一種應(yīng)用乙酰輔酶a合成聚3-羥基丙酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]3-輕基丙酸(3-hydroxyprop1nic acid，縮寫為 3-HP)分子式 C3H6O3，一種糖楽狀物質(zhì)，易溶于水、乙醇、乙醚，一般用于有機(jī)合成。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，3-HP與乳酸互為同分異構(gòu)體，該分子帶有兩個官能團(tuán)羥基和羧基，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的前體。能夠作為生物源聚合物的單體，而受到各國科學(xué)家的關(guān)注。工業(yè)上，3-HP是近年來興起的一種重要的化學(xué)中間體，如3-HP可作為合成生物可降解熱塑性聚酯(PHA)的原料，合成聚3-羥基丙酸的單體及殺蟲劑。還可用于生產(chǎn)涂料、膠黏劑、水處理化學(xué)品和個人護(hù)理用品。另外，與醇酯化作用生成酯，氧化生成丙二酸，脫水生成丙烯酸，還可通過還原作用生成1，3_丙二醇等。其中1，3-丙二醇可用作溶劑、抗凍劑或保護(hù)劑以及新型聚酯-聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的單體。該聚酯具有優(yōu)良的特性，如抗紫外，抗內(nèi)應(yīng)力、低水吸附、低靜電及生物可降解，可循環(huán)利用?；?-HP的這些優(yōu)良特性，其在商業(yè)上具有重大的開發(fā)價值。2004年8月的美國能源部報告將3-HP列為當(dāng)前世界上12種最具開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。
[0003]目前，國際上具有工業(yè)應(yīng)用前景的3-HP的合成方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)3-HP主要有丙烯酸水合法，3-羥基丙醛氧化法，3-羥基丙腈水解法及雷福爾馬斯基(Reformatsky)反應(yīng)。
[0004]微生物發(fā)酵法的代表是美國卡吉爾(Cargi I I)公司和Code—種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法is公司共同合作研宄了 “以谷物類碳水化合物”生產(chǎn)3-HP的發(fā)酵新工藝，于2002年申請了專利。專利中論述了生產(chǎn)3-HP的兩種方法:一種是構(gòu)建基因工程菌，發(fā)酵后在胞內(nèi)或胞外得到3-HP ;另一種是直接利用酶在無細(xì)胞體系中生產(chǎn)3-HP。
[0005]微生物發(fā)酵法雖綠色環(huán)保，但設(shè)備及生產(chǎn)過程復(fù)雜且國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)工藝不成熟，發(fā)酵時間較長，由于菌種的原因，生產(chǎn)出的產(chǎn)物提純過程繁瑣，產(chǎn)率也低，所得水溶液中3-HP的含量較低。此外生物法制備得到3-HP價格昂貴且來源不足，滿足不了市場的需求，只有少量合成供實驗室使用，應(yīng)用前景有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種產(chǎn)率更高，制備所需時間更短的應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法。
[0007]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟:
[0008](I)構(gòu)建共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)的重組宿主細(xì)胞；
[0009](2)將步驟(I)構(gòu)建得到的重組宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)臅r間；
[0010](3)收集菌體，離心，水洗，凍干后，氯仿萃取，得到的聚3-羥基丙酸產(chǎn)物。
[0011 ] 所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0012]所用構(gòu)建重組宿主細(xì)胞的方法為分子克隆方法，即將步驟(I)中所述的各種酶構(gòu)建到可誘導(dǎo)的啟動子的控制下。
[0013]所述步驟(2)中的表達(dá)誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0014]所述的培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)中適于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌生長的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基的碳源為成本低的葡萄糖。
[0015]所述乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)為沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶基因。
[0016]所述丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)為埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因。
[0017]所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)為橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因。
[0018]所述聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)為產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因。
[0019]本發(fā)明的工作原理及有益效果是:以葡萄糖作為原始材料，利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸，利用常規(guī)分子重組克隆技術(shù)將多種基因的核苷酸序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件可操作性連接或彼此之間可操作性連接，然后克隆到適宜的大腸桿菌細(xì)胞中，并且篩選得到同時包含聚羥基脂肪酸合成酶、丙酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A羧化酶這四種酶活性的重組大腸桿菌菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，乙酰輔酶A作為糖代謝的中間體，原料來源更廣泛，成本更低；此外，從乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的過程中，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]實施例:
[0022]—種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟:
[0023](I)構(gòu)建共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)的重組宿主細(xì)胞；
[0024](2)將步驟(I)構(gòu)建得到的重組宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)臅r間；
[0025](3)收集菌體，離心，水洗，凍干后，氯仿萃取，得到的聚3-羥基丙酸產(chǎn)物。
[0026]乙酰輔酶A是能源物質(zhì)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路——三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用以ATP的合成。乙酰輔酶A是合成脂肪酸、酮體等能源物質(zhì)的前體物質(zhì)，也是合成膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。葡萄糖的有氧氧化會轉(zhuǎn)化成丙酮酸，再轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，最后分解為C02+H20，此過程在只能有線粒體的細(xì)胞中進(jìn)行，并且必須要有氧氣供應(yīng)。
[0027]所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0028]所用構(gòu)建重組宿主細(xì)胞的方法為分子克隆方法，即將步驟(I)中所述的各種酶構(gòu)建到可誘導(dǎo)的啟動子的控制下。
[0029]所述步驟(2)中的表達(dá)誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0030]所述的培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)中適于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌生長的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基的碳源優(yōu)選為成本低的葡萄糖或甘油。
[0031]所述乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)為沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶基因。
[0032]所述丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)為埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因。
[0033]所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)為橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因。
[0034]所述聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)為產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因。
[0035]本發(fā)明以葡萄糖作為原始材料，利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸，利用常規(guī)分子重組克隆技術(shù)將多種基因的核苷酸序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件可操作性連接或彼此之間可操作性連接，然后克隆到適宜的大腸桿菌細(xì)胞中，并且篩選得到同時包含聚羥基脂肪酸合成酶、丙酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A羧化酶這四種酶活性的重組大腸桿菌菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，乙酰輔酶A作為糖代謝的中間體，原料來源更廣泛，成本更低；此外，從乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的過程中，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0036]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于:包括下述步驟: (1)構(gòu)建共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(PhaC)的重組宿主細(xì)胞； (2)將步驟(I)構(gòu)建得到的重組宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)臅r間； (3)收集菌體，離心，水洗，凍干后，氯仿萃取，得到的聚3-羥基丙酸產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所用構(gòu)建重組宿主細(xì)胞的方法為分子克隆方法，即將步驟(I)中所述的各種酶構(gòu)建到可誘導(dǎo)的啟動子的控制下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述步驟(2)中的表達(dá)誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為適于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌生長的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)為沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)為埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)為橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸合成酶基因(PhaC)為產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的方法，包括下述步驟：(1)構(gòu)建共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源酶基因的重組宿主細(xì)胞；(2)將重組宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑；(3)收集菌體，離心，水洗，凍干后，氯仿萃取。本發(fā)明以葡萄糖作為原始材料，利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸，乙酰輔酶A作為糖代謝的中間體，原料來源更廣泛，成本更低，生產(chǎn)工藝簡單，成本明顯降低。
【IPC分類】C12R1-22, C12R1-19, C12P7-62
【公開號】CN104531786
【申請?zhí)枴緾N201410763819
【發(fā)明人】李申
【申請人】燃點科技（天津）有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月10日