的基因重組菌株及選育方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種生產(chǎn)紐莫康定Btl的基因重組菌株及 選育方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棘白菌素類抗真菌藥物為一種新型的脂肽類化合物，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)抑制真菌細(xì)胞壁 中特有的β-1-3-葡聚糖合酶活性進(jìn)而抑制真菌細(xì)胞壁的合成，且對(duì)人體不造成影響。這 種明顯不同于兩性霉素這類傳統(tǒng)抗生素藥物的作用機(jī)制，使得棘白菌素類具有廣譜性強(qiáng)、 耐藥性小、藥物間相互作用小的特點(diǎn)，成為了未來(lái)低毒、安全、廣譜性的新型抗生素的發(fā)展 方向。
[0003] 卡泊芬凈是第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的棘白菌素類抗真菌藥，由絲狀真菌Glarea Iozoyensis的次級(jí)代謝產(chǎn)物紐莫康定B ci經(jīng)化學(xué)修飾衍生而得，默克公司開(kāi)發(fā)其作為一種廣 譜的抗真菌/抗肺囊蟲(chóng)藥物?？ú捶覂粲?001年2月在美國(guó)上市，主要用于治療患有侵染 性的曲霉病而又不適合用兩性霉素 B或伊曲康唑治療的患者。除此之外，在無(wú)免疫應(yīng)答患 者中，此藥可用于曲霉病、假絲酵母病的初期治療用藥；還可用于對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的嗜中 性白細(xì)胞減少癥患者以及某些兒科適應(yīng)癥。
[0004] Glarea Iozoyensis發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定Btl的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)類似物，包括 紐莫康定Atl、紐莫康定C tl、紐莫康定B1、紐莫康定B2和紐莫康定D ^等。其中主要的結(jié)構(gòu)類似 物Atl和Ctl對(duì)后期的分離提取造成了極大的困難。默克公司對(duì)原始菌株ATCC20868進(jìn)行了誘 變選育，獲得了紐莫康定B tl高產(chǎn)菌株ATCC20957,但是該菌株的紐莫康定B ^產(chǎn)量?jī)H285mg/ L，且紐莫康定Atl含量較高，兩者濃度之比（BcZAtl)為10。隨后對(duì)ATCC20957進(jìn)行NTG誘變， 獲得了紐莫康定B tl高產(chǎn)菌株ATCC74030,紐莫康定B ^的產(chǎn)量得到的了提升，紐莫康定A ^的 含量進(jìn)一步降低，紐莫康定Bc/紐莫康定Atl為80,紐莫康定C /5%。目前紐莫康定Btl發(fā)酵 的最高產(chǎn)量為5. 2g/L。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能穩(wěn)定高產(chǎn)紐莫康定Btl且副產(chǎn)物少的基因重組菌。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供選育該基因重組菌的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是利用該基因重組菌發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定Btl的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -、一種生產(chǎn)紐莫康定Btl的基因重組菌株，其分類命名為Glarea Iozoyensis Q45,該菌株由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M 2014416,保藏時(shí) 期為2014年9月14。
[0010] 二、本發(fā)明所述的生產(chǎn)紐莫康定Btl的基因重組菌株Glarea lozoyensis Q45的選 育方法，包括下列步驟：
[0011] ⑴原生質(zhì)體的制備
[0012] 將Glarea Iozoyensis原始菌株接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌絲，用酶解液酶解， 制成原生質(zhì)體；
[0013] 2)原始突變子庫(kù)
[0014] 將步驟1)制備的原生質(zhì)體體積均分為兩組，分別采用常壓室溫等離子體（ARTP) 和氯化鋰進(jìn)行誘變處理，將獲得的突變株涂布于再生培養(yǎng)基上，挑取生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行 發(fā)酵測(cè)定紐莫康定B tl，挑選產(chǎn)量高的突變株進(jìn)行斜面?zhèn)鞔疾旆€(wěn)定性，獲得多株性質(zhì)穩(wěn)定 的高產(chǎn)突變株，形成突變子庫(kù)；
[0015] 3)原生質(zhì)體的融合
[0016] 將步驟2)得到的性狀穩(wěn)定的突變菌株，按照步驟1)制備原生質(zhì)體，每株突變株的 原生質(zhì)體都等體積均分為兩組，一組采用ARTP注入滅活，另一組采用熱滅活，將兩組滅活 后的原生質(zhì)體混合加入融合液進(jìn)行隨機(jī)融合；
[0017] 4)融合子的篩選
[0018] 通過(guò)步驟3)獲得的融合后的原生質(zhì)體用高滲緩沖離心洗滌后，涂布于再生培養(yǎng) 基上，挑取生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定紐莫康定B tl，得到紐莫康定Btl高產(chǎn)基因重組菌株；
[0019] 5)以步驟4)所得的紐莫康定Btl高產(chǎn)基因重組菌株為出發(fā)菌株，多次重復(fù)進(jìn)行步 驟3)-5)的原生質(zhì)體制備、融合、篩選工作；
[0020] 6)遺傳穩(wěn)定性考察
[0021] 對(duì)步驟5)獲得紐莫康定Btl高產(chǎn)基因重組菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，獲得一 株產(chǎn)紐莫康定B tl高且穩(wěn)定的突變株，S卩本發(fā)明所述的基因重組菌株Glarea Iozoyensis Q45〇
[0022] 三、利用本發(fā)明所述的Glarea lozoyensis Q45的菌株發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定Btl的方 法：是將Glarea lozoyensis Q45的菌絲接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中 進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定Btl。
[0023] 具體步驟包括：
[0024] 1)將斜面培養(yǎng)好的Glarea lozoyensis Q45菌株的菌絲接入到種子培養(yǎng)基中，在 24-28°C，180-300rpm條件下培養(yǎng)2-3天，得種子液；
[0025] 2)將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5-15 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 24-28°C，200-500rmp 條件下培養(yǎng) 9-11 天。
[0026] 為了提高紐莫康定Btl的產(chǎn)量，在步驟2)的發(fā)酵過(guò)程中的第3-11天，以 0· 05-0. 4g< · Γ1 · IT1的速度流加濃度為10-20% (v/v)的甘露醇。
[0027] 所述培養(yǎng)基為：種子培養(yǎng)基配方為（g/L):碳源10-70,氮源10-80, KH2PO4O-I, FeSO4 · 7H200. 005-0. 015, MnSO4 · 4H20 0. 005-0. 015, ZnSO4 · 7H20 0. 001-0. 003, CaCl2 · 2H20 0· 005-0. 015, CuCl2 · 2H20 0· 00(Π -0· 0005, H3BO3O. 0002-0. 0006，（NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.0002-0. 0006 ；
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方為（g/L):碳源40-150,氮源1-50,氨基酸0. 1-20, KH2P040-3， FeSO4 · 7H200. 005-0. 015, MnSO4 · 4H20 0. 005-0. 015, ZnSO4 · 7H20 0. 001-0. 003, CaCl2 · 2H20 0· 005-0. 015, CuCl2 · 2H20 0· 00(Π -0· 0005, H3BO3O. 0002-0. 0006，（NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.0002-0. 0006 ；
[0029] 所述碳源包括葡萄糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、蔗糖、肉豆蔻酸中 的一種或多種；所述氮源包括黃豆粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、大豆蛋白 胨、酵母粉、酵母浸出粉、玉米漿、硫酸銨、氯化銨、尿素中的一種或多種任一比例的混合物； 所述氨基酸包括谷氨酸、谷氨酸鈉、脯氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸中的 一種或多種任一比例的混合物。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] Glarea lozoyensis Q45發(fā)酵11天后紐莫康定Btl產(chǎn)量可以達(dá)到6g/L，而副產(chǎn)物 紐莫康定Q1的含量小于3%，紐莫康定A ^的含量未檢測(cè)到，因而此基因重組菌除能夠高產(chǎn) 紐莫康定Btl外，還具有副產(chǎn)物少、發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)；另外由于利用此工藝生產(chǎn)的紐莫康定 Btl有利于后續(xù)的分離提取和工藝放大，因此具有巨大的工業(yè)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 一般性說(shuō)明
[0033] PDA 培養(yǎng)基（g/L) :土豆 200,蔗糖 20。
[0034] 再生培養(yǎng)基（g/L) :NaCl 46. 7, 土豆 200,蔗糖 20,瓊脂 2. 2。
[0035] 氯化鋰再生培養(yǎng)基（g/L) :LiCl 3. 5, NaCl 46. 7, 土豆 200,蔗糖 20,瓊脂 2. 2。
[0036] 高滲緩沖液I的配制方法為：取2. 7218g KH2PO4,4. 64g NaCl加入80ml哇哈哈水 溶解，用NaOH調(diào)PH到6. 0,用水定容到IOOml ;
[0037] 高滲緩沖液II的配制方法為：0. 6mol/L的葡萄糖溶液；
[0038] 酶解液的制備方法為：取Yatalse 80g，融壁酶80g，蝸牛酶80g，用IL高滲緩沖液 I溶解。
[0039] 發(fā)酵液的預(yù)處理：
[0040] 取Iml發(fā)酵液，加入9ml乙醇，劇烈振蕩lOmin，然后離心3000rpm，lOmin，離心后 的上清用于進(jìn)一步檢測(cè)。
[0041] 紐莫康定Atl、紐莫康定Btl的檢測(cè)：
[0042] 采用戴安高效液相色譜U3000測(cè)定，其具體方法為：色譜柱，C18柱；流動(dòng)相A， 乙腈；流動(dòng)相 Β，0· 1% 的磷酸；洗脫程序，0min_20min，A:B = 40:60,20min_40min，A:B = 50:50 ;流速1.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)，210nm;檢測(cè)溫度，25°C。
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