一株能夠產(chǎn)生細菌素的分散泛菌及其篩選方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)與醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一株能夠產(chǎn)生細菌素的分散泛 菌及其篩選方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌素（bacteriocin)是細菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白復合 物，一般只對親緣關(guān)系較近的細菌有毒害作用，產(chǎn)生菌對其產(chǎn)生的細菌素具有自身免疫性 (一般認為，產(chǎn)生菌的自我免疫力是因為含有免疫基因，其免疫機制可能是免疫基因產(chǎn)生的 免疫蛋白通過屏蔽受體蛋白，或競爭性干擾細菌素分子、阻塞孔道以阻止細菌素形成膜通 道）。
[0003] 細菌素的來源很廣，可由革蘭氏陽性菌（G+)、革蘭氏陰性菌（G-)或某些古細菌產(chǎn) 生。其結(jié)構(gòu)多樣、無毒、無害、無殘留的良好特性日漸成了人們關(guān)注和開發(fā)的焦點。利用細 菌素來預防和治療動物疾病的研宄也日漸成為廣大科學工作者們關(guān)注關(guān)心的焦點。
[0004] 大量體外試驗結(jié)果表明，細菌素對食源性（如，李斯特氏菌、空腸彎曲菌、沙門氏 菌、大腸桿菌等）、植物源性、動物源性（如，條件致病菌一沙門氏菌、大腸桿菌等）、人源 性（抗藥菌一金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等）等各種臨床致病菌都具有良好的抑殺作用。 1988年，Klaenhammer根據(jù)分子量大小、結(jié)構(gòu)組成等不同將乳酸桿菌產(chǎn)生的細菌素分為4 類，這個分類標準也常用于其它細菌素的分類：
[0005]第1類為硫醚抗生素，該類細菌素分子量較?。ㄐ∮?0kDa)，一般含有羊毛硫氨 酸、0 -甲基羊毛硫氨酸及脫水氨基酸等異常氨基酸，這些異常氨基酸可以賦予這類細菌 素獨特的環(huán)狀剛性結(jié)構(gòu)。根據(jù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的不同又可將硫醚抗生素分為兩個亞類：A亞類是 具有螺旋狀結(jié)構(gòu)的兩性分子，一般為21-38個氨基酸殘基，分子量為2164?3488Da，帶2-7 個正電荷。B亞類硫醚抗生素含有更多的球形分子，分子中一般不超過19個氨基酸殘基，其 分子量小于A類（一般為1954?2041Da)，不帶電荷，其抑菌作用是通過酶活性來實現(xiàn)的。
[0006] 第2類為不含羊毛硫氨酸的肽。這類細菌素分子量也較低（小于10kDa)，含30-60 個氨基酸殘基，具有熱穩(wěn)定性。根據(jù)分子中特殊的N端序列、雙組分通道結(jié)構(gòu)及是否有功能 性巰基基團，這類細菌素又可分為3個亞類：IIa類是這類細菌素中最多的一類，它們的氨 基端都含有一段保守的序列（YGNGVXaaC)。與第1類的中A亞類一樣，IIa類細菌素也是通 過使敏感菌細胞膜形成通道而達到殺菌作用，如pediocinAcH、sakacinA屬于此類。IIb 類細菌素，如lacticinF、lactococcinG在革巴細胞質(zhì)膜上形成由兩種不同的蛋白質(zhì)組成的 通道。IIc類細菌素是依賴于sec分泌途徑的細菌素（如acidocinB)。
[0007] 第3類細菌素是分子量大于30KDa且不耐熱的蛋白質(zhì)。如helveticinsJ和 helveticinsV、lactacinB屬于此類。第4類細菌素結(jié)構(gòu)中包含其活性必需的脂類或碳 水化合物成分，如leuconocinS即為此類。
[0008] 在理化性能方面，大多數(shù)細菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，這可能與它們獨特的結(jié)構(gòu) 有關(guān)。多數(shù)細菌素在100°c下幾乎保持完全的活力，甚至在121°C下處理15min也僅僅損失 5%的活力。此外，細菌素不僅熱穩(wěn)定性好，其對pH值的耐受范圍也相當寬。一般而言，細 菌素在pH值3-8下活力較高，有的甚至在pHl和pH12下還保持了很高的活力，然而，多數(shù) 細菌素在pH值較低下作用更強。
[0009] 與傳統(tǒng)的廣譜抗生素相比，細菌素的抑菌譜相對較窄。而G+菌細菌素的抑菌譜 比G-菌細菌素的抑菌譜更廣，不僅可抑制各種G+菌，也可抑制G-菌。同時，G+菌細菌素 的抑菌譜范圍差別很大，如lactococcinsA、B、M僅能抑制lactococcus，而nisin、mutacin Bny266的抑菌譜相當寬，對放線菌、梭菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌等均有抑制，甚至對一 些致病的G-菌（包括彎曲桿菌、嗜血桿菌等）也可殺滅。作為抗菌藥物，雖然細菌素與抗 生素都是由微生物產(chǎn)生，但它們的產(chǎn)生機理及作用模式完全不同。細菌素是由細菌通過核 糖體途徑合成的微生物初級產(chǎn)物，屬于蛋白類物質(zhì)，其作用機理主要是在細胞膜上形成通 道。而抗生素屬于微生物次級代謝產(chǎn)物，不通過核糖體途徑合成，而是由多酶復合體合成的 物質(zhì)，其作用機理為抑制細胞壁的合成，抑制蛋白質(zhì)、DNA的合成進而抑制細菌的生長。此 夕卜，與細菌素不同的是，核糖體蛋白抑制劑并不能阻礙抗生素的合成。
[0010] 在細菌素的作用機理方面，一般認為是其作用是阻止其它微生物菌株入侵產(chǎn)生菌 占據(jù)的小生境，防止入侵微生物建立菌群并限制它們成為附近的優(yōu)勢菌群，是微生物的一 個重要防御系統(tǒng)。最近還有學者提出了細菌素的另外作用機制：干預細菌的群體感應；如 nisinA作為一種蛋白質(zhì)信息素可調(diào)控自身的表達，并且在姊妹細胞的程序性死亡中起"殺 手因子"的作用。再如，G-菌細菌素表現(xiàn)出兩種典型的殺菌模式：在敏感菌細胞膜上形成離 子通道，或表現(xiàn)出核酸酶活性以進入敏感細胞。細菌素在發(fā)生作用前必須吸附在敏感菌細 胞膜特定的受體上，屬于受體介導型吸附。與G-菌細菌素相比，G+細菌素對敏感菌的吸附 相對較弱，由于G+菌細胞壁可以允許更大的分子通過，因而不需要特定受體與之結(jié)合。無 論是硫醚細菌素還是非羊毛硫氨酸細菌素，它們都是在敏感菌質(zhì)膜上形成疏水膜通道而影 響細胞膜的滲透壓屏障，從而導致離子的滲漏、質(zhì)子動勢丟失，并最終導致細胞死亡。
[0011] 基于細菌素的良好抑菌作用，在19世紀20年代，科研人員從保加利亞農(nóng)夫糞便中 分離出一種非致病的E.coli菌株Nissle1917 (Mutaflor)，該菌對許多致病菌具有抑制作 用，后來Mutaflor臨床用于治療便秘、痢疾及傷寒癥。近年來，由于抗生素產(chǎn)生的耐藥問題 越來越嚴重，人們開始尋找可對付耐藥菌的抗生素替代藥物，其中細菌素被認為是一個潛 力很大的抗菌劑。
[0012] 有研宄報道，表皮葡萄球菌細菌素p印5對于超級病菌"MRSA"有很強的抑制力， 對于控制醫(yī)院內(nèi)感染效果很好。Oscariz等從土壤中分離出一種賭樣芽孢桿菌，它產(chǎn)生的細 菌素cerein7對萬古霉素耐藥的鳥鏈球菌及對替考拉丁耐藥的馬腸鏈球菌具有較強的抑 制活性，當某些G+致病菌對抗生素產(chǎn)生耐藥時，cerein7可提供一種新的備用治療。
[0013] 在我國，地衣芽孢桿菌制劑"整腸生"及枯草芽孢桿菌活菌制劑"白天鵝氣霧劑"在 臨床應用上也取得了很好的效果。因此，細菌素的不斷研制與應用，不僅增加了人類可利用 藥物的種類，更重要的是拓展了現(xiàn)有抗生素藥物的使用壽命，由于細菌素"策劃藥"的出現(xiàn)， 各種抗生素不再頻繁使用，這就減少了耐藥菌的選擇壓力強度。從生態(tài)和進化角度上說，具 有抗菌譜窄的抗菌藥的使用減少了多重耐藥菌的威脅，耐藥菌出現(xiàn)的頻率及擴散速度也將 變得緩慢。
[0014] 結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌。近年來，隨著多重耐藥結(jié)核病（MDR-TB)、廣泛 耐藥結(jié)核?。╔DR-TB)及與HIV共感染結(jié)核病的出現(xiàn)，使結(jié)核病疫情在世界范圍內(nèi)有回升趨 勢，成為危害人類健康的主要傳染病之一。現(xiàn)階段標準的結(jié)核病治療方案是采用WHO推薦 的"4+2"療法：前2個月用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇來強化治療，后4個月用異 煙肼和利福平持續(xù)治療。然而，該標準療法對MDR-TB、XDR-TB及HIV共感染TB沒有治療 效果。而且，過去20年幾乎沒有新型抗結(jié)核藥物上市，因此，控制結(jié)核病急需新型抗結(jié)核藥 物。
[0015] 鑒于細菌素是目前研宄較為徹底的微生物防御系統(tǒng)之一，而且由于它們種類多 樣、來源豐富，已成為人類對付致病微生物的優(yōu)選武器。因此，從尋找能夠產(chǎn)生抗結(jié)核病致 病菌的細菌素的角度出發(fā)，獲得能夠產(chǎn)生抗結(jié)核病致病菌的細菌素及其產(chǎn)生菌有望為結(jié)核 病的控制和治療開辟新的途徑。
[0016] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的目的在于提供能夠產(chǎn)生細菌素的分散泛菌；該分散泛菌可以產(chǎn)生細菌 素，能夠抑制結(jié)核病的致病菌（結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌），從而使其具有很好的臨 床使用價值。
[0018] 本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種上述分散泛菌的篩選方法，該方法以較廉價 的培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生分散泛菌（進一步產(chǎn)生活力較強的細菌素），且該方法較為簡單易行、成 本較低。
[0019] 在本發(fā)明的實施例中提供了一種能夠產(chǎn)生細菌素的分散泛菌，該菌為WH-1，屬于 泛菌屬，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo:M2014508,保藏地址為： 中國湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，郵編為430072。
[0020] 具體的，該菌的保藏時間為2014年10月23日；其分類名稱為：分散泛菌WH-1， PantoeadispersaWH-1 ;該菌菌落呈現(xiàn)微小圓形，黃色突起較厚、邊緣圓滑的特征。細胞 呈直桿狀，0. 5-1. 0ymX1-3ym，以周生鞭毛運動，能產(chǎn)生黃色素，具有代謝和發(fā)酵類型的 化能異養(yǎng)菌。能利用D-葡萄糖和其它糖類產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣。氧化酶陰性，接觸酶陽性，吲哚 陰性。賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶以及精氨酸雙水解酶皆陰性。產(chǎn)生H2S，不水解脲素，丙二酸 鹽利用在菌株間可變，可還原硝酸鹽；可發(fā)酵的糖類包括：L-阿拉伯糖、D-乳糖、麥芽糖、蔗 糖、海藻糖和木糖等。
[0021] 本發(fā)明提供的這種能夠產(chǎn)生細菌素的分散泛菌，其通過培養(yǎng)而產(chǎn)生的細菌素具有 抑制結(jié)核病病原菌（結(jié)核分支桿菌和牛結(jié)核分支桿菌）的活性，可作為藥物佐劑與一線抗 結(jié)核藥物聯(lián)合應用，對結(jié)核病以及MDR-TB、XDR-TB、HIV共感染TB進行控制治療。另外，通 過實驗證明，該菌產(chǎn)生的細菌素能夠在兩天內(nèi)降低小鼠體內(nèi)感染的結(jié)核分枝桿菌，從而使 其具有良好的臨床使用價值。
[0022] 一種所述的分散泛菌的篩選方法，包括以下步驟：
[0023] 1)、采集土壤樣品，在其中加入PBS緩沖液，震蕩混勻后過濾，得到濾液溶液；
[0024] 2)、將所述濾液溶液稀釋后與含有恥垢分枝桿菌的水瓊脂培養(yǎng)基混合，作為上層 培養(yǎng)基；
[0025] 3)、將所述上層培養(yǎng)基倒入含有7H10固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于35-39°C培養(yǎng)至 產(chǎn)生抑菌圈，分離抑菌菌落，得到所述分散泛菌。
[0026] 可選的，在步驟1)中：所述土壤樣品取自農(nóng)村有機肥周邊的濕潤土壤中，且取樣 深度為5-10cm。