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鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應(yīng)用

文檔序號(hào):8208793閱讀:1713來源:國知局
鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域,更加具體地說,涉及選自鹽地堿蓬的耐 鹽堿基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)重問題之一,鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的 重要因子。隨著近年來國家對(duì)鹽堿地的開發(fā)和利用日益重視,對(duì)抗鹽基因的分離與功能研 究成為生物學(xué)的熱門研究方向。創(chuàng)制耐鹽作物品種是在環(huán)球工業(yè)化大背景下取得糧食產(chǎn)量 穩(wěn)定持續(xù)增長的重要手段之一,但是由于缺乏對(duì)作物耐鹽的分子機(jī)理以及與耐鹽有關(guān)基因 的了解,阻礙了耐鹽作物的培育。隨著對(duì)植物鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理研究不斷深入,特別是 以擬南芥為研究對(duì)象,植物在鹽脅迫條件下的離子平衡和耐鹽反應(yīng)調(diào)節(jié)途徑的研究取得了 突破性的進(jìn)展。目前,對(duì)抗鹽基因的分離是當(dāng)前利用基因工程方法進(jìn)行抗鹽作物培育的首 要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種從鹽地堿蓬中獲取的耐鹽堿基 因及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0005] 鹽地堿蓬耐鹽堿基因如序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列,或者與SEQID No. 1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的,且與SEQID No. 1所示的核苷酸序列相比具有90- 95%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸 序列。
[0006] 重組載體,包含上述鹽地堿蓬耐鹽堿基因,例如pJETl. 2、pD0NR201、pK2GW7。
[0007] 農(nóng)桿菌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染上述鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
[0008] 本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿基因在改良植物耐鹽堿性中的應(yīng)用,所述植物可選擇擬 南芥或者楊樹。
[0009] 本發(fā)明公開鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應(yīng)用,從鹽地堿蓬中獲取并具有序列表中 SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列,并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞,采用該基 因轉(zhuǎn)染的擬南芥和楊樹表現(xiàn)出對(duì)鹽堿的耐受力,說明本發(fā)明提供的耐鹽堿基因在改良作物 耐鹽堿能力中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿的基因克隆電泳示意圖。
[0011] 圖2是轉(zhuǎn)染之后pJETl. 2_SgSAT的測(cè)序表達(dá)電泳圖。
[0012] 圖3是含有本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿的基因SgSAT的表達(dá)載體示意圖。
[0013] 圖4是pK2GW7(I)_SgSAT32轉(zhuǎn)化擬南芥后,T3純合體PCR測(cè)定表達(dá)水平結(jié)果示意 圖。
[0014] 圖5是SgSAT32轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體抗鹽實(shí)驗(yàn)效果圖。
[0015] 圖6是SgSAT32轉(zhuǎn)基因楊樹抗鹽實(shí)驗(yàn)效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0017] 使用的植物堿蓬(鹽地堿蓬)來源為天津市濱海新區(qū)北塘口東海路。
[0018] 首先以此為原料獲取本發(fā)明的耐鹽堿基因(即鹽地堿蓬SAT基因的克?。?。
[0019] 取五周新鮮鹽地堿蓬植株,使用植物EasyPurePCRPurificationKit(Trans geneCode#EP101_0150rxns)提取totalRNA,并且利用EasyScriptFrist-StrandcDNA SynSgesisSuperMix(TransgeneCode#AE301_03100rxns)去除基因組DNA干擾,反轉(zhuǎn)錄出 cDNA。
[0020] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的ArabidopsisthalianaSAT32s基因的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡 并引物SAT-5 和SAT-3,然后利用RACE-PCR技術(shù)(Introgen,F(xiàn)irstChoice?RLM-RACEKit withManual)獲得鹽地堿蓬SAT基因全長cDNA序列,將擴(kuò)增得到的SAT基因進(jìn)行測(cè)序分 析,得到完整SgSAT基因全長為1029bp,如序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列,即本 發(fā)明的耐鹽堿基因。
[0021] 在上述方案中,引物SAT-5如序列表中SEQIDN0. 2所示, 5' -TGGAGGAGGGITCATAAGCA-3' ;引物SAT-3 如序列表中SEQIDN0.3 所示, 5, -ATGCTGTGAGGAAGGAGAATGA-3,。
[0022] 根據(jù)SgSAT基因核苷酸序列設(shè)計(jì)上下游引物SAT-F和SAT-R,利用EasyScript Frist-StrandcDNASynSgesisSuperMix(TransgeneCode#AE301-03100rxns)去 除基因組DNA干擾,反轉(zhuǎn)錄出鹽地堿蓬cDNA,引物SAT-F如序列表中SEQIDN0.4所 示,5' -CTTGAGITCTGAITTCACTGATGG-3' ;引物SAT-R如序列表中SEQIDNO. 5 所示, 5' -TCAITCTCCTTCCTCACAGCAT-3'。反應(yīng)PCR程序:42°C30min,85°C5min,4°C,進(jìn)行保存。
[0023] 利用RACE-PCR技術(shù)的具體步驟,如下:
[0024] (l)cDNA第一鏈的合成,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0,以興 安落葉松總RNA為模板,Oligo(dT)為引物,在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一鏈cDNA,反 轉(zhuǎn)錄體系如下表所示。反應(yīng)條件:42°C60min,99°C5min。
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鹽地堿蓬耐鹽堿基因如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列,或者與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的,且與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列相比具有90- 95%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸 序列。
2. 重組載體,包含如權(quán)利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體,其特征在于,所述重組載體為pJETl. 2、pD0NR201、 pK2GW7〇
4. 農(nóng)桿菌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
5. 如權(quán)利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因在改良植物耐鹽堿性中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述植物可選擇擬南芥或者楊樹。
【專利摘要】本發(fā)明公開鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應(yīng)用,從鹽地堿蓬中獲取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列,并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞,采用該基因轉(zhuǎn)染的擬南芥和楊樹表現(xiàn)出對(duì)鹽堿的耐受力,說明本發(fā)明提供的耐鹽堿基因在改良作物耐鹽堿能力中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15-82, C12N1-21, C12N15-29, A01H5-00
【公開號(hào)】CN104531721
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410839705
【發(fā)明人】王潔華, 羅翠, 楊少輝
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日
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