一種綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病理學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜瓜蔓枯病是由瓜類殼二孢菌（AscochytacitrullinaSmith,其無性世代為泄 根亞隔孢殼Didymellabryoniae)引起的真菌病害，在甜瓜的幼苗期至采收期均可發(fā)生。 該病害大多發(fā)生在植株莖基部和節(jié)間部，發(fā)病后致使整個植株失水枯萎而死亡。蔓枯病菌 寄主范圍廣泛，可危害萌蘆科的甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜等多種經(jīng)濟(jì)作物。冬春日光溫室及早 春、秋后大棚栽培均有發(fā)生，在生產(chǎn)上往往植株死亡率可達(dá)30 %?40 %，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，目 前其危害程度遠(yuǎn)高于瓜類枯萎病和疫病，已成為制約甜瓜生產(chǎn)的主要障礙。要獲得抗病品 種，首先要了解蔓枯病的分子遺傳基礎(chǔ)和致病機(jī)制，目前國內(nèi)外對于甜瓜蔓枯病的病原菌 的鑒定，類群分析研宄已取得了一些進(jìn)展，但缺乏對蔓枯病致病機(jī)理認(rèn)識。
[0003] 穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌株對于研宄蔓枯病菌致病相關(guān)基因、侵染過 程和致病機(jī)理，對于研宄蔓枯病菌侵染致病過程的組織學(xué)研宄和蔓枯病病原菌致病相關(guān)基 因、病原菌與寄主互作以及病原菌的功能基因組學(xué)研宄奠定基礎(chǔ)，同時，為蔓枯病害控制和 甜瓜抗蔓枯病抗病育種材料獲得提供理論基礎(chǔ)。然而，目前，國內(nèi)外已有利用不同遺傳轉(zhuǎn)化 方法轉(zhuǎn)化綠色熒光蛋白標(biāo)記（GFP)真菌的報道，但已報道的GFP標(biāo)記真菌菌株方法或未涉 及具體標(biāo)記相關(guān)細(xì)節(jié)，或標(biāo)記轉(zhuǎn)化步驟繁瑣，效率低下，熒光強(qiáng)度不穩(wěn)定。目前更沒有可參 考的蔓枯病菌GFP標(biāo)記菌株及方法報道，這已經(jīng)成為蔓枯病菌侵染致病過程與機(jī)理研宄的 瓶頸。目前更沒有可參考的GFP標(biāo)記蔓枯病菌菌株及方法報道。因此，急需獲得穩(wěn)定表達(dá) 綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌株及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種綠色熒光蛋白標(biāo)記 蔓枯病菌株的方法，以蔓枯病菌株（GSB20)為轉(zhuǎn)化體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將 綠色熒光蛋白基因標(biāo)記蔓枯病菌株（GSB20)基因組，獲得標(biāo)記綠色熒光蛋白的蔓枯病菌菌 株（GSB20-GFP)。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] 一種綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制備；
[0008] (2)制備含有GFP基因的農(nóng)桿菌菌液；
[0009] (3)蔓枯病菌株的GFP基因轉(zhuǎn)化標(biāo)記；
[0010] (4)對標(biāo)記有綠色熒光蛋白GFP的蔓枯病菌株進(jìn)行鑒定；
[0011] (5)獲得帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記GFP的蔓枯病菌株。
[0012] 進(jìn)一步的，所述蔓枯病菌菌株為蔓枯病菌菌株GSB20。
[0013] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)的具體操作步驟為：使用打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌 塊，在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后，在紫外光和普通光12小時交替培養(yǎng)10天，用培養(yǎng) 液A沖洗培養(yǎng)基表面，收集并稀釋孢子液，調(diào)節(jié)孢子液濃度至lxlO6個/mL，得到蔓枯病菌株 GSB20孢子懸浮液，備用。
[0014] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)的具體操作步驟為：將攜帶表達(dá)綠色熒光蛋白載體pGFP 的農(nóng)桿菌AGL-1在新鮮的平板B上劃線，28°C培養(yǎng)48h后，挑取單克隆，接種到5mL培養(yǎng)液 B中，于25°C，220rpm振蕩培養(yǎng)48h后用紫外分光光度計測0D6(J直，用培養(yǎng)液A稀釋，使菌 液0D_= 0. 10,然后將菌液稀釋液在28°C振蕩培養(yǎng)4h，得到AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用。
[0015] 進(jìn)一步的，所述步驟（3)蔓枯病菌株的GFP基因轉(zhuǎn)化標(biāo)記方法如下：
[0016] 1)將步驟（2)中制備的AGL-1農(nóng)桿菌菌液和步驟（1)中制備的蔓枯病菌株GSB20 孢子懸浮液等體積混合，取200yL混合液均勻涂布于不含抗生素的IM共培養(yǎng)平板上的硝 酸纖維素濾膜表面，24°C避光共培養(yǎng)24h;
[0017] 2)共培養(yǎng)24h后，將濾膜揭下，正鋪到培養(yǎng)基C上，24°C培養(yǎng)168h，生長出轉(zhuǎn)化子；
[0018] 3)用無菌接種環(huán)挑取單個轉(zhuǎn)化子接種到PDA篩選平板上進(jìn)行二次篩選，25°C培 養(yǎng)，保存轉(zhuǎn)化子GSB20-GFP，用于陽性鑒定。
[0019] 進(jìn)一步的，所述的步驟（1)、（2)中的培養(yǎng)液A為加入了 400ymol噸4乙酰丁香酮 的頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；平板B是加入了 50mg噸―1卡那霉素和50mg噸―1 利福平的YEB平板；培養(yǎng)液B是加入了 50mg?L-1卡那霉素和50mg?L―1利福平的麗液體 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0020] 進(jìn)一步的，所述的步驟（3)中的培養(yǎng)基C是加入了 300mg噸―1特美汀和100mg噸-1 潮霉素的馬鈴薯固體培養(yǎng)基。
[0021] 進(jìn)一步的，所述步驟（4)的具體操作步驟為：
[0022] 1)采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特異性引物、綠色熒光蛋白基 因的特異性引物檢測陽性轉(zhuǎn)化子為被標(biāo)記綠色熒光蛋白基因的蔓枯病菌株；
[0023] 2)采用OLYMPUSDP72熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子是否攜帶綠色熒光蛋白基因。
[0024] 進(jìn)一步的，所述的步驟（4)中的真菌ITS引物為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 蔓枯病菌菌株分生孢子液的制備； (2) 制備含有GFP基因的農(nóng)桿菌菌液； (3) 蔓枯病菌株的GFP基因轉(zhuǎn)化標(biāo)記； (4) 對標(biāo)記有綠色熒光蛋白GFP的蔓枯病菌株進(jìn)行鑒定； (5) 獲得帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記GFP的蔓枯病菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔓枯病菌菌株為蔓枯病菌菌株 GSB20。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)的具體操作步驟為：使用 打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌塊，在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后，在紫外光和普通光12 小時交替培養(yǎng)10天，用培養(yǎng)液A沖洗培養(yǎng)基表面，收集并稀釋孢子液，調(diào)節(jié)孢子液濃度至 lxlO 6個/mL，得到蔓枯病菌株GSB20孢子懸浮液，備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)的具體操作步驟為：將攜帶 表達(dá)綠色熒光蛋白載體pGFP的農(nóng)桿菌AGL-1在新鮮的平板B上劃線，28°C培養(yǎng)48h后，挑 取單克隆，接種到5mL培養(yǎng)液B中，于25°C，220rpm振蕩培養(yǎng)48h后用紫外分光光度計測 〇D_值，用培養(yǎng)液A稀釋，使菌液0D _= 0. 10,然后將菌液稀釋液在28°C振蕩培養(yǎng)4h，得到 AGL-1農(nóng)桿菌菌液，備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)蔓枯病菌株的GFP基因轉(zhuǎn)化 標(biāo)記方法如下： 1) 將步驟（2)中制備的AGL-1農(nóng)桿菌菌液和步驟（1)中制備的蔓枯病菌株GSB20孢子 懸浮液等體積混合，取200 y L混合液均勻涂布于不含抗生素的IM共培養(yǎng)平板上的硝酸纖 維素濾膜表面，24°C避光共培養(yǎng)24h ; 2) 共培養(yǎng)24h后，將濾膜揭下，正鋪到培養(yǎng)基C上，24°C培養(yǎng)168h，生長出轉(zhuǎn)化子； 3) 用無菌接種環(huán)挑取單個轉(zhuǎn)化子接種到PDA篩選平板上進(jìn)行二次篩選，25°C培養(yǎng)，保 存轉(zhuǎn)化子GSB20-GFP，用于陽性鑒定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步驟（1)、（2)中的培養(yǎng)液A 為加入了 400 y mol ? I71乙酰丁香酮的頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，頂液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；平板B是 加入了 50mg .I71卡那霉素和50mg .L 4利福平的YEB平板；培養(yǎng)液B是加入了 50mg .Lh卡 那霉素和50mg ? I71利福平的MM液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步驟（3)中的培養(yǎng)基C是加 入了 300mg ? L-1特美汀和100mg ? L-1潮霉素的馬鈴薯固體培養(yǎng)基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（4)的具體操作步驟為： 1) 采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特異性引物、綠色熒光蛋白基因的 特異性引物檢測陽性轉(zhuǎn)化子為被標(biāo)記綠色熒光蛋白基因的蔓枯病菌株； 2) 采用OLYMPUS DP72熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子是否攜帶綠色熒光蛋白基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（4)的具體操作步驟為： 1) 采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特異性引物、綠色熒光蛋白基因的 特異性引物檢測陽性轉(zhuǎn)化子為被標(biāo)記綠色熒光蛋白基因的蔓枯病菌株； 2) 采用OLYMPUS DP72熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子是否攜帶綠色熒光蛋白基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的步驟（4)中的真菌ITS引物 為： ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'、 鑒定蔓枯病菌株特異性引物為： DB17F :5' -GCAGTCAATCCTTATCC-3'， DB17R:5 ' -CGAAAGATTGTGTGACC-3 '， 綠色熒光蛋白基因的特異性引物為： GFP-F :5' -ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3'， GFP-R :5' -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3'。
【專利摘要】一種綠色熒光蛋白標(biāo)記蔓枯病菌的方法，包括如下步驟：(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制備；(2)制備含有GFP基因的農(nóng)桿菌菌液；(3)蔓枯病菌株的GFP基因轉(zhuǎn)化標(biāo)記；(4)對標(biāo)記有綠色熒光蛋白GFP的蔓枯病菌株進(jìn)行鑒定；(5)獲得帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記GFP的蔓枯病菌株。本發(fā)明以蔓枯病菌株GSB20為轉(zhuǎn)化體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將綠色熒光蛋白基因標(biāo)記蔓枯病菌株GSB20基因組，獲得標(biāo)記綠色熒光蛋白的蔓枯病菌菌株GSB20-GFP。
【IPC分類】C12N15-80, C12R1-645
【公開號】CN104531750
【申請?zhí)枴緾N201410817214
【發(fā)明人】姚協(xié)豐, 羊杏平, 李蘋芳, 張曼, 徐錦華, 劉廣
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月24日