用于研究人肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的細(xì)胞模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物細(xì)胞領(lǐng)域，具體地說，涉及用于研宄人肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的細(xì)胞 模型。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌是是我國發(fā)病率三位的惡性腫瘤，我國肝癌占全球一半以上。手術(shù)切除 和肝移植是肝癌有望獲得根治的唯一手段，但接近70%的患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目 前肝癌尚無有效的治療藥物（僅有的肝癌靶向藥物索拉菲尼有效率僅2-3%)。已知，抗腫 瘤藥物的療效差異主要由腫瘤細(xì)胞基因組的異常表達(dá)決定，因腫瘤基因組的不穩(wěn)定性及腫 瘤間的異質(zhì)性，抗腫瘤藥物往往僅在某一群病人身上有效。例如，靶向BCR-Abl的藥物格列 衛(wèi)在BCR-ABL融合表達(dá)的慢性粒細(xì)胞白血病病人中非常有效，五年生存率可達(dá)90%以上； 靶向EGFR的易瑞沙成功用于EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌，ALK抑制劑Crizotinib也僅批準(zhǔn) 用于EML4-ALK融合的非小細(xì)胞肺癌患者。在生物標(biāo)志物（如BCR-ABL的融合、EGFR突變、 EML4-ALK融合）的指征下，可以有效地判別對特定靶向藥物的"有效人群"和"無效人群"， 從而提高療效、降低毒副作用。肝癌藥物開發(fā)也面臨著一樣的問題，如能在藥物開發(fā)早期體 外階段篩選出其生物標(biāo)志物，可顯著降低整個藥物開發(fā)的成本，加速肝癌靶向藥物的上市 及臨床應(yīng)用。
[0003] 目前在細(xì)胞水平上篩選抗腫瘤藥物標(biāo)志物時，主要是通過關(guān)聯(lián)藥物反應(yīng)與細(xì)胞基 因組表達(dá)、擴(kuò)增和突變的差異，分析二者相關(guān)性來尋找可特異性預(yù)測藥物反應(yīng)的標(biāo)志物。而 開展此類研宄時，面臨的一大問題是：對同一種藥物敏感的不同腫瘤細(xì)胞中，基因組上往往 也存在著大量的差異（即腫瘤遺傳異質(zhì)性），這些差異中有些與藥物反應(yīng)相關(guān)、并導(dǎo)致抗腫 瘤治療的失效，然而大部分遺傳異質(zhì)性則是與藥物反應(yīng)不相關(guān)的差異，這些差異給相關(guān)性 分析帶來了無法消除的噪音，使得標(biāo)志物分析變得困難。目前公認(rèn)，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是腫瘤尚 不能被征服的最主要原因，而肝癌恰恰被認(rèn)為是異質(zhì)性最強(qiáng)的腫瘤，但業(yè)界尚無可以用來 研宄腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的肝癌細(xì)胞株。此外，ATCC(美國菌種保藏中心）可用的商用肝癌細(xì)胞 系僅有十幾株，而某一基因突變在人群中所在比例較少，需要一定量的樣本才能篩選出敏 感細(xì)胞株，因此需要建立更多的肝癌細(xì)胞株用于研宄。
[0004] 中國專利文獻(xiàn)CN:200910180628. 3公開了一種肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。該肝癌細(xì)胞 系為人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCNo. 3204,人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCNo. 3204和人肝癌 細(xì)胞株H印-11CGMCCNo. 3203可組成一種用于研宄肝癌機(jī)理的細(xì)胞模型組。該肝癌細(xì)胞系 具有很好的致瘤特性，可作為肝癌發(fā)生、肝癌發(fā)展或肝癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。但是上述細(xì)胞模 型并沒有涉及肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的研宄，因此提供一種可用于研宄人肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的細(xì)胞 模型是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種肝癌細(xì)胞模型組。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的肝癌細(xì)胞模型組的用途。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種人肝癌細(xì)胞系。
[0008] 本發(fā)明的第四個目的是，提供所述的人肝癌細(xì)胞系的用途。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] 一種肝癌細(xì)胞模型組，由保藏號為CCTCCC2014225的人肝癌細(xì)胞系HCCIH01、保 藏號為CCTCCC2014226的人肝癌細(xì)胞系HCCIH02和保藏號為CCTCCC2014227的人肝癌細(xì) 胞系HCCIH03組成。
[0011] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0012] 所述的肝癌細(xì)胞模型組在作為研宄人肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
[0013] 所述的肝癌細(xì)胞模型組在研宄FGFR抑制劑AZD4547敏感性機(jī)制，尋找AZD4547的 分子標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的肝癌細(xì)胞模型組在研宄FGFR抑制劑NVP-BGJ398敏感性機(jī)制，尋找 NVP-BGJ398的分子標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0015] 所述的肝癌細(xì)胞模型組在研宄抗腫瘤靶向藥物的敏感性機(jī)制，尋找抗腫瘤靶向藥 物的分子標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0016] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0017] 作為本發(fā)明的一種技術(shù)方案，人肝癌細(xì)胞系HCCIH01，其保藏號為CCTCC C2014225〇
[0018] 作為本發(fā)明的一種技術(shù)方案，人肝癌細(xì)胞系HCCIH02,其保藏號為CCTCC C2014226〇
[0019] 作為本發(fā)明的一種技術(shù)方案，人肝癌細(xì)胞系HCCIH03,其保藏號為CCTCC C2014227〇
[0020] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0021] 所述人肝癌細(xì)胞系HCCIH01、所述人肝癌細(xì)胞系HCCIH02、所述人肝癌細(xì)胞系 HCCIH03在研宄肝癌發(fā)生機(jī)理和/或篩選治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明中的三株肝癌細(xì)胞，來源于同一個病人肝癌組織的不同部位，盡管存在著 顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性），但與不同病人來源的肝癌細(xì)胞相比，同 一病人來源細(xì)胞的基因組信息更為相似、差異小，大大降低了噪音的影響，從而提高了鑒定 藥物反應(yīng)相關(guān)標(biāo)志物的效率和能力，降低抗腫瘤藥物分子標(biāo)志物分析的難度和成本。同時， 這三株細(xì)胞也為研宄肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的起源、機(jī)制及意義提供了良好的模型。
[0023] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0024] 1、細(xì)胞代數(shù)明確，無交叉感染；三株肝細(xì)胞來源于同一個病人肝癌組織的不同空 間部位，存在著顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，為研宄肝癌癌內(nèi)異質(zhì)性的起源、機(jī)制及意義提供了良 好的模型。
[0025] 2、與不同病人來源的肝癌細(xì)胞相比，同一病人來源細(xì)胞之間的基因組信息更為相 似、混雜因素少，提高了鑒定藥物反應(yīng)相關(guān)標(biāo)志物的效率和能力，降低抗腫瘤藥物分子標(biāo)志 物分析的難度和成本。
【附圖說明】
[0026] 附圖1是三株肝癌細(xì)胞的形態(tài)。
[0027] 附圖2是三株肝癌細(xì)胞克隆形成能力照片。
[0028] 附圖3是三株肝癌細(xì)胞的迀移能力照片。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0030] 實施例1人肝癌細(xì)胞系HCCIH01、HCCIH02、HCCIH03建立及測試
[0031] -、細(xì)胞系的建立及檢測
[0032] 1.三株原代肝癌細(xì)胞建立
[0033] 取術(shù)前未經(jīng)任何治療的，在在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科行手術(shù)切除的肝癌 細(xì)胞患者的腫瘤標(biāo)本，該患者為漢族男性，34歲，HBV+HCV-HIV-，術(shù)前AFP為1925ng/ml， 肝細(xì)胞癌的診斷獲病理證實，并取得患者知情同意和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批 準(zhǔn)。切除后立即在腫瘤實體組織的不同區(qū)域進(jìn)行取樣，并將不同采樣區(qū)域使用序號標(biāo)記。將 分離好的新鮮肝癌組織，于無菌超凈臺中PBS洗凈后，使用眼科鑷子、剪刀等器械在培養(yǎng)皿 中剪碎分離成〇. 5-1_3的小塊平鋪于皿底，并向培養(yǎng)皿中加入含10ml的10%FBS(GIBCO 公司），1 %雙抗DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（GIBCO公司），放入37°C5% 0)2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 次日在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到 的生長暈。5?7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨 換液而棄去，由組