一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株s68-cm5的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens)亦稱靈桿菌，是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌， 屬于腸桿菌科克白雷氏菌族中的沙雷氏菌屬，為該屬的代表菌種"多存在于沿海鹽堿土壤 中，能產(chǎn)生紅色非擴(kuò)散性色素一靈菌紅素（Prodigiosin)。靈菌紅素具有抗菌、抑癌、提高免 疫力等生理活性，20世紀(jì)70年代國(guó)外學(xué)者對(duì)靈菌紅素的提取、分離純化，生物合成及其特 性作了許多研宄。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌抗原寡糖片段的合成和細(xì)菌胞內(nèi)自由氨基酸庫(kù) 含量和組成進(jìn)行了研宄，但對(duì)其在植物上的應(yīng)用研宄較少。直至90年代初期美國(guó)奧爾本大 學(xué)Press等發(fā)現(xiàn)了粘質(zhì)沙雷氏菌可誘導(dǎo)煙草、黃瓜等植物產(chǎn)生抗性和抵抗多種病原物的侵 襲以后，世界上才開(kāi)始對(duì)其在植物上的應(yīng)用進(jìn)行研宄。郭堅(jiān)華等研宄表明，在溫室和田間小 區(qū)試驗(yàn)中沙雷氏菌均表現(xiàn)出對(duì)辣椒青枯病的有效生物防治作用。陳秀為等從棉田中自然死 亡的棉鈴蟲(chóng)體上分離到一株粘質(zhì)沙雷氏菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研宄，該菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)、菜青蟲(chóng)、甜菜夜蛾 具有明顯的致病力。
[0003] 幾丁質(zhì)（Chitin)又稱甲殼素或甲殼質(zhì)，是由N-乙酞-D-葡萄糖胺（NAG)通過(guò) P-1，4糖酣鍵聚合而成的直鏈型天然生物多糖，其廣泛分布于自然界中，是含量?jī)H次于纖維 素的生物高分子物質(zhì)。除蛋白質(zhì)外，它還是地球上數(shù)量最大的天然含氮有機(jī)化合物幾丁質(zhì) 酶具有多種用途，廣泛應(yīng)用予植物病原真菌的生物防治、功能性幾丁寡糖的制備，抗病基因 工程中的基因資源應(yīng)用等領(lǐng)域。幾丁質(zhì)酶存在于各種微生物、植物、動(dòng)物的組織內(nèi)，尤其廣 泛分布于各種微生物中包括細(xì)菌、放線菌和真菌共約有46個(gè)屬近70種都能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。 至目前為止，對(duì)幾丁質(zhì)酶的研宄己涉及到酶的分布！特性！定位！誘導(dǎo)！分子生物學(xué)和 基因工程等方面。幾丁質(zhì)酶還具有其它多種生理功能。Minicetal研宄表明，幾丁質(zhì)酶 可以降解固氮菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子，從而控制結(jié)瘤因子水平，使植物與根瘤菌達(dá)到共生平衡， 參與共生固氮調(diào)控。stangarlinetal的研宄表明：幾丁質(zhì)酶廣泛參與了植物光合作用等過(guò) 程，這些研宄均暗示著幾丁質(zhì)酶具有多種生理功能，可應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一株沙雷氏菌誘變菌株。
[0005]本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014 年11月14日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9973。
[0006] 本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5為革蘭氏陰性短小桿菌 (0. 6-1. 0X0. 5u)，也有呈球狀的，單個(gè)或排列成短鏈，每鏈3-6個(gè)細(xì)胞，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú) 芽孢，無(wú)莢膜。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，菌落小，有粘性，中央呈顆粒狀或光滑，有惡臭，產(chǎn)生暗紅 色或鮮紅色色素。
[0007] 生化反應(yīng)：強(qiáng)度液化明膠；牛乳凝固，產(chǎn)酸而不能胨化；分解葡萄糖，產(chǎn)酸；還原硝 酸鹽為亞硝酸鹽。
[0008] 本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5可以在Smith合成培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基和甘露醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其特點(diǎn)是具有較高的幾丁質(zhì)酶活力。
[0009] Smith合成培養(yǎng)基：C6H807 .H20 22g/L，Na2S04 0? 5g/L，葡萄糖 44g/L，KH2P04 5. 0g/ L，MgS04 ? 7H20 0? 8g/L，NaCl0? 04g/L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 04g/L，MnS04 ? 4H20 0? 04g/L(pH值 7. 7)。甘露醇培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量由1%甘露醇、1.5%牛肉膏、0.25%MgSOjP水組成 (pH值 5. 0)。
[0010] 本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5的最適發(fā)酵條件為25-30°C，搖床150-180 轉(zhuǎn) /min〇
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5在10代以內(nèi)傳代，基本上保持了遺傳穩(wěn)定 性，即使是第10代依然保持了將近87%的酶活力，與野生菌株相比有顯著提高。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為【具體實(shí)施方式】一中各誘變菌株的幾丁質(zhì)酶活力圖；圖2為【具體實(shí)施方式】一 中誘變株CM5傳代培養(yǎng)10代幾丁質(zhì)酶活力圖。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0014] 一：本實(shí)施方式粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5保藏在中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，保藏日期為2014年11月14日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9973。
[0015] 本實(shí)施方式粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5的獲得方法：
[0016] 一、原生質(zhì)體制備
[0017] 以產(chǎn)色型靈桿菌（Bacteriumprodigiosum)41003為出發(fā)菌株，配制牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基500mL，分別裝入250mL三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝45mL培養(yǎng)基，于28°C、150r/min進(jìn) 行發(fā)酵。取發(fā)酵18h的菌液10mL，16000r/min離心15min，菌體用0. 01mol/LTris緩沖液 (pH值7. 0)離心洗滌3次。再用高滲Tris緩沖液懸浮，加入預(yù)熱的溶菌酶溶液，37°C水浴 處理后，加入EDTA至0? 01mol/L，在37°C中保溫。
[0018] 所述產(chǎn)色型靈桿菌（Bacteriumprodigiosum) 41003由黑龍江省科學(xué)院微生物研 宄所提供。
[0019]Tris緩沖液：0? 01mol/LTris用HC1 調(diào)pH至 7. 0;
[0020] 高滲Tris緩沖液：Tris緩沖液中加鹿糖至0?5mol/L，]\%012至0?02mol/L，pH值 7. 0〇
[0021] 二、紫外線誘變
[0022] 取10mL上述方法制備得到的原生質(zhì)體高滲懸浮液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，放在磁力攪拌 器上，在距紫外燈30cm處攪拌狀態(tài)下照射12s，取照射后的細(xì)胞懸液，在黑暗中用SMM緩沖 液稀釋至原濃度的10-6倍，涂布，作為對(duì)照，標(biāo)記為CK。將上述平板依次編號(hào)后做避光處 理，置于30°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)對(duì)照平板上的cfu數(shù)，計(jì)算出每 mL菌落中的cfu數(shù)，并計(jì)算出各板的致死率。
[0023] SMM緩沖液：蔗糖0? 50mol/L，MgC120. 05mol/L，順丁烯二酸0? 02mol/L用NaOH調(diào) pH值至7. 5,高壓滅菌后備用。
[0024] 三、復(fù)合因素誘變
[0025] 將經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體紫外線誘變后的菌懸液再經(jīng)NaN02$變處理，用0. 4mol的NaNO^ 作用5min，稀釋至原濃度的1(T6倍后涂布初篩平板，標(biāo)記為CM，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培 養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值，并選取HC值（幾丁質(zhì)水解圈直 徑與菌落直徑比值）最大的幾個(gè)菌落，編號(hào)后轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基。共篩選10株菌，誘變結(jié) 果如下表所示：（所述的平板和斜面培養(yǎng)基是指牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5,其特征在于該菌株保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，保藏日期為2014年11月14日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9973,分類命名：粘質(zhì)沙雷氏菌 Serratia marcescens〇
【專利摘要】一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5，涉及一株粘質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株。該菌株由出發(fā)菌株經(jīng)紫外線和NaNO2復(fù)合誘變得到，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2014年11月14日，保藏編號(hào)為CGMCC No.9973，分類命名：粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens。在10代以內(nèi)傳代，基本上保持了遺傳穩(wěn)定性，即使是第10代依然保持了將近87％的酶活力，與野生菌株相比有顯著提高。CGMCC No.997320141114
【IPC分類】C12N15-01, C12N1-20, C12N13-00, C12R1-43
【公開(kāi)號(hào)】CN104531564
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410753528
【發(fā)明人】胡基華, 陳靜宇, 姜威, 孟利強(qiáng), 曹旭, 劉宇帥, 李晶, 張淑梅
【申請(qǐng)人】黑龍江省科學(xué)院微生物研究所
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月10日