水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鑒定方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的基因克隆、基因表達(dá)、功能鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗病基因OsSehl及克隆方法、功能鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryza sativa)是世界性重要的糧食作物[1]，也是谷類生物學(xué)的模式植物[2’3]。紋枯病(Rice sheath blight)是世界性水稻(Oryza sativa)三大病害之一，其發(fā)生面積廣，危害程度重，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。至今在水稻種質(zhì)資源中尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻紋枯病完全免疫或高抗的水稻品種。紋枯病由真菌引起，從水稻秧苗期到抽穗期均可發(fā)病，侵染包括葉鞘、葉片、甚至穗子在內(nèi)的各種組織，造成結(jié)實(shí)率下降[2]。水稻對(duì)紋枯病的抗性屬于典型的數(shù)量性狀抗病性，不存在主效抗病基因[3]。因此，研宄水稻對(duì)紋枯病廣譜抗性的分子機(jī)理非常重要。目前，水稻廣譜抗病相關(guān)的分子機(jī)理研宄主要集中在幾丁質(zhì)酶基因上，如許多研宄表明水稻植株中過(guò)表達(dá)幾丁質(zhì)酶或?qū)锥≠|(zhì)酶基因和葡聚糖基因一起轉(zhuǎn)入水稻可以破壞紋枯病病原菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而提高植株抗性[4_9]。
[0003]近年來(lái)，越來(lái)越多研宄表明植物體的非特異性防御反應(yīng)涉及多種核質(zhì)運(yùn)輸?shù)膮⑴c，不同的R蛋白(Resistance proteins)在運(yùn)輸途徑中起重要作用。在水稻中已初步分離鑒定到了 NBS-LRR類的R蛋白抗病基因家族[1°]，但其功能尚未被驗(yàn)證。此外，真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)和RNA在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的運(yùn)輸主要通過(guò)核孔蛋白復(fù)合體(NPCs)進(jìn)行。植物體的防御反應(yīng)被激活時(shí)，NPCs可以特異調(diào)節(jié)NB-LRRR蛋白、免疫原件及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和絲裂原活化蛋白激酶細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，使植物啟動(dòng)抗病反應(yīng)[11]。植物核孔蛋白(Nup)是NPCs的重要組成部分。盡管Nups在動(dòng)物免疫過(guò)程中起重要作用早已被證明[[12’13]，然而，關(guān)于Nups參與許多植物的抗性調(diào)控因子轉(zhuǎn)運(yùn)的研宄尚少，已鑒定的Nups也非常少。
[0004]在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中已發(fā)現(xiàn)了一個(gè)核孔編碼蛋白的基因，AtSehl (GenBank登錄號(hào)AEE34229)，其產(chǎn)物是核孔蛋白復(fù)合體Nupl07_160D的組成部分。它不能夠直接對(duì)病原微生物進(jìn)行作用，但可以特異性的識(shí)別TNL(Tollinterleukin lreceptor/nucleotide-binding/leucine-rich repeat)類抗性蛋白，從而參與植物SAR(systemic acquired resistance)反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)植物免疫調(diào)節(jié)因子EDSl (enhanced disease susceptibility I)的含量以及控制抗性蛋白的運(yùn)輸參與到水楊酸抗病途徑中[14’15]。目前，水稻中已克隆的抗病基因中大部分基因編碼類受體類蛋白激酶(Receptor-like protein kinase, RLK)，直接參與對(duì)病原菌的識(shí)別和防御，如Pi2，X21等[16，17]，而關(guān)于Nup的研宄較少。迄今為止，水稻Sehl基因的研宄未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)水稻中Sehl基因進(jìn)彳丁克隆和功能研宄具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供水稻抗病基因OsSehl、克隆方法、功能鑒定方法、應(yīng)用，填補(bǔ)水稻Sehl基因研宄的空白。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，
[0007]水稻抗病基因OsSehl，其核糖核酸分子序列信息計(jì)算機(jī)可讀版本是:
[0008]ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGC AGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
[0009]所述水稻抗病基因OsSehl的克隆方法，按照以下步驟具體實(shí)施:
[0010]步驟一、材料的準(zhǔn)備
[0011]水稻品種‘中花11’用于轉(zhuǎn)化過(guò)表達(dá)及RNAi載體，并作為水楊酸處理的陰性對(duì)照；水稻品種‘日本晴’用于RNA提取；還準(zhǔn)備大腸桿菌DH5 α、農(nóng)桿菌Η1105、立枯絲核菌株；
[0012]步驟二、水稻基因OsSehl的克隆
[0013]以擬南芥序列進(jìn)行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因組中與其同源性最高的基因序列(ΝΡ_001043597，Gene ID:4326622)，命名為 OsSehl，其 CDS 全長(zhǎng)為 972bp，編碼 323 個(gè)氨基酸，用Primer 5.0設(shè)id對(duì)特異性引物Seh-F
[0014](5' -TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-Sr )和 Seh-R
[0015](5' -GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3')，分別加上 KpnI 和 XbaI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用以擴(kuò)增OsSehl基因全長(zhǎng)，同時(shí)設(shè)計(jì)另一對(duì)特異性引物mirF
[0016](5, -CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-Sr )和 mirR
[0017](5' -CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3')，分別加 BamHI 和 SalI 酶切位點(diǎn)，用以擴(kuò)增RNA干涉片段；
[0018]取日本晴三葉期的水稻幼苗，Trizol試劑法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR反應(yīng)模板，擴(kuò)增OsSehl基因的PCR反應(yīng)體系為:2.0mmoI/L的MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.25 μ g模板cDNA、I μ mol/L上下游引物、IU Taq酶，反應(yīng)體系總體積25 μ 1，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、60°C復(fù)性30s、72°C延伸lmin，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72°C總延伸lOmin，PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化，進(jìn)行TA克隆，載體為pEASY_Tl。
[0019]水稻抗病基因OsSehl的功能鑒定方法，按照以下步驟具體實(shí)施:
[0020]步驟一、過(guò)表達(dá)載體與RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0021]測(cè)序正確的OsSehl基因全長(zhǎng)，以pl301a載體為骨架，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體0sSehl-pl301a，干涉片段與pUCCRNAi載體用BamHI/Bglll、Sall/Xhol兩對(duì)同尾酶進(jìn)行酶切，T4連接酶連接，構(gòu)建雙向插入片段的干涉重組質(zhì)粒2Sehl-pUCC，用PstI單酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的2Sehl-pUCC質(zhì)粒與pl301a載體用Sail、PstI雙酶切，T4連接酶連接，構(gòu)建干涉融合表達(dá)載體2Sehl-pUCC-pl301a，構(gòu)建好的載體驗(yàn)證正確后經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種中花11，通過(guò)⑶S染液對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根和葉進(jìn)行染色，顯藍(lán)色的為陽(yáng)性植株，過(guò)表達(dá)載體上帶有潮霉素抗性篩選標(biāo)記基因，設(shè)計(jì)引物hyF(5' -ACTCACCGCGACGTCTGT-3r ),hyR(5/ -TTTCTTTGCCCTCGGACG-Sr )對(duì)轉(zhuǎn)基因植株潮霉素基因的一段進(jìn)行擴(kuò)增，能擴(kuò)增出1009bp大小片段為陽(yáng)性植株；
[0022]步驟二、亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及觀察
[0023]設(shè)計(jì)引物sF (5' -AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3')，
[0024]sR(5' -TACCCGGGGTGAGACACATT
[0025]GCAGTC-3')，將OsSehlCDS序列的終止子切除，兩端分別加上SpeI和SmaI酶切位點(diǎn)測(cè)序正確后，連接到P1305.1-GFP載體，酶切驗(yàn)證正確，電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EH105得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子注射到煙草中，以注射攜帶空載體1305.1-GFP的EH105菌株作為陰性對(duì)照，注射后的煙草進(jìn)行暗培養(yǎng)，36h后，在離注射孔Icm左右處剪取0.5cm2大小煙草葉片，制片后在共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位；
[0026]步驟三、OsSehl水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)分析
[0027]生長(zhǎng)到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水楊酸葉面噴灑處理，分別在處理后的0、12、24、36、48和72h取樣，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)OsSehl基因進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，觀察水楊酸處理后該基因在不同時(shí)間段的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)采用水稻Actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果以2_λλ 1直表示基因表達(dá)的相對(duì)值，以3個(gè)樣本測(cè)定結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果，熒光定量PCR的Sehl和Actin引物分別如下:SehlF
[0028](5, -CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3, )，SehlR
[0029](5, -GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3')；
[0030]ActinF (5' -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3' )，ActinR
[0031](5, -GTACCCGCATCAGGCATCTG-3')；
[0032]步驟四、OsSehl轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)水楊酸含量測(cè)定及抗病性鑒定利用高效液相色譜，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株以及對(duì)照植株葉片中自由態(tài)水楊酸含量進(jìn)行測(cè)定；根據(jù)峰面積所占的比例，分別計(jì)算出對(duì)照與過(guò)表達(dá)植株T1-1/2/3以及RNAi植株體內(nèi)游離態(tài)SA的含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用牙簽嵌入接種法對(duì)過(guò)表達(dá)植株、干涉植株、對(duì)照中花11野生型植株分別進(jìn)行紋枯病病原菌接種，重復(fù)2次，每次各接種15株，利用加濕器和溫室，控制溫度在35°C左右及濕度90 %以上的條件下生長(zhǎng)，15天后對(duì)水稻病菌侵染癥狀進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，按病斑面積占葉鞘總面積的比例來(lái)判定植株的感病情況。
[0033]進(jìn)一步，步驟四的游離態(tài)SA的含量的計(jì)算，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理和統(tǒng)計(jì)分析，方法為單因素方差分析，p<0.05為差異顯著，p>0.05為差異不顯著。
[0034]水稻抗病基因OsSehl應(yīng)用于水稻紋枯病的防治。
[0035]本發(fā)明的有益效果是:克隆了日本晴水稻中的編碼核孔蛋白的基因OsSehl，完成氨基酸序列分析、亞細(xì)胞定位、水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定，初步明確了OsSehl基因在水稻抗病中的功能，為水稻廣譜抗病分子機(jī)理和水稻廣譜抗性品種分子育種提供理論基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1本發(fā)明的2Seh-pUCC_pl301a構(gòu)建流程示意圖；
[0037]圖2本發(fā)明的水稻遺傳轉(zhuǎn)化流程圖；
[0038]圖3本發(fā)明的pl305.1-GFP載體圖譜