產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素人源化單鏈抗體8B的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程及疾病防治領域，具體地涉及產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化 單鏈抗體8B及其在產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素中毒診斷和治療方法的應用。
【背景技術】
[0002]產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens)亦稱魏氏梭菌（C.welchii)，為革蘭氏 陽性菌，外形為兩端鈍圓的粗大桿狀，專性厭氧，有莢膜無鞭毛，是引起人食物中毒、氣性壞 疽、抗生素相關性腹瀉以及動物的腸毒血癥和痢疾等疾病的主要病原菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌一 般條件下很難形成芽孢，在無糖培養(yǎng)基中有利于形成芽孢，多數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株可形成 莢膜，該細菌DNA的G+Cmol%為24-27。在基本培養(yǎng)基上能正常生長，適宜的生長溫度在 37-47°C，呈現(xiàn)出圓形、凸起、光滑、半透明、邊緣整齊、無遷徙生長現(xiàn)象。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一 種厭氧菌，分離培養(yǎng)需要特殊的設備和試劑，一般實驗室難以開展該菌的研究，因此長久以 來國內(nèi)對厭氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少認識，雖然國外有厭氧菌引起的食物中毒 的報道，但國內(nèi)較少見報道，該菌作為一種條件致病菌，廣泛存在于自然界的水源、土壤及 人和動物腸道之中。當食入每克含菌量達1〇 5以上的污染食品時，即可引起食物中毒，臨床 表現(xiàn)為惡心嘔吐，腹部絞痛，多次腹瀉，不發(fā)熱等現(xiàn)象。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的該菌外毒素有 16種（a、3、y、6、e、n、9、i、K、A、]i和v等)，但僅有幾種毒素，即a(CPA)、 3 (CPB)、e(ETX)、i(ITX)毒素以及產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素0 (PF0)、腸毒素（CPE)、P2(CPB2) 毒素被認為是該菌的主要致病性毒素。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生四種致死性毒素（a、卩、e、 i毒素）的能力，將其分為五種血清類型，即A、B、C、D和E型，其中A型主要引起人類的食 物中毒和抗生素相關性腹瀉，也可以引起動物的氣性壞疽，還可以引起牛、羔羊、馴鹿、仔豬 和家兔的腸毒血癥；B型菌主要引起羔羊痢疾，還可以引起狗、牛和羊等腸毒血癥或壞死性 腸炎；C型菌主要是綿羊猝狙的病原菌，也能引起羔羊、牛、仔豬和綿羊的腸毒血癥、壞死性 腸炎以及人的壞死性腸炎；D型菌引起羊、牛、仔豬以及灰鼠的腸毒血癥；E型菌可致犢牛、 羔羊腸毒血癥，但是很少發(fā)生，其中各型均能產(chǎn)生a毒素，可見a毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌的 主要毒素和致病因子。
[0003]產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素（Clostridium perfringens alpha-toxin，CPA)是引起人 畜的創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒的主要致病因子。a毒素是一種依賴于鋅離子的多功 能金屬酶，具有膜磷脂C(PLC)和鞘磷脂酶（SMase)兩種酶活性，能夠同時水解細胞膜的磷 脂酰膽堿和鞘磷脂，破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解，具有細胞毒性、溶血活性、皮膚壞 死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性。產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素是一種不畏氧的細菌毒 素，可以水解卵磷脂形成磷脂膽堿和不溶性的甘油二脂，使紅細胞發(fā)生溶血和分解卵黃磷 月旨。純化濃縮的產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素作為生物武器可以制成氣溶膠形式釋放，也可以釋放 在水和食物中，該生物戰(zhàn)劑可引起人多系統(tǒng)多器官的嚴重反應，如缺乏食欲、惡心嘔吐、胃 部痙攣疼痛、膿血樣腹瀉；呼吸困難、喘息咳嗽、口腔咽喉疼痛、痰中帶血；皮膚灼痛、紅腫、 瘙癢、皮疹或水泡，更嚴重的可以引起死亡。a毒素是第一個被發(fā)現(xiàn)既有酶活性又有毒素特 性的細菌蛋白，具有冷熱溶血效應，即a毒素在37°C與紅細胞作用時，紅細胞并不發(fā)生裂 解，只有當紅細胞變冷至4°C時，才會發(fā)生裂解，這種冷熱溶血效應，發(fā)現(xiàn)在小鼠紅細胞、家 兔紅細胞、綿羊紅細胞和馬紅細胞上。a毒素對胰酶敏感，2. 5%的胰酶與a毒素在37°C作 用1h，即可使其完全失活。另外，把a毒素加熱至60°C-70°C時，就可以使其失活，當進一 步加熱至l〇〇°C時，有的可以恢復部分活性。a毒素結構基因大小為1194bp，編碼產(chǎn)物由 398個氨基酸組成，其中有28個氨基酸是信號肽，其余的370個氨基酸構成成熟蛋白，相對 分子量為43000Da,等電點pi為5. 1。a毒素分為兩個結構域，g卩a螺旋結構的N端結構 域以及參與膜蛋白結合的C端結構域，經(jīng)大量實驗證明，a毒素的N端與C端具有不同的 活性，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有兩者協(xié)同，才能具有溶血活性與 致死活性。a毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的致病因子，至今尚無有效的治療方法。關于抗 a毒素人源化抗體的研究，在國內(nèi)基本屬于空白，研究抗產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素治療性抗體 有廣闊的應用前景。
[0004] 20世紀90年代，組合化學技術與基因工程抗體技術相互結合產(chǎn)生了抗體庫技術， 抗體庫技術就是用基因克隆技術克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后重組到特定的 原核表達載體中，再轉化大腸桿菌表達有功能的抗體分子片段，并通過親和篩選獲得特異 性抗體可變區(qū)基因的技術。根據(jù)使用的篩選技術不同，抗體庫經(jīng)歷了組合抗體庫、噬菌體 抗體庫、核糖體展示庫三個階段，其中噬菌體抗體庫是迄今為止，發(fā)展最成熟、應用最廣泛 的抗體技術，噬菌體抗體庫是指在絲狀噬菌體表面表達Fab抗體或者scFv抗體，這稱為噬 菌體抗體，然后再利用基因工程手段克隆B細胞全套可變區(qū)基因，插入到表達載體，并在噬 菌體表面表達，形成大量的噬菌體抗體，構成噬菌體抗體庫，如由MRCHGMP資源中心創(chuàng)建的 HumanSingleFoldscFvLibrariesI+J(TomlinsonI+J)，該文庫包含至少有 108個 不同的重組單鏈抗體基因片段，利用其能夠淘選出抗a毒素單鏈抗體基因片段。為研制a 毒素中毒的特效藥物奠定了基礎，提供新的依據(jù)。目前，人源單鏈抗體的制備，大部分都是 利用噬菌體展不技術構建一個依托于噬菌體載體或者噬菌粒載體的噬菌體展不文庫，通過 目的抗原與抗體特異性結合，經(jīng)過幾輪淘選和富集過程，篩選到所需要的陽性克隆或者目 的抗體，利用ELISA和PCR等技術對其進行定性定量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為克服異源性抗體的多種副作用，免除異源性抗體進行人源化改 造的繁瑣步驟和高成本，而提供一種體分子量小，體內(nèi)穿透能力強，迅速到達受損組織和細 胞發(fā)揮抗毒素作用的，產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體7D。
[0006] 產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體8B，它的堿基序列如SEQIDN0. 2所示。
[0007]產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體8B，它的氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0008]產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體8B在制備治療和預防產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒 素中毒的藥物的應用。
[0009] 一種檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素的檢測試劑，它包括氨基酸序列如SEQIDN0. 5所 示的產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體8B。
[0010] 本發(fā)明提供了產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素人源化單鏈抗體8B，它