一種C型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達(dá)質(zhì)粒和重組菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種C型3 -葡萄糖苷酶突變體及其表達(dá)質(zhì)粒和重組菌，具體涉及的 是一種酶活性顯著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] C型，-葡萄糖苷酶（，-C-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3. 2. 1. 21)是一類能水解 苷類和寡糖的糖苷鍵并釋放非還原性末端葡糖殘基的酶。這些酶普遍存在于所有領(lǐng)域的生 命體中，在古細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物中發(fā)揮多種功能和作用。包括微生物內(nèi)的生物質(zhì)轉(zhuǎn) 換、動(dòng)物體糖脂和外源性糖苷的降解、細(xì)胞壁寡糖的木質(zhì)化和分解代謝、防御、植物激素結(jié) 合共軛激活作用、植物中氣味釋放以及植物-微生物和植物-昆蟲(chóng)相互作用等。
[0003] 白蟻是自然界中纖維素的最主要消耗者，白蟻主要通過(guò)內(nèi)源和外源纖維素酶的協(xié) 同作用分解纖維素，最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖。白蟻體內(nèi)就是一個(gè)微型的生物發(fā)酵器，若能模擬白 蟻的纖維素酶降解系統(tǒng)，工業(yè)化纖維素-葡萄糖-酒精-燃料的生產(chǎn)體系必是解決當(dāng)前環(huán) 境問(wèn)題能源危機(jī)的一條重要途徑。
[0004] 至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)白蟻體內(nèi)的內(nèi)源性C型葡萄糖苷酶的研究已經(jīng)逐步加深，目前 人們主要集中在對(duì)該酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究，并通過(guò)改造獲得高表達(dá)、高活性的0 -葡萄糖 苷酶用于工業(yè)經(jīng)濟(jì)應(yīng)用（Zhang，etal.，2010)。目前已有的研究顯示，該類纖維素水解 酶的催化效率較低、人工提取和表達(dá)的酶純化難度較大，若能通過(guò)同源建模等手段進(jìn)行理 性分子設(shè)計(jì)，對(duì)白蟻內(nèi)源性葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、穩(wěn)定性、底物特異性、耐熱性 和耐酸堿性等進(jìn)行合理化改造，將使此類酶具有更大的應(yīng)用前景，實(shí)現(xiàn)巨大工業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 Hsiao-linLee等人（Mutationsinthesubstrateentranceregionof3-glucosidase fromTrichodermareeseiimproveenzymeactivityandthermostability)已經(jīng)在來(lái)源 于里氏木霉的0 -葡萄糖苷酶中研究了突變后的酶，獲得了一些活性增強(qiáng)的突變體。
[0005] 本發(fā)明從臺(tái)灣家白蟻的cDNA中克隆得到C型葡萄糖苷酶(命名：CfBG GlulC)，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和同源性序列分析，找出了一系列突變位點(diǎn)，在這些氨基酸位 點(diǎn)上進(jìn)行點(diǎn)突變，得到了一系列突變體酶。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)與驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)突變體酶的 催化活性顯著增強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程的手段對(duì)白蟻C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC) 進(jìn)行定點(diǎn)突變改造，得到酶活性顯著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突變體，使該酶能更好的應(yīng) 用到工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用中。
[0007] 本發(fā)明提供的一系列定點(diǎn)突變改造的C型0 _葡萄糖苷酶突變體，是由來(lái)源于白 蟻的C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)進(jìn)行定點(diǎn)突變產(chǎn)生的。
[0008] 原親本C型0 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其 特征在于原親本氨基酸序列的第170位的賴氨酸K分別變?yōu)榻z氨酸S和色氨酸W，第182位 的苯丙氨酸F變?yōu)榧琢虬彼酠，第252位的氨基酸組氨酸H變?yōu)樘於０種。
[0009] 將定點(diǎn)突變改造獲得的C型葡萄糖苷酶突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a (Novagen公司）中，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒測(cè)序后與模板序列SEQIDNO. 1比對(duì)，確認(rèn)得 到四個(gè)酶活顯著提高的突變體。
[0010] 突變體的表示方法為：GlulC-原始氨基酸-位置-突變后氨基酸，所述突變體為： GlulC-K170S、GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulC-H252N。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供一種包含有c型0 -葡萄糖苷酶突變體DNA序列的突變 質(zhì)粒； 本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述突變質(zhì)粒的重組突變菌株。
[0012] 所述突變體構(gòu)建的具體步驟如下： (1)突變表達(dá)載體的構(gòu)建： 本發(fā)明從實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的臺(tái)灣家白蟻的唾液腺和腸道組織中，提取出RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄， 得到cDNA。
[0013] 在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)查到臺(tái)灣家白蟻的葡萄糖苷酶基因（GenBank登錄號(hào)為 奶，根據(jù)序列同源性，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以得到的臺(tái)灣家白蟻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入到載體pET_28a(Novagen公司）上的多克隆位點(diǎn)沒(méi)aMlI和通oI之 間，轉(zhuǎn)入feWi.DH5a(Novagen公司）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序后與已有的序列 奶比對(duì)，不完全相同，本實(shí)驗(yàn)室得到的重組質(zhì)粒稱為pET-28a-GlulC。
[0014] 將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入及?o/i.BL21 (DE3) (Novagen公司）進(jìn)行表達(dá)，得到C型 3 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)，作為活性測(cè)定的對(duì)照。
[0015] 我們?cè)诖嗣傅幕A(chǔ)上，對(duì)其基因進(jìn)行突變改造，以pET-28a-GlulC為模板，設(shè)計(jì)含 有突變位點(diǎn)的核苷酸序列引物，擴(kuò)增通過(guò)PCR擴(kuò)增得到突變質(zhì)粒全長(zhǎng)序列，將其利用Dpn I消化DNA模板后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收目的片段，經(jīng)T4DNA連接酶處理后，將 連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到及'Oh'.DH5a(Novagen公司）的感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒 測(cè)序，看相應(yīng)位點(diǎn)上的氨基酸是否突變成功。突變成功的重組質(zhì)粒稱為pET-28a-GlulC-X (X為原始氨基酸-位置-突變后氨基酸)分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) (Novagen公司）進(jìn)行 表達(dá)，即得到對(duì)應(yīng)的突變體表達(dá)菌株。
[0016] (2)重組突變體表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生突變體酶 將突變體表達(dá)菌株活化后，以1%的接種量轉(zhuǎn)接入200mL的LB培養(yǎng)基(含50 y g/mL的卡 那霉素）中振蕩培養(yǎng)，待〇D_約為0.4時(shí)加入0. 2mM的誘導(dǎo)劑IPTG，25°C振蕩培養(yǎng)6h。收 集菌液，10000g離心收集菌體，加入20mLTris-HCl緩沖液超聲破碎，離心取上清得到突變 體酶，分別測(cè)定酶活性。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)臺(tái)灣家白蟻C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)第170位的賴氨 酸K、第182位的苯丙氨酸F和第252位的組氨酸H進(jìn)行改造，構(gòu)建了C型葡萄糖苷酶突 變體，顯著提高了C型葡萄糖苷酶的酶活，本發(fā)明得到的突變體分別為GlulC-K170S、 GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulCH252N，這四株突變體的酶活都有了不同程度的提高， 分別為5. 2倍、2. 05倍、2. 9倍、2. 1倍。這對(duì)現(xiàn)今降解生物質(zhì)尤其是纖維素類具有重大的意 義，可以使自然界中的秸桿等在葡萄糖苷酶的促進(jìn)催化作用下，更好更快速的降解產(chǎn) 生葡萄糖，實(shí)現(xiàn)催化過(guò)程的高效優(yōu)化。產(chǎn)生的葡萄糖又可以進(jìn)一步參與更多的工業(yè)過(guò)程，如 生物燃料乙醇的生產(chǎn)，生物洗滌劑等一系列相關(guān)工藝。通過(guò)改造3 -葡萄糖苷酶使其活性 增強(qiáng)，更能滿足社會(huì)生產(chǎn)的要求，有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明中所得的突變體的突變位點(diǎn)處核苷酸示意圖，箭頭指向位點(diǎn)為突變 位點(diǎn)； 圖2為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株中C型0-葡萄糖苷酶的表達(dá)情況； 圖3為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株表達(dá)酶的酶活性情況。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020] 實(shí)施例1:突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組大腸桿菌的獲得 1.突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和同源性序列分析，找出了一系列突變位點(diǎn)，在這些氨基酸位點(diǎn) 上進(jìn)行點(diǎn)突變，得到了一系列突變體酶。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)與驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)突變體酶的催 化活性顯著增強(qiáng)。構(gòu)建過(guò)程如下： (1)從實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的臺(tái)灣家白蟻的唾液腺和腸道組織中，提取出RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。
[0021] (2)在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)查到臺(tái)灣家白蟻的e-葡萄糖苷酶基因根據(jù) 序列同源性，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，對(duì)步驟（1)得到的白蟻cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn) 物插入到載體pET_28a(Novagen)上的相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)沒(méi)aMlI和通oI之間，轉(zhuǎn)化入 i?coJ7.DH5a(Novagen)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序后與已有的序列比 對(duì)，不完全相同，本實(shí)驗(yàn)室得到的重組質(zhì)粒稱為pET-28a-GlulC。
[0022] 帶有限制酶^i/?dIII和ZAoI的酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列如下： F:BamHI5'-CGGGATCCATGTCTGCCCTGAAGTTTCC R:XhoI5'-CCGCTCGAGTCAATGAGAAGTCTCGAC (3)將得到的重組質(zhì)粒pET-28a-GlulC轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) (Novagen)進(jìn)行表達(dá)， 得到C型0 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)。
[0023] (4)我們?cè)诖嗣傅幕A(chǔ)上，對(duì)其基因進(jìn)行突變改造，以pET-28a_GlulC為突變模 板，設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的核苷酸序列引物，以pET-28a-GlulC為擴(kuò)增模板，通過(guò)PCR反應(yīng)得 到包含突變氨基酸的全長(zhǎng)質(zhì)粒片段。
[0024] 用于定點(diǎn)突變的引物為：（下劃線部分為突變位點(diǎn)）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組質(zhì)粒，稱為pET-28a-GlulC，其特征在于，所述重組質(zhì)粒源于pET-28a，并包 含有白蟻的葡萄糖苷酶基因DNA序列，其中所述的白蟻的葡萄糖苷酶基因DNA序 列的GenBank登錄號(hào)為
2. -種C型0 -葡萄糖苷酶，其特征在于，所述C型0 -葡萄糖苷酶由權(quán)利要求1所述 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入價(jià)〇7i. BL21 (DE3)表達(dá)所得。
3. -種C型3 -葡萄糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體是對(duì)權(quán)利要求2所述的C 型葡萄糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變得到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種C型3 -葡萄糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體的 氨基酸序列為以下任意一項(xiàng)所述： (1) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第170位的賴氨酸K變?yōu)榻z氨酸S或色氨酸W; (2) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第182位的苯丙氨酸F變?yōu)榧琢虬彼酠; (3) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第252位的氨基酸組氨酸H變?yōu)樘於０種。
5. 編碼如權(quán)利要求4所述的一種C型0 -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列。
6. -種突變質(zhì)粒，稱為pET-28a- GlulC-X (X為原始氨基酸-位置-突變后氨基酸)， 其特征在于，所述質(zhì)粒包含有權(quán)利要求5所述的C型0 -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列。
7. -種突變體表達(dá)重組菌株，其特征在于，所述菌株包含有權(quán)利要求6所述的突變質(zhì) 粒。
8. -種C型0 -葡萄糖苷酶突變體酶，其特征在于，所述突變體酶由IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo) 權(quán)利要求7所述的突變體表達(dá)菌株獲得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種C型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達(dá)質(zhì)粒和重組菌，具體涉及的是一種酶活性顯著提高的C型β-葡萄糖苷酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明將來(lái)源于臺(tái)灣白蟻的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將第170位的賴氨酸K分別變?yōu)榻z氨酸S和色氨酸W，第182位的苯丙氨酸F變?yōu)榧琢虬彼酠，第252位的氨基酸組氨酸H變?yōu)樘於０種，分別表示為Glu1C- K170S、Glu1C- K170W、Glu1C- F182M、Glu1C- H252N；本發(fā)明所得到的突變體的酶活性與突變前相比分別提高了5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍；本發(fā)明所得四株C型β-葡萄糖苷酶突變體的酶活都有了不同程度的提高，更適合于生物催化工藝的應(yīng)用，為工業(yè)化應(yīng)用提供了有利的基礎(chǔ)，更能滿足社會(huì)生產(chǎn)的要求，有廣闊的市場(chǎng)前景。
【IPC分類】C12N9-42, C12R1-19, C12N15-70, C12N15-56, C12N1-21
【公開(kāi)號(hào)】CN104531743
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410801031
【發(fā)明人】王繼峰, 吳黎明, 馮婷婷, 劉海濤, 周陽(yáng), 施海峰
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月22日