一種針對(duì)miR-92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)miR-92a種子序列的微小反義寡聚 核苷酸及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM)是一種單克隆的惡性衆(zhòng)細(xì)胞病。近期出現(xiàn) 的沙利度胺，來(lái)那度胺和硼替佐米等藥可以有效的延長(zhǎng)MM患者的壽命，但是耐藥性或疾病 復(fù)發(fā)仍然備受關(guān)注。在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過(guò)程涉及多種基因的異常表達(dá)和多條信號(hào)通路 的失調(diào)。研宄發(fā)現(xiàn)這些失調(diào)的基因和信號(hào)通路，可以被miRNA調(diào)節(jié)。
[0003] microRNA(miRNA)是一種非編碼的RNA，它可以與靶mRNA的3'端的非編碼區(qū)互 補(bǔ)結(jié)合抑制mRNA的翻譯或者降解mRNA鏈。因此，MiRNA可以通過(guò)影響mRNA的翻譯過(guò)程， 從而影響細(xì)胞的多種功能。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，30%的人全基因可以被miRNA調(diào)節(jié)，并且 miRNA參與細(xì)胞的存活、發(fā)育、分化、凋亡和衰老等多種生物過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在 腫瘤中有一些顯著過(guò)表達(dá)miRNA，類似癌基因功能，被稱為oncomirs。近年研宄表明，影響 oncomir的表達(dá)可能是治療癌癥一種新的有效策略。
[0004] 在麗細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種miRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的差異性，其中高表達(dá)的miRNA 包括miR-21，miR-155,miR-17-92,miR-99a-125b和miR-106-25。其中miR-17-92 簇作為 重要的癌基因簇，在多種癌癥中引起了重視。miR-17-92簇基因是一種多順?lè)醋?，可以轉(zhuǎn) 錄出 6 中miRNA(miR-17，miR-18，miR-19a，miR-20，miR-19b-l，miR-92-l)。先前的研宄發(fā) 現(xiàn)，miR-17-92簇與Myc基因的表達(dá)有密切的關(guān)聯(lián)，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中沉默Myc基因， miR-17-92簇的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞死亡。這表明miR-17-92簇在多發(fā) 性骨髓瘤中也可能是一種很重要的癌基因。但確切的作用還不很明確。
[0005] 研宄證實(shí)，在miRNA的5'端具有7?8個(gè)高度保守序列，被稱為種子序列。種子 序列通過(guò)與其靶基因mRNA的3'UTR進(jìn)行堿基完全互補(bǔ)配對(duì)，促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制 mRNA翻譯，從而對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)性調(diào)控。針對(duì)miRNA種子序列反義核 酸可以干擾miRNA與靶基因的配對(duì)，從而阻止miRNA發(fā)揮功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種針對(duì)miR-92a 種子序列的微小反義寡聚核苷酸。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述針對(duì)miR_92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸 的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種針對(duì)miR_92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸（tiny antimiR-92a，t-antimiR-92a)，其核苷酸序列如下：5'-AGTGCAAT-3' ；
[0010] 所述的微小反義寡核苷酸經(jīng)過(guò)全硫代修飾；
[0011] 所述的針對(duì)rniR-92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用；
[0012] 所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物；
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0014] (1)本發(fā)明提供的針對(duì)miR-92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸t(yī)-antimiR-92a 靶向作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI-8266中的miR-92a，本發(fā)明探宄了微小反義寡聚核苷 酸t(yī)-antimiR-92a對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時(shí) 也為傳統(tǒng)的中藥的抗腫瘤機(jī)制提供新的視角。
[0015] (2)相對(duì)于成熟miRNA而言，本發(fā)明提供的針對(duì)miR-92a種子序列的微小反義寡聚 核苷酸t(yī)-antimiR-92a具有分子量小，毒性小，特異性強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖 1 是miR_92a和t_antimiR-92a的序列不意圖。
[0017] 圖2是miRFocus軟件分析miR-92a參與的信號(hào)通路的結(jié)果分析圖。
[0018] 圖3是t-antimiR-92a對(duì)RPMI-8266細(xì)胞增殖抑制作用的結(jié)果分析圖。
[0019] 圖4是轉(zhuǎn)染t-antimiR-92a對(duì)RPMI-8266細(xì)胞colony實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中A為不同 處理組的細(xì)胞克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，B為不同處理組顯微鏡下的集落形態(tài)。
[0020] 圖5是轉(zhuǎn)染t-antimiR-92a對(duì)RPMI-8266細(xì)胞的侵襲影響的結(jié)果分析圖，其中，A 為不同處理組的細(xì)胞侵襲數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，B為不同處理組顯微鏡下的侵襲結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0022] 實(shí)施例1微小反義寡聚核苷酸的設(shè)計(jì)與合成
[0023] 從microRNAFamilies數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人microRNA_92a的種子序列，根據(jù)序列互 補(bǔ)原理設(shè)計(jì)針對(duì)人microRNA-92a種子序列的微小反義寡聚核苷酸序列（t-antimiR-92a)， 并采用BLAST軟件分析確定其微小反義寡聚核苷酸序列及隨機(jī)對(duì)照序列（圖1)。微小 反義寡聚核苷酸序列：t-antimiR-92a(5' -AGTGCAAT-3'），隨機(jī)序列（scramble，SCR): 5' -TCATACTA-3' ；均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修飾，高效液相色譜（high performanceliquidchromatography,HPLC)純化。
[0024] 實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)
[0025] 將RPMI-8266細(xì)胞（多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生化所）接 種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、體積分?jǐn)?shù) 為5%的C02培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2?3天換液傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0. 2 %臺(tái)盼藍(lán)拒染率>95 %的細(xì)胞。
[0026] 實(shí)施例3miRNA-92a的信號(hào)通路分析
[0027] miRFocus(http://mirfocus.org)軟件可以用來(lái)分析miRNA的革巴基因和其參與的 f目號(hào)通路。
[0028]miRFocus軟件分析miR-92a參與的信號(hào)通路。結(jié)果如圖2,miR-92a參與多條與 腫瘤有關(guān)的重要的信號(hào)通路。例如mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞周期和其他癌癥通路等。
[0029] 實(shí)施例4MTT法篩選微小反義寡聚核苷酸的最佳作用濃度
[0030] 本實(shí)驗(yàn)分t-antimiR-92