一種玻璃酸酶粗品的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從新鮮動(dòng)物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頒下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。Fe2+、Cu2+對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B (皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
[0004]藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進(jìn)行提取制備。
[0005]低溫乙醇法是1940年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Edwin J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱為“孔氏法”?？资戏ㄗ畛跤脕矸蛛x牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。1944年，白蛋白制品首次進(jìn)行臨床輸注，用于搶救7名在日軍偷襲珍珠港中嚴(yán)重?zé)齻拿绹⒂纱碎_始了血漿蛋白制品的工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇作為一種蛋白沉淀劑，具有許多優(yōu)點(diǎn):介電常數(shù)低、與水易混溶、在正常環(huán)境和工作條件下無易爆性、低分子量、化學(xué)上的相對惰性、低毒、價(jià)廉、易得和抑菌作用。至今，大規(guī)模血漿蛋白分離仍基本采用低溫乙醇分離法。
[0006]國外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國和日本藥典中，商品名Rondas。我國1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國藥典。王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研宄》的論文，較詳細(xì)的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研宄》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中提取玻璃酸酶的實(shí)驗(yàn)研宄。國內(nèi)傳統(tǒng)工藝是用酸液溶解和硫酸銨鹽析來提取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)透析、凍干得玻璃酸酶精品的，本專利采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來提取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)，國內(nèi)相關(guān)論文、專利等文獻(xiàn)資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品、色譜分離制取玻璃酸酶精品的相關(guān)介紹。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種玻璃酸酶粗品的制取方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。具體步驟如下:
I提取:
將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每Ikg糜漿加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時(shí)后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3.2?4.0。
[0008]取濾渣，按每Ikg開始加入的糜漿加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液攪拌I小時(shí)后，再次過濾，濾液調(diào)PH3.2?4.0。
[0009]所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。
[0010]2 粗制:
合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)pH3.2-4.0，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。
[0011]粗制工序需在2-6°C冷庫中進(jìn)行，兩次無水乙醇的添加量均為開始時(shí)合并的過濾液的50%。
[0012]3色譜分離:
設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品溶于少量平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液，加4倍收集液體積的乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g，加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液Γ冼脫液為氯化鈉440g，加純化水15L，調(diào)pH3.6后的溶液；
4熱原處理:
將上述溶液離心，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，加入15%磷酸三鈉(Na3PO4.12H20)溶液，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2 -H2O)溶液，并以NaOH溶液調(diào)pH 8.5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH 6.5?7.0 ;
5凍干
將濾液冷凍干燥，即得無熱原的玻璃酸酶精品。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)是用酸液溶解、硫酸銨鹽析的方法來制取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)透析、凍干得玻璃酸酶精品；而本發(fā)明技術(shù)是采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來制取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)色譜分離、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，國內(nèi)相關(guān)論文、專利等文獻(xiàn)資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品以及色譜分離制取玻璃酸酶精品的相關(guān)介紹，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡易、收率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該項(xiàng)成果有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，它不但解決國內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開拓了新路，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0015]實(shí)施例1 I提取:
稱取糜漿6kg加酸液7.8L，攪拌浸出4小時(shí)后，將浸出液過濾，濾液調(diào)PH3.59。
[0016]取濾渣加酸液1.4L，攪拌I小時(shí)后，再次過濾，濾液調(diào)pH3.62。
[0017]2 粗制:
在2-6°C冷庫中合并兩次過濾液10.2L，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇5.1L，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.66，加入預(yù)冷的無水乙醇5.1L，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品 782.28go
[0018]3色譜分離
設(shè)定柱流速25L/h，用平衡液平衡色譜分離柱2小時(shí)，粗品782.28g溶于78L平衡液后上柱，再分別用平衡液和清洗液各清洗柱子25分鐘，然后用洗脫液洗脫30分鐘，收集溶液12.7L，加50.8L乙醇沉淀12小時(shí)后離心脫水，轉(zhuǎn)速3700r/min ;其中:平衡液為醋酸鈉1090g，加純化水160L，調(diào)pH3.6后的溶液；清洗液為醋酸鈉220g，加純化水16L，調(diào)pH3.6后的溶液Γ冼脫液為氯化鈉440g，加純化水15L