從絕經(jīng)婦女尿中提取尿促卵泡素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及從絕經(jīng)婦女尿液中提取尿促卵泡素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卵泡刺激素(促卵泡激素，follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，受下丘腦分泌的促卵泡激素釋放激素控制。FSH具有調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)、性成熟和繁殖等作用，在生殖過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。FSH可促使男性生精上皮發(fā)育、刺激精子發(fā)生和精子成熟；FSH對(duì)女性的功能為刺激卵泡發(fā)育、促使卵泡成熟、促進(jìn)排卵，可刺激多個(gè)卵泡發(fā)育、抑制卵巢閉鎖、誘導(dǎo)芳香酶活性、刺激顆粒細(xì)胞增生及誘導(dǎo)黃體生成素(LH)和催乳素(PRL)受體產(chǎn)生。
在月經(jīng)周期中，血中FSH濃度及每日由尿排泄的卵泡刺激素的量隨周期變化而變化。在停經(jīng)后，血和尿中卵泡刺激素排出量增加。因此取自絕經(jīng)期婦女尿液制備尿促性素(亦稱為絕經(jīng)期尿促性腺激素，絕經(jīng)促性素，喜美康，絕經(jīng)后促性腺激素)，含促卵泡素(FSH)與黃體生成素(LH)，可分離得到高純化的尿促卵泡素。
[0003]FSH主要用于無(wú)排卵患者:包括對(duì)克羅米酚無(wú)反應(yīng)的多囊卵巢綜合征患者。在輔助生殖技術(shù)中，如體外受精(IVF)、配子輸卵管內(nèi)移植(GIFT)及合子輸卵管內(nèi)移植(ZIFT)患者的超排卵。
[0004]用現(xiàn)有的方法提取尿促卵泡素是相當(dāng)困難的。1988年06月切薩雷.西羅諾公司研宄院公開了一種尿促卵泡激素的制備方法(88103966.7)，其采用免疫層析和逆相HPLC從絕經(jīng)后的尿促性腺激素提取尿促卵泡素。1999年07月伊萊利利公司申請(qǐng)了 FSH和FSH變體制劑，產(chǎn)品和方法(99808813.7)，其是關(guān)于FSH制劑及其制劑的生產(chǎn)方法。上述關(guān)于FSH的生產(chǎn)方法成本高，不易操作，而本發(fā)明降低了生產(chǎn)成本，工藝簡(jiǎn)單。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是從絕經(jīng)婦女尿液中提取尿促卵泡素。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:利用高嶺土吸附，氨水脫附，丙酮沉淀析出將絕經(jīng)婦女尿中含有的尿促卵泡素提取出來(lái)，包括如下步驟:
(1)吸附工序:稱取合格尿液重量，過(guò)濾，調(diào)節(jié)尿液pH到3.5-5.0，加高嶺土，高嶺土與尿液的重量比為1:150-1:250，攪拌溶解2-4小時(shí)，調(diào)pH3.5-5.0 ;離心脫水，取白色沉淀物；用pH4.0-5.0的醋酸溶液洗滌二次，醋酸溶液與尿液的重量比為1:200-1:300，脫水，得高嶺土吸附物并稱其重量；
(2)脫附工序:脫水后的高嶺土吸附物，加水溶解，水的體積與脫水后的高嶺土吸附物重量比為3:1-5:1 ;加20%-30%的氨水，加入氨水的體積與脫水后的高嶺土吸附物重量比為7:1-9:1，調(diào)節(jié)pH至10 -12，攪拌洗脫1-3小時(shí);離心，取上層清液，調(diào)pH8.0±0.9，靜置
1-3小時(shí)，離心取上清液； (3)丙酮沉淀:上清液調(diào)pH4.5-5.5，加丙酮，加入的丙酮與上清液的體積比為1.5:1-3:1，放置10-18小時(shí)；虹吸棄去上層液體，過(guò)濾；
(4)干燥工序:將過(guò)濾物取出，干燥，將干燥物研磨成粉末即得粗制品，置干燥器中，陰涼處保存。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0008]實(shí)施例1
所述的利用高嶺土吸附，氨水脫附，丙酮沉淀析出將絕經(jīng)婦女尿中含有的尿促卵泡素提取出來(lái)，包括如下步驟:
I吸附工序:
1.1稱取合格尿液10噸，用二層紗布過(guò)濾，濾入陶瓷缸中；
1.2不斷攪拌，緩緩加入醋酸，調(diào)節(jié)尿液PH3.5，加入高嶺土67Kg，攪拌2小時(shí)，使高嶺土全部溶解。在攪拌的同時(shí)，測(cè)定PH，保持pH在3.5-4.0之間；
1.3離心脫水，取白色沉淀物；
1.4用pH4.0醋酸溶液50L，洗滌二次，脫水，得高嶺土吸附物106Kg。
[0009]2脫附工序:
2.1將脫水后的高嶺土吸附物放在搪瓷桶中，加入318 L水?dāng)嚢枞芙猓?br> 2.2在4-8°C條件下，加2 O %氨水742 L，調(diào)節(jié)pH并保持在10.0-10.5之間，攪拌洗脫60分鐘；
2.3離心，取上層清液；
2.4沉淀物按2.2，重復(fù)操作一次，得上層清液；
2.5合并二次上清液，共1341 L，用醋酸調(diào)ρΗ8.0 ±0.3，靜置60分鐘，離心取上清液，將濾餅棄去；
3丙酮沉淀
3.1上清液用醋酸調(diào)ρΗ4.8±0.3，加2012 L丙酮，稍攪拌后，放置I O小時(shí)；
3.2 虹吸棄去上層液體，過(guò)濾底部絮狀沉淀物，待過(guò)濾物即將抽干時(shí)，加入少量丙酮洗滌一次，再抽干。
[0010]4干燥工序
4.1將過(guò)濾物取出，在用五氧化二磷作干燥劑的真空干燥器中干燥，得干燥物。
[0011]4.2將干燥物研磨成粉末即得粗制品410 g，置干燥器中，陰涼處保存。
[0012]實(shí)施例2 I吸附工序:
1.1稱取合格尿液5噸，用二層紗布過(guò)濾，濾入陶瓷缸中；
1.2不斷攪拌，緩緩加入醋酸，調(diào)節(jié)尿液pH5.0，加入高嶺土 20Kg，攪拌4小時(shí)，使高嶺土全部溶解。在攪拌的同時(shí)，測(cè)定PH，保持pH在4.5-5.0之間；
1.3離心脫水，取白色沉淀物；
1.4用pH4.0醋酸溶液17L，洗滌二次，脫水，得高嶺土吸附物42Kg。
[0013]2脫附工序: 2.1將脫水后的高嶺土吸附物放在搪瓷桶中，加入210 L水?dāng)嚢枞芙猓?br> 2.2在4-8°C條件下，加2 0%氨水378 L，調(diào)節(jié)pH并保持在11.5-12.0之間，攪拌洗脫180分鐘；
2.3離心，取上層清液；
2.4沉淀物按2.2，重復(fù)操作一次，得上層清液；
2.5合并二次上清液，共880 L，用醋酸調(diào)pH8.5 ±0.4，靜置180分鐘，離心取上清液，將濾餅棄去；
3丙酮沉淀
3.1上清液用醋酸調(diào)ρΗ5.0 + 0.2，加2640 L丙酮，稍攪拌后，放置18小時(shí)；
3.2 虹吸棄去上層液體，過(guò)濾底部絮狀沉淀物，待過(guò)濾物即將抽干時(shí)，加入少量丙酮洗滌一次，再抽干。
[0014]4干燥工序
4.1將過(guò)濾物取出，在用五氧化二磷作干燥劑的真空干燥器中干燥，得干燥物。
[0015]4.2將干燥物研磨成粉末即得粗制品211 g，置干燥器中，陰涼處保存。
[0016]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.從絕經(jīng)婦女尿中提取尿促卵泡素的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)吸附工序:稱取合格尿液重量，過(guò)濾，調(diào)節(jié)尿液pH，加高嶺土，攪拌溶解，調(diào)pH;離心脫水，取白色沉淀物；洗滌二次，脫水，得高嶺土吸附物并稱其重量； (2)脫附工序:脫水后的高嶺土吸附物，加水溶解，加氨水，調(diào)節(jié)pH，攪拌洗脫；離心，取上層清液，調(diào)pH，靜置，離心取上清液； (3)丙酮沉淀:上清液調(diào)pH，加丙酮，放置10-18小時(shí)；虹吸棄去上層液體，過(guò)濾； (4)干燥工序:將過(guò)濾物取出，干燥，將干燥物研磨成粉末即得粗制品，置干燥器中，陰涼處保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，用醋酸，調(diào)節(jié)尿液pH到3.5-5.0 ;高嶺土與尿液的重量比為1:150-1:250，攪拌2-4小時(shí)，調(diào)pH3.5-5.0 ；用PH4.0-5.0的醋酸溶液洗滌，醋酸溶液與尿液的重量比為1:200-1:300。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，水的體積與脫水后的高嶺土吸附物重量比為3:1-5:1 ;加入的20%-30%氨水的體積與脫水后的高嶺土吸附物重量比為7:1-9:1 ;調(diào)節(jié)pH值至10 -12 ;攪拌洗脫1_3小時(shí)；離心后調(diào)節(jié)pH8.0±0.9，靜置1_3小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，調(diào)節(jié)pH值至4.5-5.5 ;加入的丙酮與上清液的體積比為1.5:1-3:1。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從絕經(jīng)婦女尿中提取尿促卵泡素的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用高嶺土吸附，氨水脫附，丙酮沉淀析出將絕經(jīng)婦女尿中含有的尿促卵泡素提取出來(lái)。本法每噸可得40克以上尿促卵泡素。
【IPC分類】C07K1-30, C07K14-59, C07K1-36, C07K1-14
【公開號(hào)】CN104530217
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410807922
【發(fā)明人】劉冠男, 劉君, 孫延年
【申請(qǐng)人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日