一種添加二硫鍵以提高阿魏酸酯酶a熱穩(wěn)定性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及宇佐美曲霉（Aspergillususamii)E001菌株阿魏酸醋酶A(AuFaeA) 基因的熱穩(wěn)定性改造，突變阿魏酸酯酶A工程菌的構(gòu)建及重組突變阿魏酸酯酶A的高效表 達(dá)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸酯酶（EC3. 1. 1. 73)又稱肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一個(gè)亞類，屬于胞 外酶，能打斷半纖維素之間的、半纖維素與木質(zhì)素之間交聯(lián)的酯鍵，是半纖維素降解酶系的 組成成分之一。自1991年Faulds等首次分離出阿魏酸酯酶以來，已有超過30種阿魏酸酯 酶被克隆、表達(dá)及純化，其主要生物功能是水解植物細(xì)胞壁中多糖與阿魏酸連結(jié)的酯鍵，釋 放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體。但研宄結(jié)果表明，天然阿魏酸酯酶的熱穩(wěn)定性一 般較差，成為其在食品加工、飼料（制粒）、造紙行業(yè)（紙漿漂白）等諸多領(lǐng)域中應(yīng)用的瓶 頸。
[0003] 由于高溫生物工程環(huán)境限制了阿魏酸酯酶的應(yīng)用，所以人們加強(qiáng)了對(duì)酶熱穩(wěn)定性 的研宄。希望可以通過提高酶作用溫度和增加酶熱穩(wěn)定性，從而提高酶作用效率，以達(dá)到降 低工業(yè)生產(chǎn)成本的目的。目前，開發(fā)耐熱型阿魏酸酯酶的研宄主要包括篩選自然界中超耐 熱的阿魏酸酯酶生產(chǎn)菌和利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)等對(duì)酶分子進(jìn)行定向改造，相對(duì)于篩菌技術(shù) 的盲目性，后者具有更強(qiáng)的針對(duì)性，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞。隨著基因工程技術(shù)、生物信息 學(xué)等的快速發(fā)展，為分子生物學(xué)的研宄開辟了新的道路。通過運(yùn)用大規(guī)模高性能的計(jì)算機(jī) 及其相關(guān)軟件，結(jié)合基因工程手段，利用模擬試驗(yàn)對(duì)酶分子進(jìn)行定向改造以提高熱穩(wěn)定性， 從而擴(kuò)大阿魏酸酯酶的應(yīng)用面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種阿魏酸酯酶A熱穩(wěn)定性改造、突變阿魏酸酯酶A工程菌 構(gòu)建以及突變阿魏酸酯酶A高效異源表達(dá)的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：根據(jù)來源于A.usamiiE001阿魏酸醋酶A(AuFaeA)的空 間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)突變A126C和N152C，得到突變阿魏酸酯酶A:AuFaeAA126G_N152G，其成熟肽基因 AufaeAA126Mll52C序列為SEQIDNO: 1，C126 和C152 可以形成二硫鍵。
[0006] 所述的由成熟肽基因編碼得到的AuFaeAA126G-N152G氨基酸序列為SEQIDN0:2。
[0007] 所述的重組阿魏酸酯酶A的活性測(cè)定方法：
[0008] 以阿魏酸甲酯（MFA)為底物，高效液相（HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作為： 移取900yLMFA(lmM，pH6. 0)于2mLEP管中，45°C保溫lOmin，加入lOOyL適當(dāng)稀釋的 酶液，反應(yīng)lOmin后加入400yL冰乙酸終止反應(yīng)，立即混勻進(jìn)行高效液相分析。以先在酶 溶液中加入400yL冰乙酸，再加底物溶液為對(duì)照。色譜條件：以甲醇、1 %乙酸一步梯度洗 脫，在10min內(nèi)，甲醇濃度由50%上升至80%，流速lmL/min，柱溫30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，上 樣量20yL。根據(jù)峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的阿魏酸量，從而計(jì)算酶活。酶活單位定義： 在測(cè)定條件下（45°C、pH6. 0)每分鐘產(chǎn)生1ymol阿魏酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U)。
[0009] 所述的突變阿魏酸酯酶A基因的設(shè)計(jì)、克隆及表達(dá)：
[0010] (1)氨基酸殘基突變位點(diǎn)的選定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)（1UWC)為模 板，用Modeller9. 9 軟件模擬出AuFaeA的三維結(jié)構(gòu)。利用DiscoveryStudio3.OClient、 PyMOL和DisulfideByDesign軟件對(duì)模擬的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并用gromacs-4. 5程序包 對(duì)改造前后的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，最終確定氨基酸殘基突變位點(diǎn)。
[0011] ⑵突變基因AufaeAA1M52e及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)已申請(qǐng)發(fā)明專利（申請(qǐng) 號(hào)：201210181372.X)中核苷酸序列及突變位點(diǎn)特點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物126-F，152-R:
【主權(quán)項(xiàng)】
1?一種改造后的源自宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001的阿魏酸醋酶A基因 AufaeAA1?，其對(duì)應(yīng)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
2.突變阿魏酸酯酶A工程菌的構(gòu)建方法和表達(dá)方法： (1)突變殘基位點(diǎn)的選定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)（1UWC)為模板，用 Modeller 9. 9 軟件模擬出 AuFaeA 的三維結(jié)構(gòu)，利用 Discovery Studio 3.0 Client、PyMOL 和Disulfide By Design軟件對(duì)模擬出的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并用gromacs-4. 5程序包對(duì) 改造前后的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，最終確定氨基酸殘基突變位點(diǎn)； ⑵突變基因AufaeAA1M52e的克隆及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)已申請(qǐng)發(fā)明專利（申請(qǐng) 號(hào)：201210181372. X)中核苷酸序列及突變位點(diǎn)特點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物126-F，152-R : 126-F :5' -ATCCGGACTATTGCCTTACCGTGACA-3'， 152-R :5' -GTACAGACGGACGCAGTCATATGTCGC-3'， 以本實(shí)驗(yàn)室保存的pUCm-T-AufaeA為模板，以126-F，152-R為引物進(jìn)行第一輪PCR，獲 得基因片段AufaeA126_152;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物AufaeA 126_152為引 物與已申請(qǐng)發(fā)明專利（【申請(qǐng)?zhí)枴?01210181372.X)中特異性引物FAE-F進(jìn)行第二輪大引物 PCR，獲得基因片段AufaeA F_152;以pUCm-T-AufaeA為模板，以第二輪PCR產(chǎn)物AufaeA F_152為 引物與已申請(qǐng)發(fā)明專利（【申請(qǐng)?zhí)枴?01210181372.X)中特異性引物FAE-R進(jìn)行第三輪大引 物PCR，將第三輪PCR產(chǎn)物Auf aeAA1M52% 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并 與pUCm-T連接（pUCm-T-AufaeAA1?)，轉(zhuǎn)化JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序； (3) 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-AufaeAA126G_N152^ pPIC9K質(zhì)粒均 用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接， 得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-AufaeAA1? (圖1)，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定； (4) GS115/AufaeAA1M52e重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)特性的測(cè)定：用Sal I對(duì) pPIC9K-AufaeAA1M52G進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的 畢赤酵母重組子GS115/AufaeA A1?;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用1.0%甲 醇誘導(dǎo)72h ;離心上清液為重組突變阿魏酸酯酶A粗酶液，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，該 重組阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度為50°C，較原酶提高了 5°C，60°C下的半衰期達(dá)40min。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種阿魏酸酯酶A熱穩(wěn)定性改造、突變阿魏酸酯酶A工程菌構(gòu)建以及突變阿魏酸酯酶A高效異源表達(dá)的方法。根據(jù)來源于A.usamii E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)突變A126C和N152C，得到突變阿魏酸酯酶A：AuFaeAA126C-N152C，其成熟肽基因序列為SEQ ID NO:1，C126和C152可以形成一個(gè)二硫鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變后該酶熱穩(wěn)定性有了明顯的提高，為其它酶的改造提供新的技術(shù)路徑，作為一種耐熱型的酶制劑，該阿魏酸酯酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【IPC分類】C12N15-66, C12N9-18, C12R1-84, C12N15-81, C12N15-55
【公開號(hào)】CN104531729
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410758084
【發(fā)明人】鄔敏辰, 殷欣, 余濤, 李劍芳, 姚瑤, 何瑤
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月10日