L去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為0.1%均一蛋白及多糖貯液，分別調(diào)節(jié)pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入v/v 6.67%聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.5,4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次重復(fù)沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物。
[0016]將得到的大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.5，過截留分子量為10kD的超濾膜除糖，收集濾過液；截留分子量3000超濾脫鹽，即得純化的大豆凝集素。稱取純化的大豆凝集素1.0mg，溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為1.0mg/mL的溶液，過0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0017]經(jīng)測定，以上實(shí)例所得大豆凝集素，約含有蛋白94.9 %，總糖1.3%，灰分1.8%及水分 2.0%。
[0018]實(shí)施例2
將大豆乳清調(diào)至pH 4.7,9500rpm離心30min，除沉淀；再次調(diào)至pH 8.5,9500rpm離心30min，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，量取2L溶液，在4_30°C下按照硫酸錢飽和度表加入固體硫酸錢至50%飽和度，9500rpm離心30min，收集沉淀，上清液繼續(xù)添加硫酸銨至70%飽和度，再次9500rpm離心30min，收集沉淀，合并兩次沉淀，得到含有的大豆凝集素蛋白粗品約1.85g，加入30mL去離子水溶解，截留分子量3500透析脫鹽48小時，截留液真空冷凍干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白樣品。
[0019]分別精確稱取0.3g上述初級分離的P-7S蛋白樣品及0.3g聚陰離子多糖粉末，分別溶解于10mL去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為0.3%均一蛋白及多糖貯液，分別調(diào)節(jié)pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入v/v 5.0%聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.7,4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次重復(fù)沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物。
[0020]將得到的大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.5，過截留分子量為200kD的超濾膜除糖，收集濾過液；截留分子量3500超濾脫鹽，即得純化的大豆凝集素。稱取純化的大豆凝集素2.0mg，溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為2.0mg/mL的溶液，過0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0021]經(jīng)測定，以上實(shí)例所得大豆凝集素，約含有蛋白95.5 %，總糖1.1%，灰分1.8%及水分 1.6 %o
[0022]實(shí)施例3
將大豆乳清調(diào)至pH 4.8,9500rpm離心30min，除沉淀；再次調(diào)至pH 9.0,9500rpm離心30min，棄沉淀，收集上清液。將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.7，量取1.5L溶液，在4_30°C下按照硫酸錢飽和度表加入固體硫酸錢至50%飽和度，9500rpm離心30min，收集沉淀，上清液繼續(xù)添加硫酸銨至80%飽和度，再次9500rpm離心30min，收集沉淀，合并兩次沉淀，得到含有大豆凝集素蛋白粗品約1.57g，加入30mL去離子水溶解，截留分子量3500透析脫鹽48小時，真空冷凍干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白樣品。
[0023]分別精確稱取0.4g上述初級分離的P-7S蛋白樣品及0.4g聚陰離子多糖粉末，分別溶解于10mL去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為0.4%均一蛋白及多糖貯液，分別調(diào)節(jié)pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中緩慢加入v/v 3.3%聚陰離子多糖溶液，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至5.0，4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次重復(fù)I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物。
[0024]將得到的大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.0，過截留分子量為300kD的超濾膜除糖，收集濾過液；截留分子量4000超濾脫鹽，即得純化的大豆凝集素。稱取純化的大豆凝集素3.0mg，溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為3.0mg/mL的溶液，過0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測蛋白純度，并做SDS-PAGE電泳分析。
[0025]經(jīng)測定，以上實(shí)例所得大豆凝集素，約含有蛋白95.2 %，總糖1.8%，灰分1.6 %及水分1.4 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于步驟如下: (1)大豆乳清的預(yù)處理:將大豆乳清調(diào)至pH4.5-4.8，9500rpm離心30min，除沉淀；再次調(diào)至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，即得大豆乳清液； 用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH ； (2)大豆乳清蛋白的初級分離:取步驟(I)所得大豆乳清液，調(diào)節(jié)pH至4.5，在4-30°C下加入硫酸錢至終飽和度為50%，9500rpm離心30min，收集沉淀，繼續(xù)向上清中添加硫酸錢至飽和度60%-80%，9500rpm離心30min，收集沉淀；合并兩次沉淀，加入去離子水溶解，使沉淀的質(zhì)量濃度為1%_10%，截留分子量3500透析脫鹽36-72h，截留液用真空冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白； (3)大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復(fù)凝聚:將步驟(2)制備的P-7S蛋白，用去離子水配制終濃度為0.1%-0.4%的P-7S大豆乳清蛋白液，調(diào)節(jié)pH至7.0，待用；配制0.1%_0.4%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)PH至7.0 ;向P-7S大豆乳清蛋白液中緩慢加入按P-7S大豆乳清蛋白液體積計(jì)2.5%-8%的聚陰離子多糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0-4.5，4000rpm離心20min，收集沉淀；對上清液再次重復(fù)沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物； (4)回收大豆凝集素:將步驟(3)所得大豆凝集素與聚陰離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0-9.0，過超濾膜除糖，收集濾過液；截留分子量3000-4000超濾脫鹽，截留液用真空冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，即得純化的大豆凝集素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于:所述聚陰離子多糖包括但不限于卡拉膠，硫酸酯化半乳聚糖及硫酸酯化多糖，阿拉伯膠，海藻酸鈉或果膠；其相對分子量范圍為300-2000kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于步驟(I)所述大豆乳清的來源:收集常規(guī)的大豆分離蛋白生產(chǎn)形成的副產(chǎn)物或?qū)嶒?yàn)室利用脫脂豆柏經(jīng)醇洗后，提取分離蛋白后所得的大豆蛋白乳清液，進(jìn)行預(yù)處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于大豆乳清的預(yù)處理步驟為:首先將大豆蛋白乳清液調(diào)節(jié)PH至4.5-4.8，靜止l-2d，離心，除雜蛋白完全，再調(diào)節(jié)至pH 8.0-10.0，9500rpm離心30min，收集上清液，即得大豆乳清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于:步驟(4)中超濾膜除糖截留分子量范為100-300kD ;脫鹽處理包括但不限于透析，超濾，納濾，需保證脫鹽完全。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，其特征在于:所述PH調(diào)節(jié)劑為:調(diào)節(jié)酸性:有機(jī)酸:包括但不限于甲酸、乙酸；無機(jī)酸:包括但不限于鹽酸，硫酸；優(yōu)先選擇無機(jī)酸；調(diào)節(jié)堿性:包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，優(yōu)先選擇氫氧化鈉。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從大豆乳清中分離純化大豆凝集素的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括以下步驟：（1）大豆乳清的預(yù)處理；（2）大豆乳清蛋白的初級分離；（3）大豆乳清蛋白與聚陰離子多糖復(fù)凝聚；（4）回收大豆凝集素。原料經(jīng)預(yù)處理、初級分離后復(fù)凝聚得到終蛋白多糖復(fù)合物；所得終蛋白多糖復(fù)合物經(jīng)超濾除糖，二次離心后即得含有純化大豆凝集素的蛋白溶液，該蛋白溶液經(jīng)過真空冷凍干燥得到大豆凝集素高純度樣品。本發(fā)明對大豆乳清綜合利用，設(shè)備要求低，操作簡單，無環(huán)境污染。且大豆凝集素回收率高，純度高，蛋白活性高，仍然保持天然的生理活性。
【IPC分類】C07K14-42, C07K1-34
【公開號】CN104530207
【申請?zhí)枴緾N201410786151
【發(fā)明人】華欲飛, 李興飛, 孔祥珍, 張彩猛, 陳業(yè)明
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月18日