調(diào)控水果果肉花青苷合成的基因PpRd及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)，尤其涉及一種調(diào)控水果果肉花青苷合成的 基因PpRd及其應(yīng)用；具體涉及調(diào)控桃果肉花青苷合成的轉(zhuǎn)錄因子PpRd的克隆、遺傳分析、 功能驗(yàn)證以及應(yīng)用；PpRd可以調(diào)控其他調(diào)控花青苷合成的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響果肉 花青苷的積累；還涉及果樹(shù)雜交育種的分子標(biāo)記的篩選，以便對(duì)該基因在果樹(shù)育種方面的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃約4000年前栽培在中國(guó)，之后在羅馬時(shí)期隨絲綢之路傳到了歐洲，現(xiàn)在成為溫 帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)果樹(shù)之一（W.yu_lin.PeachgrowingandgermplasminChina.Acta Horticulturae173:51-5)。根據(jù)果肉顏色，桃品種可以根據(jù)果肉顏色分為三類(lèi)：白色，黃 色和紅色。目前生產(chǎn)上使用的80%以上的桃品種為白肉水蜜桃（龔林忠，何華平，王富榮， 顧霞，10份湖北地方紅肉桃資源生物學(xué)特性觀察，果樹(shù)學(xué)報(bào)2008, 25 :413-417)。而黃桃和 紅肉桃在中國(guó)有悠久的栽培歷史。黃桃可以追溯到唐代（約1360年前），而紅肉桃最早見(jiàn) 于宋朝時(shí)周世厚所編的《洛陽(yáng)花木記》中。在歐洲紅肉桃最早記載于1659年（HedrickUP， ThepeachesofNewYork。 1917)〇
[0003] 桃屬于薔薇科，其基因組由8個(gè)染色體構(gòu)成，單倍體基因組約230兆堿基對(duì)大小。 紅肉桃的遺傳分析已經(jīng)有一些報(bào)道。在'HarrowBlood'X'RutgersRedLeaf2n'的F2 雜交后代中，紅肉桃和白桃的比例是1 :3,因此推斷該紅肉桃性狀是被一個(gè)隱性基因控制 的（WernerDJ等?Inheritanceoftheblood-fleshtraitinpeach.Hortsciencel998 ； 33:1243-1246)。這個(gè)位點(diǎn)被定位到第四連鎖群的頂端。然而，最近有報(bào)道在中國(guó)紅肉 桃'五月鮮'里發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的紅肉桃性狀，被認(rèn)為是被一個(gè)定位在五號(hào)染色體的顯性基 因所控制（ShenZ等?Characterizationandgeneticmappingofanewblood-flesh traitcontrolledbythesingledominantlocusDBFinpeach.TreeGeneticsand Genomes2013;9:1435_1446)。另外，在山桃P1908 和引進(jìn)品種 'Summergrand' 的雜交后 代中，2個(gè)分別位于1號(hào)連鎖群和3號(hào)連鎖群的數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)QTL被發(fā)現(xiàn)（QuilotB 等.QTLanalysisofqualitytraitsinanadvancedbackcrossbetweenPrunus persicacultivarsandthewiIdrelativespeciesP.davidiana.Theoreticaland AppliedGenetics2004;109:884-897)。這些都說(shuō)明紅肉性狀是復(fù)雜的，可能由多個(gè)基因 控制。
[0004] 桃的紅肉性狀是由于高含量的花青苷積累造成的?；ㄇ嘬赵谥参锇l(fā)育中發(fā)揮重 要的作用，比如保護(hù)植物免受強(qiáng)光照的傷害，抵抗病害，吸引動(dòng)物傳播花粉或種子?；ㄇ嘬?對(duì)人體健康也是大有裨益的，因此被當(dāng)做是果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)?；ㄇ嘬盏那绑w是花 青素，是尚未進(jìn)行糖基化、甲基化或乙?；奈镔|(zhì)?；ㄇ嗨馗鶕?jù)B環(huán)的羥基位置和數(shù)目多 少，主要可分為天竺葵素、矢車(chē)菊花素、飛燕草素。在桃肉中，主要的花青苷成分為矢車(chē)菊 素-3-葡萄糖苷，另外還有微量的矢車(chē)菊素-3-蕓香糖苷（OrazemP等.Fruitqualityof RedhavenandRoyalGlorypeachcultivarsonsevendifferentrootstocks.Journal ofAgriculturalandFoodChemistry201159:9394-9401)。
[0005] 植物中花青苷的生物合成通路已經(jīng)研究的很清楚，近些年來(lái)的研究主要集中在其 轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上。MYB、basic helix-loop-helix (bHLH)和WD40三種轉(zhuǎn)錄因子形成MBW轉(zhuǎn) 錄復(fù)合體結(jié)合到苯丙素、類(lèi)黃酮以及花青苷合成代謝通路的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子上，激活相 關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。除了MBW復(fù)合體，還有其他一些轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白被報(bào)道參與花青苷的 合成。
[0006] 在桃中，花青素在外果皮、內(nèi)果皮、葉片和花中的積累機(jī)制已經(jīng)有了一些報(bào)道。 最近有報(bào)道表明桃的表皮和近核處的著色與位于第三號(hào)染色體串聯(lián)的三個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因 子有關(guān)（RahimMA等?Regulationofanthocyaninbiosynthesisinpeachfruits. Planta2014D0I10. 1007/s00425-014-2078-2)。但導(dǎo)致這些性狀差異的關(guān)鍵基因仍然未 知。MYB基因可能只是參與果肉花青苷合成調(diào)節(jié)的具體"執(zhí)行者"，但并不是導(dǎo)致遺傳多樣 性的根本原因。而雜交育種需要明晰關(guān)鍵變異的基因座，因此MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子仍然無(wú)法應(yīng) 用于桃果肉顏色性狀的遺傳育種。我們的研究工作鑒定出該關(guān)鍵基因，可以直接用于雜交 育種中，為桃果肉優(yōu)良性狀的富集提供了理論和技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就在于提供一種調(diào)控水果果肉花青苷合成的基因PpRd及其應(yīng)用， 具體地說(shuō)：
[0008] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 一、調(diào)控水果果肉花青苷合成的基因PpRd
[0010] 本發(fā)明根據(jù)湖北省所特有的紅肉桃"大紅袍"品種及其雜交群體，對(duì)桃果肉酸花青 苷含量進(jìn)行QTL(數(shù)量性狀遺傳）定位，通過(guò)遺傳學(xué)方法，借助桃基因組框架圖的數(shù)據(jù)，分離 獲得了一個(gè)能決定桃果肉花青苷含量的基因，即前述的桃PpRd基因，其序列如SEQIDNO. 1 所示，及其所編碼的蛋白序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 具體是：通過(guò)HPLC(高效液相色譜）確定大紅袍著色成因是果實(shí)成熟期花青 苷的大量積累；通過(guò)對(duì)'大紅袍'X'曙光'群體進(jìn)行QTL定位；成功將紅肉性狀定位于 第五號(hào)染色體頂端約200kb的區(qū)間；通過(guò)RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)，找到最有可能的候選基因 ppa022238m(命名為PpRd);然后根據(jù)其核心變異序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記WPS23,在后代群體中 分析發(fā)現(xiàn)WPS23和紅肉性狀完全關(guān)聯(lián)；同時(shí)進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，證實(shí)了PpRd基因在特 定基因的配合下能使煙草葉片變紅，從而證實(shí)了分離到的基因。
[0012] 二、調(diào)控水果果肉花青苷合成的基因PpRd的應(yīng)用
[0013] 1、根據(jù)PpRd基因其序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記WPS23 (其引物序列見(jiàn)附表1)，用于育種中 的標(biāo)記輔助篩選，能提前篩選果肉顏色和花青素含量；
[0014] 根據(jù)該基因座周?chē)暮?jiǎn)單重復(fù)序列SSR分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠 PAGE條帶分析；發(fā)現(xiàn)3個(gè)SSR標(biāo)記在曙光中有分離，而在大紅袍中僅有1個(gè)標(biāo)記WPS23有 分離；在后代群體中分析發(fā)現(xiàn)WPS23和紅肉性狀完全關(guān)聯(lián)；因此該分析標(biāo)記可被用于大紅 袍的雜交育種中。
[0015] 2、其表達(dá)蛋白序列及基因功能的應(yīng)用，根據(jù)該基因的表達(dá)量或轉(zhuǎn)錄本的序列亞型 檢測(cè)篩選花青素含量相關(guān)表型，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法提高或降低該基因表達(dá)量以獲取期望的 果肉顏色性狀。
[0016] 根據(jù)大紅袍果肉RNA深度測(cè)序RNA-Seq的拼接結(jié)果，以及同源基因的序列，確定 PpRd的轉(zhuǎn)錄本序列；通過(guò)桃品種'lovel1'的全基因組序列，確定大紅袍PpRd的基因結(jié)構(gòu)； 根據(jù)其轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增PpRd全長(zhǎng)，連接到表達(dá)載體，與輔助性質(zhì)的PpNACl的 超表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，能使煙草的葉片在轉(zhuǎn)化后一周內(nèi)變紅，積累較多量的花青苷。在 大紅袍成熟果實(shí)進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默實(shí)驗(yàn)（VIGS，virusinducedgenesilencing) 證明當(dāng)PpRd被沉默后一周內(nèi)，果實(shí)紅色有所減退，而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。上述從正反兩 方面證明，PpRd基因能直接決定果肉的紅色和花青苷含量，因而可用于桃果實(shí)品質(zhì)的育種。 [0017] 與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0018] 1、本發(fā)明獲得了一個(gè)花青苷積累調(diào)節(jié)的上游基因，且不同于以前的研究中發(fā)現(xiàn)的 MYB轉(zhuǎn)錄因子系列基因，且證實(shí)了PpRd是在MYB上游行使功能；
[0019] 2