鹽地堿蓬rav基因及包括該基因的重組載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種鹽地堿蓬基因及包括該基因的 重組載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)重問(wèn)題之一，鹽脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的 重要因子。隨著近年來(lái)國(guó)家對(duì)鹽堿地的開(kāi)發(fā)和利用日益重視，對(duì)抗鹽基因的分離與功能研 宄成為生物學(xué)的熱門(mén)研宄方向。創(chuàng)制耐鹽作物品種是在環(huán)球工業(yè)化大背景下取得糧食產(chǎn)量 穩(wěn)定持續(xù)增長(zhǎng)的重要手段之一，但是由于缺乏對(duì)作物耐鹽的分子機(jī)理以及與耐鹽有關(guān)基因 的了解，阻礙了耐鹽作物的培育。隨著對(duì)植物鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理研宄不斷深入，特別是 以擬南芥為研宄對(duì)象，植物在鹽脅迫條件下的離子平衡和耐鹽反應(yīng)調(diào)節(jié)途徑的研宄取得了 突破性的進(jìn)展。目前，對(duì)抗鹽基因的分離和應(yīng)用是當(dāng)前利用基因工程方法進(jìn)行抗鹽作物培 育的首要任務(wù)。
[0003] 鹽地堿蓬（Suaedasalsa，簡(jiǎn)稱(chēng)S.sa)又名翅堿蓬、黃須菜，為藜科 (Chenopodiaceae) -年生草本真鹽生植物，肉質(zhì)化真鹽生植物，生長(zhǎng)于海涂或鹽場(chǎng)的鹽灘 之上，具有耐鹽堿、耐旱、耐澇等特性。鹽地堿蓬在我國(guó)分布極為廣泛，多數(shù)生于濱海洼地以 及渠岸或田邊輕度鹽堿化土壤，具有抗鹽堿和耐海水的特點(diǎn)，是廣闊灘涂土地的一種指示 植物。鹽地堿蓬在改善并利用鹽堿地、降低土壤鹽分、減少土壤水分蒸發(fā)、促進(jìn)植物抗鹽機(jī) 制研宄、提供抗鹽種質(zhì)資源和抗鹽基因工程等方面有著非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鹽地堿蓬RAV基因。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供鹽地堿蓬RAV基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含鹽地堿蓬RAV基因的宿主細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供含鹽地堿蓬RAV基因的用途。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 鹽地堿蓬RAV基因，是SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
[0011] 鹽地堿蓬RAV基因編碼的蛋白質(zhì)，是SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列。
[0012] 含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體，含有鹽地堿蓬RAV基因。
[0013] 含鹽地堿蓬RAV基因的宿主細(xì)胞，將含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體導(dǎo)入到農(nóng)桿 菌菌株中，得到轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0014] 鹽地堿蓬RAV基因增強(qiáng)楊樹(shù)或擬南芥耐鹽性能的用途。
[0015] 實(shí)驗(yàn)證明，含鹽地堿蓬RAV基因增強(qiáng)楊樹(shù)或擬南芥耐鹽的功能得到了明顯的提 升。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1鹽地喊逢RAV基因克隆電泳不意圖。
[0017] 圖2鹽地堿蓬RAV插入表達(dá)載體pK2GW7 (I)后示意圖。
[0018] 圖 3pK2GW7 (I)_S.saRAV轉(zhuǎn)化C58 農(nóng)桿菌后PCR結(jié)果。
[0019] 圖4pK2GW7Q_S.saRAV轉(zhuǎn)化擬南芥后，T3純合體半定量PCR測(cè)定表達(dá)水平結(jié)果。
[0020] 圖5鹽地堿蓬RAV轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體抗鹽實(shí)驗(yàn)效果照片。其中的1為未經(jīng) 鹽水處理野生型擬南芥；2是用lOOmMNaCl處理野生型擬南芥；3是用lOOmMNaCl處理RAV 低表達(dá)量擬南芥；4是用lOOmMNaCl處理RAV高表達(dá)量擬南芥。
[0021] 圖6鹽地堿蓬RAV轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)半定量PCR測(cè)定表達(dá)水平結(jié)果。
[0022] 圖7鹽地堿蓬RAV轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)抗鹽實(shí)驗(yàn)效果。其中的1為未經(jīng)鹽水處理野生型楊 樹(shù)；2是用lOOmMNaCl處理野生型楊樹(shù)；3是用lOOmMNaCl處理RAV低表達(dá)量楊樹(shù)；4是用 lOOmMNaCl處理RAV高表達(dá)量楊樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊(cè)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0024] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 1.鹽地堿蓬RAV基因的克?。海}地堿蓬簡(jiǎn)稱(chēng)S.sa)
[0027] 從五周鹽地堿蓬整株幼苗（取自天津市濱海新區(qū)北塘口東海路沿線）中， 使用植物RNeasyPlantMiniKit(TransgeneCode#EP101_0150rxns)提取總 RNA，并且利用EasyScriptFrist-StrandcDNASynSgesisSuperMix(Transgene Code#AE301-03100rxns)反轉(zhuǎn)錄出cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的RAV基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì) 簡(jiǎn)并引物SEQIDNo. 3 :
[0028] 5,-GTCGTCAAAATTCAAAGGCGT-3,和SEQIDNo. 4 :
[0029]5'-CTGCATATTTCTTGGGTATCTCA-3'，然后利用RACE-PCR技術(shù) (Introgen,FirstChoice?RLM_RACEKitwithManual)獲得鹽地喊蓬RAV基因全長(zhǎng)cDNA序 列，其具體步驟如下：
[0030] l)cDNA第一鏈的合成
[0031] 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver. 3. 0,以鹽地堿蓬總RNA為模板， Oligo(dT)為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄體系如下：
[0032]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鹽地堿蓬RAV基因，其特征是SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1的鹽地堿蓬RAV基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3. 含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的鹽地堿蓬RAV 基因。
4. 含鹽地堿蓬RAV基因的宿主細(xì)胞，其特征是將含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體導(dǎo)入 到農(nóng)桿菌菌株中，得到轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
5. 鹽地堿蓬RAV基因增強(qiáng)楊樹(shù)或擬南芥耐鹽性能的用途。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鹽地堿蓬RAV基因及包括該基因的重組載體，鹽地堿蓬RAV基因，是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。鹽地堿蓬RAV基因編碼的蛋白質(zhì)，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體含有鹽地堿蓬RAV基因。含鹽地堿蓬RAV基因的宿主細(xì)胞，是將含鹽地堿蓬RAV基因的重組載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌株中，得到轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。鹽地堿蓬RAV基因增強(qiáng)楊樹(shù)或擬南芥耐鹽性能的用途。實(shí)驗(yàn)證明，含鹽地堿蓬RAV基因增強(qiáng)楊樹(shù)或擬南芥耐鹽的功能得到了明顯的提升。
【IPC分類(lèi)】C07K14-415, C12N15-84, C12N1-21, A01H5-00, C12N15-29
【公開(kāi)號(hào)】CN104531722
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510022757
【發(fā)明人】王潔華, 魏志蓉, 羅翠, 王蕊, 楊少輝
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日