽酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、雙羥萘酸、粘酸、D-谷氨酸、d-樟腦酸、戊二酸、羥基乙酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等。
在獸用藥物方面，用抗菌素治療動(dòng)物時(shí)，抗菌素的形式通常并無重要意義。在大多數(shù)情況下，動(dòng)物體內(nèi)的條件使藥物轉(zhuǎn)換成不同于用藥時(shí)的形式。因此可以使用的鹽的形式的重要性并不很大，然而選用鹽的形式是出于經(jīng)濟(jì)、設(shè)備和毒性的考慮。
生產(chǎn)抗菌素A42125是通過在深層有氧條件下，在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生A42125的產(chǎn)氣群諾卡氏菌株至基本產(chǎn)生抗菌活性。A42125可以通過已知的方法采用分離和純化方法回收。
用于制備抗菌素A42125的新的產(chǎn)氧群諾卡氏菌株是從巴西土壤采樣中分離得到的。為了便于描述產(chǎn)氧群諾卡氏菌株，將該菌株稱為A42125培養(yǎng)菌。
利利研究室的Frederick P.Mertz對(duì)該菌株進(jìn)行了分類學(xué)研究。根據(jù)這些研究，該菌株在1970年P(guān)ridham和Lyons(T.G.Pridham，“布坎南放線菌目中的新名稱和新的組合，1917年”，美國農(nóng)業(yè)部技術(shù)公報(bào)第142432期，哥倫比亞特區(qū)，華盛頓，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處，1970年)的分類中是一個(gè)產(chǎn)氣群諾卡氏菌的新菌株(Shinobu和Kawato)。這個(gè)分類是以同時(shí)做出的實(shí)驗(yàn)室相比較以及對(duì)相似菌種的公開描述的分析為基礎(chǔ)的[M.Googfellow和K.P.Schaal，“諾卡氏菌屬、放線菌分支菌屬(actionmadura)和紅球菌屬的鑒定方法”，(F.A.Skinner和D.W.Lovelock編輯，“供微生物學(xué)家用的鑒定方法”，第二版，第261頁，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)叢書第14期，學(xué)術(shù)出版公司，紐約，1979年);R.E.Gordon，S.K.Mishra和D.A.Barnett，“諾卡氏菌屬的若干菌株，N.carnea，N.vaccinii，非洲諾卡氏菌，東方諾卡氏菌和產(chǎn)氣群諾卡氏菌”(“普通微生物學(xué)雜志”，109卷，69-78頁，1978年);S.J.Mishra R.E.Gordon和D.A.Barnett”，“諾卡氏菌屬和鏈霉菌屬醫(yī)學(xué)意義上的鑒定”(“臨床微生物學(xué)雜志”，第11卷，第6期，第728-736頁1980年);H.Mordarska和M.Mordarski，”“若干諾卡氏菌的化學(xué)分類特征和分類”(“普通微生物雜志”，第71卷，第77-86頁，1972年);R.C.Pittenger和R.B.Brigham，“東方鏈霉菌(新種)-產(chǎn)生萬古霉素的菌種”(“抗菌素和化學(xué)治療，第6卷，第11期，第642-647頁，1956年);S.A.Waksman，”放線菌，第2卷”(巴爾的摩，威廉和威爾金公司，1961年)。
應(yīng)用的方法繼國際鏈霉菌屬研究機(jī)構(gòu)(ISP)建議的鑒定鏈霉菌菌種特征的方法[E.B.Shirling和D.Gottlieb，“鑒定鏈霉菌菌種特征的方法”，Int.J.Syst.BACTERIOL.16(3)，313-340(1966)]某些補(bǔ)充試驗(yàn)(D.J Blazevic和G.M.Ederer”，診斷微生物學(xué)中生物化學(xué)試驗(yàn)的原理”，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1975)，已被采用。
由Gordon等建議的諾卡氏菌種特性鑒定的方法，[R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan和C.H.Pang，“產(chǎn)腔諾卡氏菌、自營諾卡氏菌(N.Autotrophica)和諾卡氏菌株”，Int.J.Syst.Bacteriol.24(1)，54-63(1974)]已被采納。
采用Gordon和Barnett[R.E.Gordon and D.A.Barnett，“若干分支干菌屬和諾卡氏菌屬的菌種的利福平和溶菌霉抗性作為分類的工具”Int.J.Syst.Bacteriol 27(3)，176-178(1977)建議的方法測定利福平和溶菌霉抗性。
ICSS-NBS質(zhì)心色圖、標(biāo)準(zhǔn)樣品2106(國家標(biāo)準(zhǔn)局，1958年，哥倫比亞特區(qū) 華盛頓 美國商業(yè)部)和色調(diào)手冊(第四版，伊利諾斯洲芝加哥，美國集裝箱公司彩色標(biāo)準(zhǔn)部，1958年)都被用于確定色名。
形態(tài)學(xué)研究用的是光學(xué)顯微鏡，掃描電子顯微鏡(SEM)用于研究孢子表面的形狀。
測定類黑素的產(chǎn)生(產(chǎn)色率)是用ISP1號(hào)(胰胨-酵母提取液肉湯)、ISP6號(hào)(蛋白胨-酵母提取液鐵瓊脂)、ISP7號(hào)(酪氨酸瓊脂)和改進(jìn)ISP7號(hào)(去除酪氨酸)。
二氨基庚二酸(DAP)的異構(gòu)體和全細(xì)胞水解產(chǎn)物中的碳水化合物都用Becker等和Lechevalier的色譜法測定(B.Becker，M.P.Lechevalier.R.E.Gordon和H.A.Lechevalier，“用全細(xì)胞水解產(chǎn)物紙色譜法快速區(qū)分諾卡氏菌屬和放線菌屬之間的差異”應(yīng)用微生物學(xué)(Appl.Microbiol.)12，421-423(1964)]和[M.P.Lechevalier，“臨床意義的需氧放線菌的鑒定”，J.LAB.clin.Med.71，934-944(1968)]。
霉菌酸的測定采用的Minnikin所介紹的技術(shù)為基礎(chǔ)的方法[D.E.Minnikini，I.G.Hutchinson and A.B.Caldicott，“含霉菌酸細(xì)菌甲醇分解產(chǎn)物的薄層色譜”，色譜分析雜志(J.Chromatography)，188，221-233(1980)]。
測定淀粉水解用碘在ISP4號(hào)(無機(jī)鹽淀粉瓊脂)板上(參閱上文，Blazevic and Ederer，)檢查有無淀粉存在。
NaCl耐量的測定將NaCl加到ISP2號(hào)瓊脂，使之與所需濃度相等，在30℃將瓊脂板保溫14天后進(jìn)行測定。
對(duì)抗菌素抗性的測定將抗菌素敏感盤置于接種過的ISP2號(hào)瓊脂板上進(jìn)行測定。
磷酸酶和脲酶用上文中Blazevic和Ederer所介紹的方法測定，明膠的液化用于測定蛋白酶活性。
培養(yǎng)特征A42125在復(fù)合和限定瓊脂培養(yǎng)基上一般都生長良好。除了在酵母-葡萄糖瓊脂之外，都能產(chǎn)生需氧菌絲體。孢子質(zhì)量的顏色為灰白相色。Tresner和Bachus系統(tǒng)中的最近配色表為d淡灰色和b牡蠣白色。背面為淡黃棕色趨向淡黃白色。在ISP2號(hào)和酵母-葡萄糖瓊脂中產(chǎn)生淡棕色可溶色素。表1歸納給出了這些培養(yǎng)特征。
表1 A42125、產(chǎn)氣諾卡氏菌屬和東方諾卡氏菌屬的培養(yǎng)特征東方諾卡氏 產(chǎn)氣諾卡氏培養(yǎng)基 特征＊ A42125 菌屬 菌屬G 大量 大量 大量R 78.d.yBr 68.s.OY 72.d.OYISP2 Am 大量5fe 大量2ba 無(表面多1.gy.rBn 線黃色 皺)Sp 淡棕色 無 無G 良好 良好 較差R 89.pY 89.pY 89.p.YISP3 Am 較差b 良好b 無牡蠣白色 牡蠣白色Sp 無 無 無G 良好 大量 良好R 77.myBr 72.d.OY 90.gy.YISP4 Am 良好d 大量d 無淡灰色 淡灰色Sp 無 無 無G 大量 大量 大量R 77.m.yBr 67.brill.OY 88.dYISP5 Am 大量b 大量2ba 無(表面多牡蠣白色 淺黃色 皺)Sp 無 無 無表Ⅰ(續(xù))東方諾卡氏 產(chǎn)氣諾卡氏培養(yǎng)基 特征＊ A42125 菌屬 菌屬G 良好 大量 良好R 77.m.yBr 67.brill.OY 88.d.Y蘋果酸鈣Am 良好b 大量2ba 無牡蠣白色 線黃色Sp 無 無G 良好 良好 大量R 77.myBr 89.pY 75.deep yBrCzapek溶液瓊脂Am 良好d 良好b 無(表面多淡灰色 牡蠣白色 皺)Sp 極淡棕色 無 淡黃棕色G 良好 大量 良好R 89.p.Y 67.brill.OY 88.d.Y葡萄糖-天冬酰胺Am 差d 大量2ba 無淡灰色 淺黃色Sp 無 無 無表Ⅰ(續(xù))東方諾卡氏 產(chǎn)氣諾卡氏培養(yǎng)基 特征＊ A42125 菌屬 菌屬G 良好 較差 差R 92.黃白色 93.黃灰色 92.黃白色自來水瓊脂Am 較差b 差b 無牡蠣白色 牡蠣白色Sp 無 無 無G 大量 大量 大量R 78.d黃棕色 68.s.OY 72.d乳黃色酵母-葡萄糖瓊脂Am 無(表面多 大量2ba 無(表面多皺) 淺黃色 皺)Sp 淡棕色 無 無＊G生長R背面Am需氧菌絲體Sp可溶色素形態(tài)特征培養(yǎng)物A42125產(chǎn)生一種的底物，需氧菌絲體生長得不太好，用光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，需氧菌絲體具有網(wǎng)狀外形，這種形態(tài)在《貝氏手冊》(R.E.Buchanan，and N.E.Gibbons編輯《貝氏測量微生物學(xué)手冊》“Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology”，第8版，威廉和威爾金公司，巴的摩爾，1974年)中被描述分類為無鏈霉菌。
用掃描電子顯微鏡檢查ISP4號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中的需氧菌絲體時(shí)，觀察到分生孢子。
孢子很少且形狀不規(guī)則，孢子表面形狀光滑[T.G.Pridham，C.W.Hesseltine，and R.C.Benedict，《根據(jù)選擇群鏈霉菌的分類指南》，應(yīng)用微生物學(xué)第6卷，第52-79頁，1957年]。
孢子形狀由橢圓形趨向圓柱形，形成的鏈數(shù)目在50以上，孢子大小為1.2-0.9×0.5-0.4微米，平均為1.1×0.5微米。
在深層振蕩條件下生長時(shí)，菌絲體分離成片段。
生理特征培養(yǎng)菌A42125分解酪蛋白、彈性蛋白、鳥嘌呤、次黃嘌呤、酪氨酸;水解蘋果酸鈣、DNA、七葉苷和淀粉;由阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、α-甲基-D-糖苷、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、蜜三糖、鼠李糖、海藻糖、木糖所生成的酸;能利用乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、丙酸鹽、丙酮酸鹽、琥珀酸鹽和酒石酸鹽。
培養(yǎng)菌A42125產(chǎn)生過氧化氫酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和類黑素;對(duì)利福平?jīng)]有抗性，但對(duì)溶菌酶、噻孢霉素、慶大霉素、林可霉素、青霉素和妥布霉素有抗藥性。
培養(yǎng)物A42125的NaCl耐量高至6%，在15-37℃溫度條件下生長，在50℃時(shí)經(jīng)受不住8小時(shí)，水解脫脂乳或?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽。這些生理特性列于表Ⅱ和表Ⅲ。
表Ⅱ A42125和有關(guān)諾卡氏菌株的若干形態(tài)和生理特性＊特性 A42125 產(chǎn)氣 東方 巴西群諾卡氏菌 諾卡氏菌 諾卡氏菌需氧菌絲體 + - + -分生孢子 + - + -耐酸性 - - - -細(xì)胞壁中的霉菌酸 - - - +尿素酶 + + + +分解腺嘌呤 - - - -酪蛋白 + + + +彈性蛋白 + - - +次黃嘌呤 + + + +酪氨酸 + + + +黃嘌呤 - - - -抗藥性對(duì)于溶菌酶 + + - +對(duì)于利福平 - - + +
表Ⅱ(續(xù))特性 A42125 產(chǎn)氣 東方 巴西群諾卡氏菌 諾卡氏菌 諾卡氏菌水解蘋果酸鈣 + + + 未發(fā)現(xiàn)七葉苷 + + + +馬尿酸鹽 - - + -淀粉 + + + +利用苯甲酸鹽 + - - -檸檬酸鹽 + + + +粘酸鹽 - - - -琥珀酸鹽 + + + +酒石酸鹽 + - - -還原硝酸鹽 - - + +在50℃，經(jīng)8小時(shí)的存活菌 - - + -從下列物質(zhì)形成的酸阿東糖醇 - - + -1-(+)-阿戊糖 + + + -纖維二糖 + + + +異赤鮮醇 - - + -葡萄糖 + + + +
表Ⅱ(續(xù))特性 A42125 產(chǎn)氣 東方 巴西群諾卡氏菌 諾卡氏菌 諾卡氏菌從下列物質(zhì)形成的酸甘油 + + + +肌醇 + + + +α乳糖 + + + -麥芽糖 + + + -D-甘露醇 + + + +D-甘露糖 + + + +松三糖 - - - -蜜二糖 + + - -α- 甲基葡糖苷 + - + -棉子糖 + + - -鼠李糖 + + + -山梨醇 - - - -海藻糖 + + + +木糖 + + + -在下列溫度生長10℃ - + + +45℃ - - - -50℃ - - - -＊+表示有此特性;-表示無此特性。
表Ⅲ A42125的其他特性特性 表現(xiàn)特征＊磷酸酶 +水解脫脂奶 -類黑素的產(chǎn)生 +明膠液化 +NaCl耐量% 6過氧化氫酶 +分解聚乙酰氨基葡糖 -DNA +鳥嘌呤 +角蛋白 -睪酮 -
表Ⅲ A42125的附加特性(續(xù))特性 表現(xiàn)特征＊利用乙酸鹽 +蘋果酸鹽 +草酸鹽 +丙酸鹽 +丙酮酸鹽 +從下列物質(zhì)形成的酸甜醇 -乙醇 -果醇 +d-(+)-半乳糖 +旋復(fù)花粉 -水楊苷 -蔗糖 -生長的溫度范圍 15-37℃＊+表示有此特性;-表示無此特性。
細(xì)胞壁分析水解整細(xì)胞含有二氨基庚二酸的內(nèi)消旋異構(gòu)體。存在于整細(xì)胞水解產(chǎn)物中的糖有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和核糖。根據(jù)BECKER(上文)，細(xì)胞壁屬Ⅳ型，糖為A型(Lechevalier，上文)。A42125不產(chǎn)生霉菌酸(LCN-A)。細(xì)胞染色呈革蘭氏陽性，但并不耐酸。
A42125菌株的鑒定A42125菌株具有Ⅳ型細(xì)胞壁，A型整細(xì)胞糖型，不含霉菌酸(LCN-A)。此化學(xué)分類的資料和一般的培養(yǎng)特征與將A42125菌株確定為諾卡氏菌層Trevisan 1889[V.B.D.Skerman，V.McGowan，和P.H.A.Sneath編“審定的細(xì)菌名稱表”，Int.J.Syst.Bacteriol 30卷，第225-420頁，1980年]相一致。
A42125菌株與已經(jīng)公開的關(guān)于諾卡氏菌屬的菌種的描述進(jìn)行比較，與下列菌種相似產(chǎn)氣諾卡氏菌a，b巴西諾卡氏菌a，b(Nbrasiliensis)東方諾卡氏菌a，b，caGoodfellow and Schaal，上文bGordon，Miskra and Barnett，上文cPittenger and Brigham，上文將這些培養(yǎng)菌與A42125菌株同時(shí)生長，把已發(fā)表的資料與實(shí)驗(yàn)資料結(jié)合起來計(jì)算結(jié)果。
以，Kurylowicz等人(W.Kurylowicz，A.Parzkiewicz，W.Woznicka，W.kurzatkowski和T.Szulga，“鏈霉菌的數(shù)字分類學(xué)”，華沙，波蘭醫(yī)學(xué)出版社，第37頁，1975年)所討論的方法，用下式計(jì)算相似系數(shù)SSM＝ (Ns++Ns-)/(Ns++Ns-+Nd) ×100式中，Ns+是正相似性數(shù)，Ns-是負(fù)相似性數(shù)，Nd是不相似性數(shù)(差分)。
用于計(jì)算SSM的是生理方面的特性，而不是培養(yǎng)或形態(tài)方面的特性。特征的總數(shù)為44。
相似系數(shù)如下培養(yǎng)菌 SSMA42125 100產(chǎn)氣群諾卡氏菌 88東方諾卡氏菌 70巴西諾卡氏菌 65因?yàn)榘臀髦Z卡氏菌與A42125在培養(yǎng)上幾乎沒有相似之處，而且SSM值很低，所以不予考慮。
東方諾卡氏菌與A42125在培養(yǎng)特征上具有相似性，尤其是在ISP第3號(hào)和第4號(hào)的培養(yǎng)基上更加相似。但是，由于他們的生理特征不相似，表現(xiàn)出低的SSM值，所以也不考慮。
產(chǎn)氣群諾卡氏菌不具有需氧菌絲體，因此與A42125在培養(yǎng)上的比較只能在生長、背面顏色和可溶色素的基礎(chǔ)上比較。在最初描述產(chǎn)氣群諾卡氏菌時(shí)[E.B.Shirling，and &.D.Gottlieb，“綜合描述鏈霉菌111的類型培養(yǎng)”，Int.J.Syst Bacteriol 18卷，4期，279-392頁，1968年]，報(bào)導(dǎo)了該種菌在ISP5號(hào)培養(yǎng)基上具有白色需氧菌絲體。該報(bào)告與目前的同期比較研究的觀察一致(見表Ⅰ，ISP5號(hào))。A42125與產(chǎn)氣群諾卡氏菌在生長和背面顏色相適應(yīng)是可以為人們接受的，這種相適應(yīng)在Czapek溶液瓊脂和葡萄糖一天冬酰胺瓊脂的培養(yǎng)基上更為明顯。
除了需氧菌絲體外的其他特性而言，Gordon，(上文)把A42125菌株分類為產(chǎn)氣群諾卡氏菌。然而A42125與產(chǎn)氣群諾卡氏菌在生理和化學(xué)分類上的相似性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了不存在需氧菌絲體這個(gè)差別。對(duì)于辨別東方諾卡氏菌與產(chǎn)氣群卡氏菌，Gordon提出了三個(gè)主要特性，這些特性與A42125的那些特性的比較列于表Ⅳ。
表Ⅳ A42125、東方諾卡氏菌和產(chǎn)氣群諾卡氏菌辨別特性的比較特性 東方 產(chǎn)氣 A42125諾卡氏菌 諾卡氏菌赤蘚醇 + - -α-甲基葡糖苷 + - +對(duì)溶菌酶有抗藥性 - + +a+＝菌株具有該種特性-＝菌株不具有該種特性檢查這些指示特性，說明A42125非常接近于產(chǎn)氣群諾卡氏菌。
A42125與產(chǎn)氣群諾卡氏菌的區(qū)別僅僅在于以一種碳水化合物作為可利用的碳源(通過生長和產(chǎn)生酸來測定)。
采用上文的Mishra所設(shè)計(jì)的初步鑒別產(chǎn)氣群諾卡氏菌種的方法，培養(yǎng)物A42125可直接為鑒別產(chǎn)氣群諾卡氏菌提供線索。這些比較說明了A42125對(duì)產(chǎn)氣群諾卡氏菌雖然在培養(yǎng)上相似性有限，但生理上的相似性卻很多，而最顯著的差別卻在A42125具有需氧菌絲體。由于已知產(chǎn)氣群諾卡氏菌會(huì)產(chǎn)生需氧菌絲體，這個(gè)差別就不能被認(rèn)為足以把A42125排除在這一類諾卡氏菌以外。因此，1970年P(guān)ridham和Lyons把培養(yǎng)菌A42125分類為產(chǎn)氣群諾卡氏菌屬(Shinobu和Kawato)的一個(gè)菌株。因?yàn)楫a(chǎn)氣群諾卡氏菌并未被列在上文所審定的細(xì)菌名錄中，所以沒有充分的根據(jù)認(rèn)為它是一個(gè)已發(fā)表過的菌種。
與另一個(gè)菌種一樣，產(chǎn)生A42125的培養(yǎng)菌，即產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL18049的特征也是一種變異。菌株的重組體、突變體或變種可以用已知的方法得到。例如，突變體可以通過用各種已知物理的和化學(xué)的誘變劑，如紫外光、X射線、y射線，以及化學(xué)藥劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理獲得。保留了A42125產(chǎn)生的特征的所有產(chǎn)氣群諾卡氏菌的天然的和誘發(fā)的變種、突變體和重組體都是本發(fā)明的一部分。
用于產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049生長的培養(yǎng)基可以是任一類的培養(yǎng)基。但是，為了在生產(chǎn)上能經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，獲得最佳得率和易于分離產(chǎn)物，選用一定的培養(yǎng)基較為理想。例如，大規(guī)模用于產(chǎn)氣群諾卡氏菌發(fā)酵的碳水化合物源，雖然也可以使用其他糖或糖聚合體等，但理想的是葡萄糖和糊精。
用于培養(yǎng)產(chǎn)氣群諾卡氏菌的氮源，雖然也可以用其他氮源，如可溶蒸餾物、酵母浸提液、牛肉浸提液等，但理想的是大豆粗粉和谷物浸提液。
在加到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)無機(jī)鹽中較為有利的是能夠產(chǎn)生鋅、鈉、鎂、鈣、銨、氯、碳酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽等離子的普通可溶鹽。
細(xì)菌生長發(fā)育所必需的基本微量元素也應(yīng)包含在培養(yǎng)基內(nèi)。這類微微量元素通常在培養(yǎng)基的其他取代物中作為雜質(zhì)形式存在，其量足以滿足細(xì)菌生長的需要。起泡通常不是什么問題，但是如果需要，在大量發(fā)酵培養(yǎng)基中也可加入少量(即0.2毫升/升)的抗泡劑，如聚丙二醇。
在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行深層有氧發(fā)酵對(duì)于大量生產(chǎn)抗菌素A42125最為理想，小量生產(chǎn)A42125可用搖瓶培養(yǎng)。因?yàn)榭咕厣a(chǎn)的時(shí)間遲延，一般都與裝有細(xì)菌孢子的大發(fā)酵罐進(jìn)行接種相結(jié)合。最好采用營養(yǎng)接種物。其制備的方法是通過將細(xì)菌菌絲體片段或孢子形式接種到小體積培養(yǎng)基上，以獲得新鮮的、有生長活性的細(xì)菌培養(yǎng)物，然后將營養(yǎng)接種物移到大發(fā)酵罐。營養(yǎng)接種物的培養(yǎng)基可以采用與大量發(fā)酵用的相同培養(yǎng)基，但也可采用其他合適的培養(yǎng)基。
用產(chǎn)氣群諾卡氏菌生產(chǎn)A42125，其生長溫度范圍約為25°-37℃，生產(chǎn)A42125的較佳溫度似乎在30℃左右。
與常規(guī)的深層有氧培養(yǎng)方法一樣，無菌空氣由底部送入罐內(nèi)，而培養(yǎng)基則用通常的葉輪機(jī)葉攪動(dòng)。在迄今所用的條件下，發(fā)酵最大的氧氣攝入量不能超過0.2毫克分子/升/分鐘左右。在裝有足夠檔板的165升發(fā)酵罐內(nèi)大約含有115升肉湯，攪拌速度為200-250rpm，通氣速率為0.125V/V/m，足以保持在飽和空氣中溶解氧達(dá)到30%或高于30%的水平。
抗菌素A42125的生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中可以通過測試肉湯樣品抗已知對(duì)于此種抗菌素敏感的細(xì)菌的抗菌活性，可用于測試是否含有A42125的一種測定用的細(xì)菌是藤黃細(xì)球菌。生物測定通?？捎铆傊?槽平板測試法。
按照在深層有氧發(fā)酵條件下A42125的生產(chǎn)，可以通過發(fā)酵工藝中所用的方法，從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收A42125。在產(chǎn)生A42125細(xì)菌的發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的抗菌活性主要是在肉湯中，因此要獲得A42125的最大回收率需要先過濾培養(yǎng)基，把肉湯與菌絲體分離，然后純化過濾過的肉湯，分離出A42125。在純化工作中，各種技術(shù)都可使用。
將A42125與過濾過的肉湯進(jìn)行分離的較佳技術(shù)包括將肉湯的pH調(diào)至7左右，加適宜的吸附劑，如Diaion HP-20樹脂。樹脂用適當(dāng)溶劑如乙腈∶水(1∶1)，通過過濾和萃取進(jìn)行分離。然后真空蒸發(fā)萃取溶劑，可以得到A42125。
用這種方法得到的A42125可用公認(rèn)的方法進(jìn)一步純化，較佳的方法包括離子交換色譜法。
然后可用薄層色譜法分離抗菌素A42125，一種常用的硅膠薄層色譜溶劑系統(tǒng)是乙腈∶甲醇∶水∶氫氧化銨(4∶2∶2∶1)。在該系統(tǒng)中，A42125的Rf值約為0.43?？咕乜捎锰冱S細(xì)球菌的生物自顯影方法或其他方法，如香草醛-硫酸噴濕劑，進(jìn)行檢測。
換言之，固體的培養(yǎng)物，包括培養(yǎng)基成份和菌絲體，無需萃取或分離，但最好是去水后，可以作為A42125源。例如，產(chǎn)生A42125后，整個(gè)發(fā)酵肉湯可用低壓冷凍干燥法，轉(zhuǎn)鼓式干燥或共沸蒸餾和干燥等方法進(jìn)行干燥，然后將干燥的肉湯直接混入飼料的預(yù)混合料中。
A42125抑制使動(dòng)植物體致病的細(xì)菌生長。表Ⅴ概括了用常規(guī)瓊脂稀釋法測定出的A42125抑制各種細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC′S)。
表ⅤA42125的抗菌活性試驗(yàn)細(xì)菌 最小抑制濃度(微克/毫升)金黃色釀膿葡萄球菌V1.1 1金黃色釀膿葡萄球菌V41 1金黃色釀膿葡萄球菌X400 1金黃色釀膿葡萄球菌S13E 1表皮葡萄球菌EPi 1 1表皮葡萄球菌222 0.5釀膿葡萄球菌C203 2葡萄球菌屬sp.group D X66 1葡萄球菌屬sp.group D 2041 4流感嗜血桿菌76 8A42125抗菌活性的一個(gè)重要方面就是它的抗厭氧菌活性，按標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋測定法測定，A42125抑制各種厭氧菌的最低抑制濃度列于表Ⅵ。最后幾點(diǎn)是經(jīng)24小時(shí)保溫培養(yǎng)后的讀數(shù)。
表Ⅵ厭氧菌分離物對(duì)A42125的敏感性厭氧菌 最低抑制濃度(微克/毫升)Clostridium difficile 2994 4產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌 81 4敗血狀芽胞桿菌 1128 4Eubacterium aerofaciens 1235 4Peptococcus asaccharolyticus 1302 64Peptococcus prevoti 1281 4Peptostreptococcus anaerobius 1428 8Peptostreptococcus intermedius 1624 4痤瘡丙酸菌 79 8(Propionibacterium acnes)脆弱擬桿菌 111 ＞128脆弱擬桿菌 1877 ＞128脆弱擬桿菌 1936B ＞128Bacteroides thetaiotaomicron 1438 128黑色素?cái)M桿菌 1856/28 64黑色素?cái)M桿菌 2736 128Bacteroides vulgatis 1211 128Bacteroides corrodens 1874 ＞128Fusobacterium symbiosum 1470 ＞128Fusobacterium necrophorum 6054A ＞0.5A42125抗菌活性的另一個(gè)重要方面是抑制產(chǎn)生甲烷的細(xì)菌，例如在試驗(yàn)濃度低至0.1微克/毫升，A42125抑制Methanococcus vannielli，在該試驗(yàn)中將一個(gè)A42125結(jié)晶置于24小時(shí)菌苔上(最小培養(yǎng)基)，3天時(shí)測量抑制情況。
A42125的另一個(gè)重要性質(zhì)是能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，例如A42125能夠提高瘤胃功能發(fā)達(dá)的反動(dòng)物對(duì)飼料的利用率。
飼料的利用率可以通過觀察瘤胃中各種丙酸鹽化合物的產(chǎn)生和濃度進(jìn)行監(jiān)測。胃液是從一頭通過外科手術(shù)將胃管插在瘤胃中的公牛取得的，該頭公牛一直保持飼以高谷物飼料，其成份如下69.95% 粗谷物碎10% 玉米芯碎8% 大豆粗粉(50%蛋白質(zhì))5% 紫花首蓿粗粉5% 糖蜜0.6% 尿素0.5% 磷酸二鈣0.5% 碳酸鈣0.3% 鹽0.07% 維生素A和D預(yù)混合料0.05% 維生表E預(yù)混合料0.03% 痕量無機(jī)物預(yù)混合料瘤胃胃液樣品用4層干駱包布過濾，將濾液收集在真空瓶中。保留在干駱包布上的顆粒物質(zhì)再懸浮在足夠的生理緩沖液中，使其恢復(fù)到瘤胃胃液的原來體積，再用干駱包布過濾懸浮液。所用緩沖液配方如下
0.316克/升 Na2HPO40.152克/升 KH2PO42.260克/升 NaHCO30.375克/升 KCl0.375克/升 NaCl0.112克/升 MgSO40.038克/升 CaCl20.008克/升 FeSO4·7H2O0.004克/升 MnSO40.004克/升 ZnSO4·7H2O0.002克/升 CuSO4·5H2O0.001克/升 CoCl2Cheng等，(J.Dairy Sci.)38卷，1225頁，1955年。
將2份濾液匯集在一個(gè)分液漏斗內(nèi)，靜置直到顆粒物質(zhì)上升到頂層，然后將清液層分離開用相同的緩沖液稀釋為1∶1，將pH調(diào)至7.0。
取10毫升稀釋瘤胃胃液置于裝有上述相同飼料40毫克的25毫升燒瓶中，每個(gè)燒瓶加入5毫克的大豆蛋白，再將待處理的化合物稱入每個(gè)燒瓶。每個(gè)處理用4個(gè)相同樣品的燒瓶，并應(yīng)用每4個(gè)對(duì)照燒瓶為2組。用一個(gè)零點(diǎn)時(shí)間對(duì)照，并應(yīng)用一個(gè)保溫16小時(shí)對(duì)照;所有試驗(yàn)燒瓶都在38℃保溫16小時(shí)。保溫結(jié)束時(shí)，測量pH值，并對(duì)每個(gè)燒瓶加入2毫升25%的偏磷酸，使樣品沉淀。用揮發(fā)性脂肪酸的氣相色譜法分析上清液。
分析乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的化合物，將分析結(jié)果與對(duì)照燒瓶的分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。明顯高于對(duì)照的產(chǎn)生丙酸鹽的處理則可認(rèn)為是有效的處理。表Ⅶ給出了在這些試驗(yàn)中A42125處理過的燒瓶中的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度與在對(duì)照燒瓶中濃度的比。
表Ⅶ A42125 對(duì)反 動(dòng)物的飼料利用效率的影響＊摩爾% 摩爾% 摩爾% 總VFA/對(duì)用量 丙酸鹽 乙酸鹽 丁酸鹽 照VFA(微克/毫升) (毫摩爾/升)20 1.283 0.914 0.608 0.9215 1.237 0.877 1.019 0.9885 0.959 0.992 1.075 0.9211 1.122 1.015 0.795 1.2375 1.118 0.915 0.867 1.0411 1.105 0.881 1.111 0.9975 1.778 0.896 0.654 0.9211 1.458 0.915 0.823 0.858＊5個(gè)試驗(yàn)甲烷抑制也使反 動(dòng)物更有效地利用飼料，它是通過將乙酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榭衫玫哪芰?，而不是轉(zhuǎn)變?yōu)楸慌懦龅募淄?。這種活性可以通過用模擬瘤胃作用的試管內(nèi)的試驗(yàn)來測量。這個(gè)試驗(yàn)可以在模擬瘤胃長時(shí)間作用方式的連續(xù)發(fā)酵燒瓶內(nèi)進(jìn)行。每個(gè)燒瓶都是一個(gè)氣體密封容器，它具有液體入口、固體入口、采樣口和與收取發(fā)酵產(chǎn)生的氣體的橡膠球相接的排氣管。每個(gè)燒瓶的液體體積通過與液體收集罐相連的立管控制在500毫升。燒瓶的溫度控制在38°～40℃。每個(gè)燒瓶都用磁鐵攪拌機(jī)徐徐攪拌。
每個(gè)試驗(yàn)一開始就將500毫升由經(jīng)胃管插入手術(shù)的公牛中取得的過濾過的瘤胃胃液加到燒瓶中，該公牛在取胃液之前已喂過與本試驗(yàn)所用的相同飼料。排液收集瓶預(yù)先加入50毫升稀偏磷酸，以阻止發(fā)酵液體從燒瓶中溢出。然后密封燒瓶，并將各氣體收集球相互連接。
向每個(gè)燒瓶每天連續(xù)滴加1升pH6.8～7.0緩沖溶液，其組分如下
磷酸氫二鈉 2.2克/升氯化鎂 0.036克/升碳酸氫鈉 5.9克/升氯化鉀 0.34克/升氯化鈉 0.28克/升尿素 1.0克/升氯化鈣 0.024克/升每天2次將合適的飼料10克經(jīng)飼料孔加入各個(gè)燒瓶中，每次加入飼料后，關(guān)閉排氣口，并用二氧化碳沖洗燒瓶。
每天都收集和分析流出液，收集和分析燒瓶中排出的氣體。
在沒有任何處理化合物加入飼料的的情況下，通常的做法是每個(gè)燒瓶都進(jìn)行4天。在4天的平衡時(shí)間后，開始分析流出液和排出的氣體，而燒瓶中發(fā)酵試驗(yàn)在不加入任何處理化合物的情況下一直進(jìn)行到分析數(shù)據(jù)相對(duì)恒定，在此時(shí)開始加入經(jīng)處理過的飼料在加入處理過的飼料的情況下，燒瓶試驗(yàn)的操作至少要持續(xù)7天。
加入飼料中的化合物的適宜總量列于表Ⅷ，它給出了在500毫升液體容積的燒瓶中的化合物的濃度。在大多數(shù)試驗(yàn)中，每個(gè)化合物的每個(gè)處理都用2個(gè)燒瓶，然后將每天處理2個(gè)燒瓶的整個(gè)處理期間的所有數(shù)據(jù)匯集平均。表Ⅷ綜合了A42125抑制甲烷的活性。
表Ⅷ A42125對(duì)反 動(dòng)物產(chǎn)生甲烷的影響＊用量(微克/毫升) 甲烷(毫摩爾/日)- 23.05 2.3- 4.15 1.81 2.3- 7.25 0.31 0.8＊3個(gè)試驗(yàn)給小鼠投用單劑量A42125后，測定LD50為LD50(腹膜內(nèi)投藥)＝＜9.375毫克/公斤L(fēng)D50(口服)＝89毫克/公斤當(dāng)反 動(dòng)物口服A42125時(shí)，其典型的作用是增加丙酸鹽的產(chǎn)生。從而提高了飼料的利用效率，反 動(dòng)物的口服量約為0.05～6.75毫克/公斤/日，較佳口服量約為0.2～3.5毫克/公斤/日。
理想的投藥方法是將化合物與動(dòng)物飼料混合，但是也可以用其他方式投藥，例如片劑、獸用頓服劑、大丸劑或膠囊劑。這些不同的劑量形式的配方可用已知的獸用藥物的配制技術(shù)配制。各個(gè)劑量單位應(yīng)含有直接與被處理的動(dòng)物的適宜的日劑量有類的一定量的本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明還涉及適合于增進(jìn)飼料利用率的飼料組合物，包括定量的飼料及每噸含6～60克A42125化合物。
動(dòng)物對(duì)A42125可以口服，也可以用腸胃道外給藥。A42125給藥的最常用方法是按照處方加到飼料中。各種飼料，包括普通的干飼料、液體飼料和小丸飼料，都可使用。雖然較好的給藥方法是將其與動(dòng)物飼料混合，但也可以用其他方法給藥，例如用片劑、獸用頓服劑、大丸劑或膠囊劑。各個(gè)劑量單位應(yīng)含有直接與被處理的動(dòng)物的適宜日劑量有關(guān)的一定量的A42125。
將藥物配制在動(dòng)物飼料中的方法已為人們所熟知，較好的方法是制成濃縮的藥物預(yù)混物，它又可用于制備藥用飼料。典型的預(yù)混物可以是每磅預(yù)混合物約含有1～200克藥物，預(yù)混物可以是液體制劑，也可以是固體制劑。
動(dòng)物飼料的最終配方將決定于用藥量。配制飼料、混制飼料和制成小丸飼料等一般方法都可用來制備含有A42125的飼料。
A42125可以按照獸用藥物制藥技術(shù)領(lǐng)域：
所公認(rèn)的方法配制成可供腸胃道外投藥應(yīng)用。含有A42125有效的注射用的組合物可以是懸浮液，也可以是溶液。配制成溶液形式時(shí)，可將A42125溶于生理上可以接受的載體。這種載體包括一種合適的溶劑、防腐劑為芐醇，如果需要，還可含有緩沖劑?？捎玫娜軇?，可以包括例如水、醇類、二元醇類或惰性油如植物油或高精制的礦物油。
制備注射用的懸浮液組合物可以應(yīng)用該化合物及佐藥的一種非溶劑作為載體，舉例來說，非溶劑可以是水或一種二元醇，為聚乙二醇。
生理上可以接受的適合用的佐藥必須使該化合物保持懸浮在懸浮液組合物中。佐藥可從增稠劑，如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽中選出。許多表面活性劑也可用于使該化合物懸浮，卵磷脂、烷基酚-聚環(huán)氧乙烷加合物、萘磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，都可用作液體非溶劑中的懸浮劑。
在各種個(gè)別情況下，影響液體非溶劑的親水性、密度和表面張力的許多物質(zhì)都有助于配制注射用的懸浮液。例如聚硅氧烷抗泡劑、二元醇、山梨糖醇和糖類，都可用作懸浮劑。
為了更充分地說明本發(fā)明的作用，提供如下實(shí)施例。
實(shí)施例一抗菌素A42125的制備A.搖瓶發(fā)酵將培養(yǎng)菌產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049(既可以是冰凍干燥的丸狀物，也可以是保存在液氮中的懸浮液)接種在具有下列成份的斜面培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)基成份 含量(克/升)土豆糊精 10酵母提取液 1酶水解駱蛋白＊ 2牛肉提取液 1CoCl2·6H2O 0.01瓊脂 20去離子水 加至 1升＊N-Z胺A.Humko Sheffield Chemical Co.，Lyndhurst NJ用NaOH將pH值調(diào)至～6.2～7.0。
接種斜面在30℃下保溫大約7天以上，然后用無菌器具刮削成熟的斜面培養(yǎng)菌，以便將孢子松開，除去并浸軟菌絲體叢。將所得疏松孢子和培養(yǎng)生長物的1/4左右接種到具有下列成份的50毫升營養(yǎng)培養(yǎng)基上。
營養(yǎng)培養(yǎng)基成份 含量(克/升)葡萄糖 15木薯淀粉糊精＊ 20大豆粗粉 15谷物浸漬液 10酵母提取液 1CaCO32自來水 加至1 升＊Stadex 11，A.E.Staley Co.，Decatur IL用NaOH將pH值調(diào)至～5.5～6.5。
接種過的營養(yǎng)培養(yǎng)基放在250毫升錐形燒瓶中，在環(huán)繞2英寸(5.08厘米)圓周以250rpm轉(zhuǎn)速作圓周運(yùn)動(dòng)的搖床上，在30℃下保溫培養(yǎng)約72小時(shí)。
將這個(gè)保溫培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基(1.25毫升)接種到具有下列成份的50毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基上。
成份 含量(克/升)葡萄糖 25谷物淀粉 10可溶肉蛋白胨＊ 10酶水解酪蛋白＊＊ 4廢糖蜜 5MgSO4·7H2O 0.5CaCO32.0查貝克氏無機(jī)原液＊＊＊ 2毫升去離子水 加至 1升＊O.M.蛋白胨，Amber Laboratories，Juneau WI＊＊N-Z胺A＊＊＊查貝克氏無機(jī)原液的組分100克KCl;100克MgSO4·7H2O;2克FeSO4·7H2O;加去離子水至1升。
接種過的生產(chǎn)培養(yǎng)基放入250毫升廣口錐形燒瓶，該燒瓶置于環(huán)繞2英寸圓周以250rpm轉(zhuǎn)速作圓周運(yùn)動(dòng)的搖床上，在30℃下保溫培養(yǎng)3～5天。
B.發(fā)酵罐發(fā)酵為了提供大體積接種，如A節(jié)所述的制備方法，將10毫升保溫培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基接種到具有與營養(yǎng)培養(yǎng)基的成份相同的第2階段生長培養(yǎng)基250毫升上。該第二階段培養(yǎng)基置于2升廣口錐形燒瓶中，燒瓶在環(huán)繞2英寸圓周的250rpm轉(zhuǎn)速作圓周運(yùn)動(dòng)的搖床上，在30℃下保溫培養(yǎng)約70小時(shí)。
將制備好的第2階段培養(yǎng)基(400毫升)接種到100升在用A節(jié)所介紹的方法制備的無菌生產(chǎn)培養(yǎng)基上。使接種過的生產(chǎn)培養(yǎng)基在165升攪拌發(fā)酵罐內(nèi)，在30℃下發(fā)酵3～5天。在攪拌發(fā)酵罐內(nèi)低空氣流量(0.12～0.25v/v/m)和中等轉(zhuǎn)速(200～250rpm)保持飽和空氣中約30%的溶解氧水平。
實(shí)施例二 A42125的分離含有3%硅藻土的完全發(fā)酵肉湯(92升)經(jīng)壓濾器過濾，用NaOH將肉湯濾液(74升)的pH值調(diào)至7，加Diaion HP-20樹脂(9.4升)，混合物經(jīng)攪拌45分鐘后過濾，除去濾液，用水洗滌樹脂3次(每次用10升)并用乙腈∶水(3∶17，每次用10升)再懸浮、攪拌和過濾3次，棄去洗液。A42125經(jīng)將樹脂懸浮在乙腈∶水(1∶1，10升)中進(jìn)行洗脫，同時(shí)進(jìn)行攪拌和過濾。連續(xù)進(jìn)行洗脫四次，對(duì)每次洗脫后得到的每份洗脫液用藤黃細(xì)球菌圓盤平板測定法進(jìn)行測定。將前兩份洗脫液混合在一起，經(jīng)真空濃縮，除去乙腈，冰凍干燥后得到A42125粗制品94.9克，第三份洗脫液得到A42125粗制品20.8克。
實(shí)施例三 A42125的純化和結(jié)晶將實(shí)施例二得到的A42125粗制品混合(115.2克)，溶于水(3升)。過濾溶液，除去沉淀。將濾液置于含有3升Dowex 50×2(NH+4)，100～200篩孔的樹脂的色譜柱中，用5倍色譜柱容積的水和0.1N NH OH洗滌色譜柱。將經(jīng)2N NH4OH洗脫后含有最大量A42125的洗脫液混合，濃縮成大約3升體積。A42125經(jīng)沉淀和過濾分離，沉淀物溶于甲醇(300毫升)，然后將該溶液加到乙醚(6升)中，使A42125沉淀。該沉淀物經(jīng)過濾干燥，得到16.6克A42125非晶形粉末。經(jīng)進(jìn)一步濃縮水溶液后得到第二次沉淀物，用同樣方法處理，得到20.7克純度較差的A42125。
將第一次得到的A42125(16.6克)溶于溫水(800毫升)，該溶液可在室溫下靜置過夜，結(jié)晶出A42125。晶體經(jīng)過濾分離，真空干燥后，得到10.6克和2.3克(第二次產(chǎn)物)A42125晶體(熔點(diǎn)149～150℃)。
實(shí)施例四 A42125-增強(qiáng)的定量飼料適宜于肥育牲口的平衡高谷物定量飼料按如下配方制備成份 百分比 噸/磅谷物(黃色) 50.25 1005.0玉米芯 34.927 698.54脫水紫花苜蓿粗粉，17% 4.00 80.0大豆油粗粉，(溶劑提取過的) 4.00 80.0尿素(飼料級(jí)) 0.35 7.0甘蔗糖漿 5.00 100.0磷酸二鈣 0.65 13.0鹽 0.35 7.0碳酸鈣 0.30 6.0少量無機(jī)物預(yù)混物10.03 0.6維生素A+D3預(yù)混物20.07 1.4維生素E預(yù)混物30.07 1.4A42125 0.003 0.06100.00 2000.01.少量無機(jī)物預(yù)混物含有2.5%錳(一氧化錳)，0.07%碘(碘化鉀)，0.30%鈷(碳酸鈷)，0.50%銅(氧化銅)，20.00%鋅(硫酸鋅)2.每磅維生素A和D3預(yù)混物含有2，000，000美國藥典單位維生素A和225，750美國藥典單位維生素D33.每磅維生素E預(yù)混物含有20，000國際單位維生素E
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)具有下列特征的抗菌素A42125或其鹽的方法狀態(tài)白色結(jié)晶(由水中結(jié)晶)熔點(diǎn)149～150℃紫外光不吸收紅外光(Kbr)見附圖滴定(80%二甲基甲酰胺水溶液)pKa∶5.2，8.7和10.5分子量2032(場致解吸質(zhì)譜分析)實(shí)驗(yàn)式C101H184N2O38氨基酸未找到溶解度溶于水包括培養(yǎng)產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049或其產(chǎn)生A42125的變體、突變體或重組體，在含有可同化的碳、氮和無機(jī)鹽源的培養(yǎng)基中，在深層有氧發(fā)酵條件下，直至產(chǎn)生抗菌素A42125，以及任選的鹽化產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，包括從培養(yǎng)基中分離A42125的附加方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中所用的菌株是產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049(N.aerocolonigenes NRRL 18049)。
4.一種微生物產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049的生物純培養(yǎng)菌或其產(chǎn)生A42125的變體、突變體或重組體。
5.一種發(fā)展甲烷微生物的遺傳交換系統(tǒng)的方法，包括選擇對(duì)權(quán)利要求
1的抗菌素A42125具有抗性的突變體和將該突變體應(yīng)用于遺傳重組體試驗(yàn)中。
專利摘要
由新菌株產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049(Nocardia aerocolonigenes，NRRL 18049)產(chǎn)生的抗菌素A42125可用作革蘭氏陽性和產(chǎn)生甲烷的微生物的抑制劑。A42125也可提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料利用效率。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)氣群諾卡氏菌NRRL 18049的生物純培養(yǎng)菌和通過該菌種發(fā)酵生產(chǎn)A42125的方法。
文檔編號(hào)C12P1/06GK87102770SQ87102770
公開日1987年12月16日 申請日期1987年4月11日
發(fā)明者羅伯特·L·哈米爾, 拉爾夫·埃米爾·卡斯特納 申請人:伊萊利利公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan