一種固相合成比伐蘆定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及固相合成比伐蘆定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中文名：比伐蘆定
[0003] 漢語拼音：Bifaluding
[0004] 英文名稱：Bivalirudin
[0005] 藥物別名：比瓦爾丁
[0006] 英文別名：Angiomax ;
[0007] 氨基酸序列： D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu -Tyr-Leu-OH
[0008] 化學(xué)文摘（CAS)號：128270-60-0
[0009] 分子式：C98Hl38N24〇33
[0010] 分子量：2180. 33
[0011] CAS 名稱： D-Phenylalany1-L-proIy1-L-arginyl-L-proIylglycylglycylglycyIglycy1-L-asparaginylglycyl-L-a -aspartyl-L-phenylalanyl-L-a -glutamyl-L-a -gluta myl-L-isoleucyl- L-prolyl-L-α -glutamyl-L-α -glutamyl-L-tyrosyl-L-leucine
[0012] 分子結(jié)構(gòu)式：
【主權(quán)項】
1. 一種固相合成法合成比伐蘆定的方法，其特征在于，包括如下步驟： 以Fmoc-Leu-載體樹脂為起始原料，按照固相偶聯(lián)合成的方法一次連接具有Fmoc保護 基團的氨基酸，獲得保護的二十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用縮合劑進(jìn)行接肽 反應(yīng)，獲得保護的二十肽樹脂后，進(jìn)行脫側(cè)鏈保護及裂解，獲得比伐蘆定粗品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所用Fmoc-Leu-載體樹脂替代度為： 0.6_L4mmol/g。優(yōu)選為 0.6_0.8mmol/g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述載體樹脂選自：Trityl-Cl樹脂、 4-Methyltrityl-Cl 樹脂、4-Methoxytrityl-Cl 樹脂或 2-C1 Trity-Cl 樹脂；Wang 樹脂或 對羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：當(dāng)載體樹脂為Wang樹脂時，F(xiàn)moc-Leu-OH 與載體樹脂偶聯(lián)的方法為：Fmoc-Leu-OH的羧基與樹脂中的羥基在縮合劑的作用下發(fā)生偶 聯(lián)反應(yīng)而接入保護氨基酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：Wang樹脂反應(yīng)前需要溶脹試劑，溶脹試劑 選自N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基嗎啡啉（NMM)、二甲基亞砜。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：偶聯(lián)時需添加縮合試劑和活化試劑， 縮合試劑選自：N，N'_二異丙基碳二亞胺（DIC)、N，N'_二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)、六氟磷 酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop)、2-(7_偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N' -四 甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)、0-苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU)、N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，活化劑選自：1-羥 基苯并三唑（H0BT)或N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑（H0AT)中的一種，催化劑為4-二甲氨 基吡啶（DMAP)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：偶聯(lián)時所用于溶劑選自：N，N-二甲基甲 酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基嗎啡啉（NMM)、二甲基亞砜（DMS0)中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的具有Fmoc保護基團的氨基酸分 別為：Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Phe-〇H> Fmoc-Asp (OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：脫側(cè)鏈保護及裂解使用的酸解試劑選自： 三氟乙酸（TFA)、1，2-乙二硫醇（EDT)的混合溶劑，其用量為每克肽樹脂對應(yīng)5-15mL;酸解 試劑的混合溶劑的配比為：TFA的體積分?jǐn)?shù)為90-95%，EDT的體積分?jǐn)?shù)為5-10%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟如下： 制備 Fmoc-Leu-Wang 樹脂： 將200gWang樹脂（100?200目，1. lmmol/g)用800mLDCM浸泡30分鐘，抽干。在上述 樹脂中，在氮氣攪拌的條件下加入DMAP2. 96g、Fmoc-Leu-0H233. 2g(FW:353. 1)、DIC 100mL、 HoBt 90g和DMF 800mL，室溫反應(yīng)8小時；反應(yīng)結(jié)束后抽干溶液，DMF洗滌兩次，抽干，加入 吡啶和乙酸酐溶液900mL打封閉，反應(yīng)4小時；反應(yīng)結(jié)束后抽干溶液，DMF洗滌六次，抽干， 加入甲醇溶液800mL收縮樹脂體積6分鐘。抽干液體，氮氣吹干，獲得Fmoc-Leu-Wang樹脂 258g〇 封閉后Fmoc-Leu-Wang樹脂的替代度為0. 71mmol/g ; 制備側(cè)鏈全保護比伐蘆定肽樹脂： Fmoc-Leu-Wang樹脂17. 46g，加入DMFlOOmL溶脹30分鐘，抽干DMF，加入25 %脫保護試劑150mL，脫保護25分鐘，用DMF洗滌六次，抽干，加入用DMFlOOmL溶解的 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物，接肽反應(yīng)2小 時，反應(yīng)終點以茚三酮檢測陰性為準(zhǔn)，抽干，用DMF洗滌兩次，抽干，重復(fù)以上步驟，按照比 伐蘆定肽序逐一與相應(yīng)的Fmoc保護氨基酸偶聯(lián)，各Fmoc保護氨基酸的摩爾當(dāng)量與前述 Fmoc-Tyr (tBu) -0H相同，依次連接的保護氨基酸為： Fmoc-Tyr (tBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Pr〇-〇H> Fmoc-Ile-OH、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn(Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc_Gly-Gly-〇H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH 制得側(cè)鏈全保護比伐蘆定肽樹脂，其結(jié)構(gòu)如下： NH2-D-Phe-Pr〇-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (0 tBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 樹脂； 制備比伐戶定粗品： 在 NH2-D-Phe-Pr〇-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe_G lu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 樹脂中，加入預(yù) 冷至-20°C的裂解試劑（TFA/EDT = 475mL/25mL，體積比），常溫裂解反應(yīng)2小時，減壓過濾， 收集濾液，用1500mL乙醚沉淀，減壓抽干，獲得比伐蘆定粗品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固相合成比伐蘆定的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟：以Wang樹脂為起始原料，合成Fmoc-Leu-載體樹脂，在Fmoc-Leu-Wang樹脂上通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相應(yīng)的Fmoc-保護氨基酸，得到比伐蘆定樹脂，接入X片段時，用固相偶聯(lián)合成反應(yīng)，X片段對應(yīng)的Fmoc-保護氨基酸為Fmoc-Gly-Gly-OH。本發(fā)明的方法避免了工藝雜質(zhì)比伐蘆定[-Gly]、工藝雜質(zhì)比伐蘆定[+Gly]的產(chǎn)生，大大降低了純化的難度，提高了產(chǎn)品的收率。
【IPC分類】C07K1-06, C07K1-04, C07K14-815
【公開號】CN104530224
【申請?zhí)枴緾N201510005428
【發(fā)明人】冷國慶, 楊文龍, 王麗莉, 姚澤宇, 沈清波, 田輝, 張琪, 李迎新
【申請人】哈爾濱吉象隆生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月7日