擬表位的噬菌體(1.0XlO11 pfu)和一系列不同濃度的50 μ? OTA標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取OD45tl。以O(shè)TA濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入OTA的孔的OD45tl/未加入OTA的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性相關(guān)性較好(圖1)。如圖1，以O(shè)TA抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。OTA抗原模擬表位Ph-1 (KLGFQLHQPSWP)、Ph-7 (FNLHQPIHNWPL),Ph-18 (AQFFQLHSQAYS)、Ph_5 (DGFQLHTPFSAK)與抗 OTA 抗體的 IC50值分別為 553，495，509 pg/ml 和 1.03 ng/ml。
[0023](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有OTA抗原模擬表位的噬菌體(1.0X 111 pfu)和待測樣品提取液，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取OD45tl,計算結(jié)合率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中OTA的含量。
[0024]實施例4.0TA抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應(yīng)用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0025](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有OTA抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 111 pfu), 100微升包被于酶標(biāo)板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。
[0026](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗OTA單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? OTA標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以O(shè)TA濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入OTA的孔的OD450/未加入OTA的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0027](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗OTA單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? OTA標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以O(shè)TA濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入OTA的孔的OD450/未加入OTA的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]實施例5.0TA抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應(yīng)用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關(guān)食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0029](2)噬菌體及控制線的點陣
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有OTA抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 111 pfu)，用點陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米)，作為檢測線；將0.5 mg/ml的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，用點陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。
[0030](3 )膠體金標(biāo)記OTA抗體
將OTA抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% PEG加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標(biāo)記的OTA抗體溶液。
[0031](4)膠體金檢測卡的組裝
將膠體金標(biāo)記的OTA抗體點噴于膠金墊上(1.0微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點陣了檢測線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進行組裝，切成試紙條，裝入檢測卡中待用。
[0032](5)樣品的檢測
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有OTA且超過膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有OTA且低于膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。
[0033]實施例6 OTA抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴增的方式
將展示有OTA抗原模擬表位的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養(yǎng)物中，37度220 rpm振蕩培養(yǎng)4.5 h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4 V 10000 rpm離心10 min，將上清的上部80 %轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 °C下靜置120 min。4°C 10000rpm離心PEG/NaCL靜置溶液15 min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImL TBS進行重懸，即為噬菌體擴增液。
[0034](2)以O(shè)TA抗原模擬表位-融合蛋白的方式進行制備
A.PCR擴增OTA抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應(yīng)體系:(50 μ?
10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2.5 mM)4 M-L
M13KE insert extens1n primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌體DNA模板I μ?
Pyrobest DNA Polymerase0.5 M-L
滅菌 ddH2037.5 μ?
PCR 反應(yīng)條件:95°C 5 min，接著 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec，72°C10 min 共 30 cycles
采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，微量核酸定量儀定量。本發(fā)明OTA抗原模擬表位的編碼基因序列分別對應(yīng)為:
AAGCTTGGGTTTCAGTTGCATCAGCCTAGTTGGCCG、TTTAATTTGCATCAGCCGATTCATAATTGGCCGCTG、GCTCAGTTTTTTTAGCTGCATTCGCAGGCGTATTCG、GATGGTTTTCAGTTGCATACTCCTTTTTCTGCTAAG
B.外源編碼基因及表達載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對外源編碼基因和表達載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達MBP融合蛋白)進行雙酶切。
[0035]C.酶切后產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取10 μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L感受態(tài)細胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補加600 μ L LB液體培養(yǎng)液，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)I h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。
[0036].0TA抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，37 °C，220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物細菌濃度0D600達到0.6時，向三瓶培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,220 r/min振蕩培養(yǎng)，將誘導(dǎo)物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預(yù)冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7.4,獲得OTA抗原模擬表位-MBP融合蛋白。
【主權(quán)項】
1.針對赭曲霉毒素A的抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為:AQFFQLHSQAYS。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，序列對應(yīng)為:GCTCAGTTTTTTTAGCTGCATTCGCAGGCGTATTCG。
4.如權(quán)利要求1所述抗原模擬表位的制備方法，其特征在于通過噬菌體擴增、化學(xué)合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備；所述噬菌體擴增是指將展示有赭曲霉毒素A抗原模擬表位的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有赭曲霉毒素A抗原模擬表位的噬菌體粒子；所述化學(xué)合成指依據(jù)模擬表位模擬表位氨基酸序列，通過化學(xué)合成多肽的方式進行多肽合成；所述基因工程重組表達的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行赭曲霉毒素A抗原模擬表位的大量制備。
5.權(quán)利要求1所述抗原模擬表位在作為免疫學(xué)檢測分析試劑中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于赭曲霉毒素A抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原形式作為免疫學(xué)檢測分析試劑的應(yīng)用。
7.如如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于赭曲霉毒素A抗原模擬表位以固相抗原形式作為膠體金免疫層析檢測分析試劑的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及赭曲霉毒素A的抗原模擬表位，其氨基酸序列為AQFFQLHSQAYS。本發(fā)明OTA抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于OTA的免疫學(xué)檢測，該抗原模擬表位具有與天然OTA分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了OTA對人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價值。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-577, C12N15-11, C07K7-08
【公開號】CN104530194
【申請?zhí)枴緾N201410550378
【發(fā)明人】何慶華, 許楊
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2013年3月6日