一種油菜抗菌肽BnLTP1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種油菜抗菌肽BnLTPl及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病原菌可引起包括人類，牲畜，作物和其他生物的嚴重病害，造成嚴重的經(jīng) 濟損失。植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80 %以上的植物病害（張福 麗，王占斌，王志英，幾丁質(zhì)酶在植物抗真菌病害中的作用，林業(yè)科技，2006, 31(3): 24-27)，造成世界糧食作物減產(chǎn)約 20 % (Knight S.C·，Anthony V.M·，Brady A.M.，et al. Rationale and perspecti ves on the developmentof fungicides.Annu Rev Phytopathol，1997,35:349-372)。許多重要植物病害都是真菌造成的，如馬鈴薯晚疫病、 稻瘟病、小麥白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大 的經(jīng)濟損失。另一方面，真菌在侵染植物的過程中，釋放出來的代謝產(chǎn)物一一真菌毒素 (mycotoxin)，對農(nóng)作物以及人類的健康也造成極大的危害，如黃曲霉毒素（aflatoxin) 等。
[0003] 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)屬于子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤 菌科、核盤菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤菌可以廣 泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。核盤菌引起的菌核病是一種類似于灰霉的腐生營養(yǎng) 型真菌，這種破壞性病源侵染超過400種植物，分布廣泛。目前對菌核病的防治主要依靠 化學(xué)農(nóng)藥，然而化學(xué)防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性 也受到嚴重影響。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，莖和角果 的腐爛，導(dǎo)致了巨大的產(chǎn)量損失。盡管菌核病嚴重威脅了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，植物對核盤菌的寄 主抗性的分子機制，我們依然知之甚少。暨今為止還沒有發(fā)現(xiàn)完全免疫或者高抗的油菜 栽培品種（Liu, S.，Wang, H.，Zha ng，J.，F(xiàn)itt，B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang, W.， and Guo, X. 2005. In vitro mu tation and selection of doubled-hapIoid Brassica napus lines with improved resistance to S clerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144)，因此，探宄植物對這種病源的抗性機制，發(fā)現(xiàn)新的抗性基因具有深遠意 義。
[0004] 灰霉菌（Botrytis cinerea)，又稱灰葡萄孢菌，是一種廣寄主性的、能夠引起200 多種已知植物（如水果、蔬菜及花丼）灰霉病的壞死營養(yǎng)型病原真菌。其在空氣中廣泛分 布，不僅能夠侵染田間作物，同樣會給植物的采后階段造成巨大損失。灰霉菌能夠在低溫條 件下（〇°C)生長，靠產(chǎn)生大量的灰色分生孢子進行傳播，與其它采后病原真菌相比，具有潛 伏侵染和低溫致病的優(yōu)勢。同時，其還具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點。日常 生活中遇到的果蔬放一段時間會長毛，多數(shù)就可能是受到了灰霉菌的侵染?；颐共∽畛踔?是流行于歐洲和美洲，自20世紀80年代才開始在中國發(fā)生蔓延。由于溫室和大棚種植技 術(shù)的推廣普及，作物灰霉病害嚴重，已成為蔬菜、花丼和林業(yè)苗培育基地生產(chǎn)的主要限制因 素。截止2013年，世界上尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種植物對灰霉菌產(chǎn)生抗性（陳琪，丁克堅，檀根 甲，張曉偉，灰霉病菌菌株抗藥性變異及其遺傳性研宄。2003華東植物病理學(xué)術(shù)研討會暨江 蘇省植物病理學(xué)會第十次會員代表大會論文集）。因此發(fā)現(xiàn)新的抗灰霉菌的基因具有深遠 的意義。
[0005] 稻瘟病又名稻熱病：俗稱火燒瘟、嗑頭瘟，稻瘟病是水稻四大重要病害之一，主要 由病原真菌稻梨孢（稻瘟病菌P.oryzae)引起?？梢鸫蠓葴p產(chǎn)，嚴重時減產(chǎn)40%? 50%，甚至顆粒無收水。世界各稻區(qū)均勻發(fā)生，其中以葉部、節(jié)部發(fā)生為多，發(fā)生后可造成不 同程度減產(chǎn)，尤其穗頸瘟或節(jié)瘟發(fā)生早而重，可造成白穗以致絕產(chǎn)。主要為害葉片、莖桿、穗 部。因為害時期、部位不同分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟、谷粒瘟。苗瘟發(fā)生于三葉前，由種 子帶菌所致。病苗基部灰黑，上部變褐，卷縮而死，濕度較大時病部產(chǎn)生大量灰黑色霉層，即 病原菌分生孢子梗和分生孢子。葉瘟在整個生育期都能發(fā)生。分蘗至拔節(jié)期為害較重。秧 苗期發(fā)病后變成黃褐色而枯死，不形成明顯病斑，潮濕時，可長出青灰色霉。在我國南、北方 稻區(qū)都有不同程度發(fā)生，流行年份一般減產(chǎn)10-20%，嚴重的減產(chǎn)達40-50%，在水稻秧苗 期和分蘗期發(fā)病，可使葉片大量枯死，嚴重時全田呈火燒狀，有些稻株雖不枯死，但抽出的 新葉不易伸長，植株萎縮不抽穗或抽出短小的穗，孕穗抽穗期發(fā)病、節(jié)瘟、穗頸瘟嚴重發(fā)生， 可造成大量白穗或半白穗，損失極大（凌忠志，《稻瘟病研宄論文集》，中國農(nóng)業(yè)出版社）。
[0006] 目前常用的病害防治措施，主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而化學(xué)防治不僅成本高、污染環(huán) 境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性也會受到嚴重影響。隨著社會的進步，人們越 來越深刻地認識到長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境和人類健康的危害。生物防治可以有 效地克服這些弊端，因而生物農(nóng)藥越來越受到人們的重視。
[0007] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有抗菌活性的天然小分子 蛋白，廣泛存在于生物界，是機體非特異性免疫的重要組成部分，在體內(nèi)體外均具有抗菌 活性（Gordo n YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)?？咕牡膹V泛的生物學(xué)活性，對細菌真菌、原生動物、病毒和腫瘤等有很強的抑制作 用，具有高效、環(huán)保、不使病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點使它在生物防治和醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng) 用前景（Gordon YJ, Romanowski E G, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Dr ugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。近年來已經(jīng)成為植物抗病基因工程、養(yǎng)殖飼料添加劑，食品防腐劑、新興醫(yī)藥等領(lǐng)域的 研宄熱點，在疾病防治領(lǐng)域中是抗生素的理想替代品（Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity. Annu Rev Immunol. 1995,13 :61-92) 〇 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程 中，用抗菌肽進行植保工作可以避免農(nóng)用抗生素通過食物鏈的傳遞對人體產(chǎn)生的威脅。
[0008] 按照氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)的植物抗菌肽可以分為植物防御素 （plant defensins)、脂轉(zhuǎn)移蛋白（lipidtransfer proteins，LTPs)，硫素（thionins)，蛻皮 素（snakins)，橡膠蛋白類（hev ein-like)，打結(jié)素類（knottin-like peptides)，鳳仙 花素（IbAMP)，和新近發(fā)現(xiàn)的養(yǎng)菜素 （she pherdins)、環(huán)肽（cyclotides)等（Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother, 1999,43 (6)： 1317-1323)?？咕幕旧隙季哂幸恍┕残?，如：小分子量（<10KDa)，陽離子表面、正電荷 以及兩親性，這些特性使得抗菌肽能夠和細胞膜綁定并能夠插入到細胞內(nèi)部，大部分抗菌 肽是通過破壞細胞膜從而使目標細胞死亡而達到殺菌目的。而另一些抗菌肽卻能夠通過細 胞膜上的離子通道進入到細胞內(nèi)部破壞細胞而不破壞細胞膜（Vogel PMHaHJ:Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem Cell Biol 1998,76:235-246.)。脯氨酸富集類抗菌肽（PRPs)的殺菌方式就是通過不破壞細胞膜， 而是利用離子通道的方式進行的（L.Otvos J:The short proline-rich antibacterial peptide f amily.Cellular and Molecular Life Sciences 2002,59:1138_1150.)〇 大 多數(shù)類型的植物源抗菌肽對動物和植物細胞都沒有毒性（Murad AEPelegrini PB. Neto SM. Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction of Transgenic Plants. Transgenic Plant Journ al 2001(1) :39-48)。與動物源抗菌肽相比， 植物源抗菌肽更易于在作物中表達和調(diào)控，不容易被細胞內(nèi)的蛋白酶降解。與其他殺菌劑 相比，植物來源的抗菌肽對環(huán)境的影響更小，更友好，更具開發(fā)成為抗真菌生物制劑的潛力 (Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibi otics. Antimicrob Agent Chemother，1999， 43 (6) : 1317-1323)。如將Rs-AFPs等植物抗菌肽基因?qū)胛⑸镏羞M行發(fā)酵，更容易克服 對宿主的毒性作用而進行大量生產(chǎn)。
[0009] 抗菌肽是一類對細菌、真菌等微生物有抑制或殺滅作用的小分子肽，它能被細 菌、真菌或物理的、化學(xué)的刺激所誘導(dǎo)，甚至有些抗菌肽在植物體內(nèi)能形成組成性的表達。 它不僅