一種純化肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，屬于疫苗領(lǐng)域；本發(fā)明涉及一種純化莢膜多 糖的方法，具體地涉及一種不使用苯酚抽提、純化肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌是一種引起肺炎類疾病以及中耳炎、鼻竇炎、氣管炎等上呼吸道感染 疾病的主要致病菌，嚴(yán)重時(shí)通過血液循環(huán)系統(tǒng)可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟瓣膜及骨關(guān)節(jié)感 染。目前通過注射多價(jià)肺炎莢膜多糖疫苗是降低2歲以上兒童及高位感染人群感染肺炎鏈 球菌的有效手段。
[0003] 在肺炎鏈球菌發(fā)酵過程中菌體除合成莢膜多糖之外，同時(shí)合成大量的蛋白質(zhì)、核 酸等成分，作為莢膜多糖純化過程中存在的主要雜質(zhì)成分，20世紀(jì)80年代世界衛(wèi)生組織 (WHO)及《歐洲藥典》在肺炎多糖疫苗和肺炎多糖結(jié)合疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)，均對(duì)純化的肺 炎鏈球菌莢膜多糖中的蛋白質(zhì)含量、核酸含量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。
[0004] 由于不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖化學(xué)性質(zhì)不同，發(fā)酵過程中合成的蛋白質(zhì)、 核酸等雜質(zhì)性質(zhì)及含量亦有所區(qū)別，因此，每種血清型莢膜多糖均需要用有機(jī)溶劑（低級(jí) 醇、氯仿、丙酮、苯酚等）分步沉淀、酶消化、超濾等方法去除蛋白質(zhì)及核酸的污染，但是，迄 今沒有一種通用的方法能夠純化23種血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖，在生產(chǎn)中，均采用針對(duì) 不同血清型莢膜多糖分別進(jìn)行純化的工藝。
[0005] 對(duì)于現(xiàn)有的肺炎鏈球菌莢膜多糖純化工藝而言，目前上市的肺炎產(chǎn)品中（如23價(jià) 肺炎球菌多糖疫苗），肺炎球菌莢膜多糖純化過程中，多使用大量苯酚、氯仿、丙酮等對(duì)于人 體和環(huán)境有害的有機(jī)溶劑，這種方法的缺點(diǎn)在于有機(jī)溶劑萃取過程中，劇烈震蕩會(huì)導(dǎo)致多 糖降解、斷裂或者失去初始空間構(gòu)象，純化出來的多糖免疫原性有所損失。同時(shí)這些有機(jī)試 劑在純化過程中需多次使用，不僅增加了操作步驟和時(shí)間，而且增大了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 因此，如何簡化莢膜多糖的純化工藝，同時(shí)減少或避免該類有毒有害化學(xué)試劑的 使用，采用一種更為簡便、溫和、環(huán)境友好的方法純化莢膜多糖，在提高多糖回收率的同時(shí)， 降低蛋白質(zhì)核酸等雜質(zhì)的含量，是優(yōu)化、改進(jìn)肺炎鏈球菌疫苗生產(chǎn)工藝，提高肺炎球菌多糖 疫苗質(zhì)量的行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)，也是目前亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種無苯酚抽提的肺炎鏈球菌莢膜 多糖的純化方法，從而將純化工藝最大程度地進(jìn)行簡化，而保留了純化的效率和純化產(chǎn)品 的免疫原性，本發(fā)明的方法中，不添加苯酚等對(duì)人體危害較大的有機(jī)溶劑，從而在高回收率 地獲取穩(wěn)定的莢膜多糖抗原的同時(shí)，極大程度降低了純化工藝對(duì)環(huán)境的污染，代表了生物 制藥行業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。
[0008] 本發(fā)明的方法是通過利用蛋白酶和核酸酶將蛋白質(zhì)和核酸降解為小分子片段，通 過后續(xù)超濾等純化步驟去除蛋白酶、核酸酶、經(jīng)酶解的小分子蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)而得以 實(shí)現(xiàn)的。
[0009] 具體來說，本發(fā)明提供了一種純化肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法，即利用蛋白酶和 核酸酶在特定的反應(yīng)條件下通過酶催化反應(yīng)將蛋白質(zhì)和核酸降解為小分子片段，后續(xù)工藝 中通過超濾、層析等純化工藝進(jìn)一步精純，得到符合WHO、歐盟、英國等藥典的莢膜多糖。與 傳統(tǒng)使用多次苯酚抽提去除蛋白質(zhì)、氯仿抽提等純化方法相比，該工藝反應(yīng)條件溫和、操作 簡便、過程更易于控制，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，不使用酚類、氯仿、丙酮等有毒有害化學(xué)試 劑，對(duì)環(huán)境、人員友好，在獲取莢膜多糖高回收率的同時(shí)降低了蛋白質(zhì)及核酸含量。
[0010] 從而，本發(fā)明提供了一種無苯酚抽提，利用蛋白酶和核酸酶通過酶催化反應(yīng)將蛋 白質(zhì)和核酸降解為小分子片段，然后通過純化進(jìn)一步精純，得到純化莢膜多糖。
[0011] 具體來說，本發(fā)明從肺炎鏈球菌發(fā)酵液中純化莢膜多糖的方法以滅活發(fā)酵液為初 始料液，經(jīng)澄清、超濾和低級(jí)醇沉淀得到醇沉上清液，超濾后利用蛋白酶和核酸酶通過酶催 化反應(yīng)進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì)，后通過純化工藝進(jìn)一步精純，得到純化莢膜多糖。
[0012] 更具體地，本發(fā)明的從肺炎鏈球菌發(fā)酵液中純化莢膜多糖的方法包括下列5個(gè)步 驟：
[0013] (1)23個(gè)肺炎鏈球菌血清型分別發(fā)酵、滅活和純化。具體操作為，23個(gè)血清型中的 任一個(gè)肺炎鏈球菌血清型進(jìn)行發(fā)酵后，肺炎鏈球菌將其發(fā)酵液經(jīng)裂解滅活、細(xì)胞碎片去除、 超濾濃縮后，獲得超濾濃縮液；
[0014] (2)向超濾濃縮液中加入鈉鹽，加入低級(jí)醇，沉淀，再經(jīng)離心或者過濾，收集低級(jí)醇 沉上清液，對(duì)所述上清液超濾，獲得醇沉上清超濾液；優(yōu)選地，所述鈉鹽為醋酸鈉；
[0015] (3)向所述醇沉上清超濾液中分別加入核酸酶和蛋白酶進(jìn)行酶處理，酶催化反應(yīng) 結(jié)束后得酶切反應(yīng)液；
[0016] (4)超濾濃縮所述酶切反應(yīng)液以去除核酸酶、蛋白酶以及經(jīng)酶切處理產(chǎn)生的寡聚 核苷酸、多肽、核苷酸、氨基酸等小分子雜質(zhì)，超濾后獲得酶切超濾液；
[0017] (5)所述酶切超濾液經(jīng)親和離子交換層析進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)、核酸、蛋白酶與核酸 酶的去除，再經(jīng)超濾，除菌過濾后，得到純化的各血清型的莢膜多糖原液，低溫保存。
[0018] 具體來說，其中的步驟（1)中細(xì)胞碎片去除是通過離心方式而實(shí)現(xiàn)的。更具體來 說，其中的步驟（1)中，將肺炎鏈球菌血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清 型6B、血清型7F、血清型8、血清型9V、血清型9N、血清型10A、血清型11A、血清型12F、血清 型14、血清型15B、血清型17F、血清型18C、血清型19A、血清型19F、血清型20、血清型22F、 血清型23F或血清型33F的發(fā)酵液經(jīng)裂解滅活、細(xì)胞碎片去除（離心）、超濾透析后，獲得超 濾濃縮液。
[0019] 具體地，其中的步驟（2)所采用的低級(jí)醇優(yōu)選選自乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、 2_ 丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇或丙二醇中的一種或幾種。優(yōu)選地，其中的步 驟（2)向超濾濃縮液中加入低級(jí)醇至體積百分比終濃度為10?40%。優(yōu)選地，其中的步驟 (2)向超濾濃縮液中加入鈉鹽至質(zhì)量百分比終濃度為1?8%。優(yōu)選地，其中的步驟⑵中 的沉淀時(shí)間在4小時(shí)以上，更優(yōu)選為沉淀過夜。優(yōu)選地，其中的步驟（2)中的沉淀步驟的溫 度控制在2-8°C，更優(yōu)選為3-6°C，最優(yōu)選為4°C。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（2)是向超濾濃縮液中先加入鈉鹽至質(zhì)量百分比終濃度為1?8%， 再加入選自乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇或 丙二醇中的一種或幾種的低級(jí)醇，至體積百分比終濃度為10?40%，于2-8°C沉淀過夜，離 心或者過濾收集低級(jí)醇上清液，并對(duì)所述上清液超濾，獲得醇沉上清超濾液。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（3)中加入的核酸酶選自非限制性核酸內(nèi)切酶及其他限制性或非限 制性核糖核酸酶、或脫氧核糖核酸酶中的一種或多種。
[0022] 優(yōu)選地，其中的步驟（3)中加入的蛋白酶選自蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和 枯草桿菌蛋白酶中的一種或多種。
[0023] 優(yōu)選地，其中的步驟（3)中，調(diào)節(jié)醇沉上清超濾液的pH值為6. 5-9. 5,加入氯化鎂 溶液使得Mg2+濃度為O-lOmM，加入核酸酶至醇沉上清超濾液中，使得核酸酶的終濃度為0? 50U/ml，在 20-40°C 下酶處理 2-8h。
[0024] 優(yōu)選地，其中的步驟（3)中，核酸酶處理結(jié)束后，調(diào)節(jié)經(jīng)核酸酶處理的料液的pH值 為6. 5-9. 5,加入氯化鈣溶液至Ca2+濃度為2-10mM，加入蛋白酶，至料液中蛋白酶的終濃度 為5?50mg/L，反應(yīng)溫度為20°C -40°C，酶處理2-10h。
[0025] 步驟（3)中，向所述醇沉上清超濾液中分別加入核酸酶（具體為非限制性核酸內(nèi) 切酶及其他限制性或非限制性核糖核酸酶、或脫氧核糖核酸酶中的一種或多種）和蛋白酶 (具體為蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶中的一種或多種）。其中，醇沉 上清超濾液中核酸酶的終濃度為〇?50U/ml，pH值為6. 5-9. 5,0-IOmM Mg2+，酶處理2-8h ; 料液中蛋白酶的終濃度為5?50mg/L，pH值為6. 5-9. 5,反應(yīng)溫度為20°C _40°C，在2-10mM Ca2+條件下進(jìn)行酶處理2-10h，酶催化反應(yīng)結(jié)束后得酶切反應(yīng)液。
[0026] 更優(yōu)選地，醇沉上清超濾液中核酸酶的終濃度為10?40U/ml，pH值為7. 5-8. 5， O-IOmM Mg2+，酶處理3-6h ;料液中蛋白酶的終濃度為15?40mg/L，pH值為7. 5-8. 5,反應(yīng)溫 度為25°C -35°C，在4-8mM Ca2+條件下進(jìn)行酶處理4-6h，酶催化反應(yīng)結(jié)束后得酶切反應(yīng)液。
[0027] 優(yōu)選地，步驟（4)中，超濾并濃縮所述酶切反應(yīng)液以去除核酸酶、蛋白酶以及經(jīng)酶 切處理產(chǎn)生的寡聚核苷酸、多肽、核苷酸、氨基酸等小分子雜質(zhì)，超濾后獲得酶切超濾液。
[0028] 優(yōu)選地，步驟（5)中，所述酶切超濾液經(jīng)親和離子交換層析進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)、核 酸、蛋白酶與核酸酶的去除，再經(jīng)超濾，除菌過濾，得到純化的各血清型的莢膜多糖原液。更 優(yōu)選地，步驟（5)中，膜無菌過濾后制得多糖原液，于2-8°C保存。
[0029] 更加優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種無苯酚抽提，利用蛋白酶和核酸酶去除蛋白質(zhì)和 核酸的肺炎鏈球菌莢膜多糖的，具體來說，該方法包括下列步驟：
[0030] 1.肺炎鏈球菌血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6B、血清型 7F、血清型8、血清型9V、血清型9N、血清型10A、血清型11A、血清型12F、血清型14、血清型 15B、血清型17F、血清型18C、血清型19A、血清型19F、血清型20、血清型22F、血清型23F和 血清型33F的發(fā)酵液經(jīng)裂解滅活、離心去除細(xì)胞碎片、超濾透析后，獲得超濾濃縮液。
[0031] 2.向超濾濃縮液中加入鈉鹽至終濃度為1?8%，加入低級(jí)醇（具體為乙醇、1-丙 醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙