桑樹類黃酮3-o-糖基轉(zhuǎn)移酶基因、蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（MaUFGT)。
【背景技術(shù)】
[0002] 花青素（anthocyanin)屬于類黃酮化合物，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天 然色素，也是植物花瓣和果實(shí)的主要呈色物質(zhì)?；ㄇ嗨卮嬖谟谥参锛?xì)胞的液泡中，在不同的 pH值條件下，使花瓣呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色。自然狀態(tài)下，游離態(tài)的花青素極少見(jiàn)，主要以糖 苷形式存在，花青素常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過(guò)糖苷鍵形成花色苷。 花青素具有抗氧化、抗突變、預(yù)防心腦血管疾病及保護(hù)肝臟的作用。成熟果實(shí)的桑椹，味甜 汁多，色澤艷麗，營(yíng)養(yǎng)豐富，花青素含量極為豐富，這些特征是評(píng)價(jià)桑椹品質(zhì)的重要指標(biāo)。
[0003] 類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT)以槲皮素為底物，能夠催化UDP-葡萄糖生成槲皮 素3-3-D-葡萄糖甙，是花青素合成途徑的關(guān)鍵基因之一，能將不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變成穩(wěn) 定的花青苷，該基因的表達(dá)決定與否直接影響花青素含量的積累。因此桑樹類黃酮3-0-糖 基轉(zhuǎn)移酶基因可應(yīng)用于桑樹花青素生物合成的調(diào)控，改良桑椹的品質(zhì)。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)，制約該基因取得進(jìn)展的主要因素有：（1)蛋白表達(dá)量較低或不表達(dá)； (2)表達(dá)蛋白以包涵體形式存在；（3)包涵體復(fù)性后，蛋白沒(méi)有酶活性。因此，探尋UFGT基 因的高表達(dá)至關(guān)重要，尤其是獲得具有活性的蛋白，對(duì)該基因的鑒定及功能研究提供了重 要的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其氨基酸序列。
[0006] -種核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1或其互補(bǔ)序列。所述核酸分子編碼 桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
[0007] 上述核酸分子，其擴(kuò)增引物為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或其互補(bǔ)序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其擴(kuò)增引物為： UFGT-F :5' >CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC〈3'， UFGT-R :5' > GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT〈3'。
3. -種蛋白分子，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
4. 一種載體，包含了權(quán)利要求1或2所述核酸分子。
5. 如權(quán)利要求4所述的載體，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。
6. 如權(quán)利要求4所述的載體，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3。
7. -種桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的制備方法，包括獲取權(quán)利要求1所述的核酸 分子為目的基因，構(gòu)建包含目的基因的載體，載體導(dǎo)入宿主菌，從宿主菌中獲取目的蛋白、 目的蛋白純化，目的蛋白復(fù)性，所述目的蛋白復(fù)性是將純化后的蛋白液依次用透析液1、11、 III、IV、V、VI、W透析，每種透析液透析4-8h ; 透析液1配方：1〇〇禮1'1^8.11(：1，1〇1111￡〇14,〇.5%5〇5,611尿素，5%甘油，211110-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液11配方：100禮1'1^8.11(：1，101111￡014,0.5%505,4]\1尿素，5%甘油，211113-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液 III 配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0. 5%SDS，2M 尿素，5% 甘油，2mM 巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液1￥配方：10011111'1^8.11(：1，101111￡014,0.1%505，1]\1尿素，5%甘油，211113-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液 V 配方：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0. 1%SDS，5% 甘油，2mM 巰基乙醇(pH8. 0)； 透析液 VI 配方：50mM Tris. HC1，5mM EDTA，5% 甘油，2mM P -巰基乙醇（pH8. 0); 透析液 VII 配方：20mM Tris. HC1，2mM EDTA，5% 甘油，2mM P-巰基乙醇（pH8. 0)。
8. 如權(quán)利要求7所述的桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的制備方法，所述載體導(dǎo)入宿 主菌后蛋白純化前，加入終濃度為〇. 4 mmol/L的IPTG，28°C培養(yǎng)4h。
9. 如權(quán)利要求7所述的桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的制備方法，包括以下步驟： (1) 獲取桑樹類黃酮3-0-糖基轉(zhuǎn)移酶基因：提取成熟桑椹果實(shí)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以其為PCR模板，采用引物UFGT-F和UFGT-R擴(kuò)增得到SEQ ID NO. 1 ; (2)將SEQ ID NO. 1連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選 pET28 (a+) -MaUFGT載體陽(yáng)性克隆，再將此載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞； (3) 表達(dá)宿主菌經(jīng)卡拉霉素篩選后，培養(yǎng)至0D 600nm值為0. 6?0. 8,加入IPTG (異 丙基硫代半乳糖苷）至終濃度為〇. 4 mmol/L，在28°C下培養(yǎng)4-6h ; (4) 蛋白純化：將步驟（3)處理后得到的菌體在冰浴中經(jīng)超聲破碎后，依次用lOmmol/ L>40mmol/L> 100mmol/L>250mmol/L 咪唑洗脫液進(jìn)行 Ni_NTA 親和層析； (5) 蛋白復(fù)性：將純化后的蛋白液，在4°C依次用透析液I、II、III、IV、v、vi、vn透析復(fù) 性，每種透析液透析4h; 透析液1配方：1〇〇禮1'1^8.11(：1，1〇1111￡〇14,〇.5%5〇5,611尿素，5%甘油，211110-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液11配方：100禮1'1^8.11(：1，101111￡014,0.5%505,4]\1尿素，5%甘油，211113-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液 III 配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0. 5%SDS，2M 尿素，5% 甘油，2mM 巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液1￥配方：10011111'1^8.11(：1，101111￡014,0.1%505，1]\1尿素，5%甘油，211113-巰 基乙醇（pH8. 0); 透析液 V 配方：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0. 1%SDS，5% 甘油，2mM 巰基乙醇 (pH8. 0)； 透析液 VI 配方：50mM Tris. HC1，5mM EDTA，5% 甘油，2mM P -巰基乙醇（pH8. 0); 透析液 VII 配方：20mM Tris. HC1，2mM EDTA，5% 甘油，2mM P -巰基乙醇（pH8. 0)。
【專利摘要】本發(fā)明首次給出了桑樹類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列和氨基酸序列，并給出該桑樹類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，能夠?qū)DP-葡萄糖生成槲皮素 3-β-D-葡萄糖甙，具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，且具有表達(dá)量大，酶活性高的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12N9-10, C12N15-54, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104531727
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510006757
【發(fā)明人】余茂德, 梁燕梅, 李軍, 趙愛(ài)春, 劉長(zhǎng)英, 戴安娜, 王傳宏, 王曉紅, 吳存容
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月7日