制備花生四烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及花生四烯酸，尤其是涉及制備花生四烯酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生四稀酸（ArachidonicAcid，簡稱ARA，即5,8,11，14-二十碳四稀酸）屬于 ?-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，由于人體內(nèi)不具備相應(yīng)的酶系統(tǒng)來合成特定的不飽和雙 鍵，因此被認(rèn)為是人體必需脂肪酸，是許多二十碳衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素 (PGI2)、血栓烷A2(TXA2)、白三烯LeukotireneB4(LTB4)*C4(LTC4)的直接前體。ARA還具 有調(diào)節(jié)體內(nèi)多種離子通道作用，控制細(xì)胞膜的通透性，維持機(jī)體保水性等許多重要的生理 功能。同時(shí)研宄表明，花生四烯酸對(duì)嬰兒的大腦發(fā)育和視覺功能的完善有著極為重要的意 義，花生四烯酸對(duì)高血壓、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的預(yù)防與治療也有顯著的效果 (Rogeretal.BiotechnologyBioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四稀酸 既是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，又是人類重要的保健品。ARA作為人體必需脂肪酸發(fā)揮著無可替代的 作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] ARA主要來源有植物、動(dòng)物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但ARA在動(dòng)物組織 中含量低，來源也有限，而微生物發(fā)酵法則為生產(chǎn)ARA開辟了新途徑，它具有不受原材料及 氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、ARA含量高等特點(diǎn)，近年來已成為國內(nèi)外研宄的熱 點(diǎn)。國際上開展產(chǎn)多不飽和脂肪酸（PFUAs)的微生物研宄主要集中在以下幾個(gè)方面：（1)產(chǎn) PFUAs菌種的分離與選育；（2)培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化；（3)培養(yǎng)方式的研宄（包括批 式、補(bǔ)料、連續(xù)培養(yǎng)工藝等）；(4)PFUAs的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。目前，人們僅發(fā)現(xiàn)接合菌綱 是比較具有研宄價(jià)值的的一個(gè)綱，而且普遍看好被孢霉，認(rèn)為它是生產(chǎn)ARA、EPA、DHA最有 潛力的菌種。目前，日本、美國等國家已經(jīng)先后問世了ARA的發(fā)酵產(chǎn)品，國內(nèi)在這一領(lǐng)域的 研宄起步晚，雖對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA方面作了一些研宄，但還存在著生物量偏低，油脂含 量較低等問題，離大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)仍有一定的距離。
[0004] 中國專利CN101613724公開一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法， 包括有下述步驟：首先在恒溫?fù)u床中將高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵 培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計(jì)為10%? 90% ;發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進(jìn)行浸提 或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進(jìn)一步處理獲得目標(biāo)產(chǎn)品，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提 后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌柏，該發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花 生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供制備花生四烯酸的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取 4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖40g/L;酵母粉5g/L;MgS04-7H20 0.lg/L; KH2P040. 5g/L;CaC030. 05g/L;ZnS04-7H20 0?lg/L;pH6. 0)的 250mL三角瓶，28 °C、150rpm 培養(yǎng)5?6d，得到優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L;酵母粉或玉米漿lOg/L;谷氨酸1.Og/L; MgS04-7H200.lg/L;KH2P042.Og/L;CaC030 . 05g/L;ZnS04-7H20 0?lg/L;混合微量元素lmL/L; 混合維生素lmL/L;pH調(diào)至6. 0 ;
[0008] 2)對(duì)高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)，將步驟 1)中的優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基；
[0009] 3)對(duì)高山被孢霉在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入 混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)168h后收獲干菌體、油脂和ARA。
[0010] 在步驟1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、 CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20等；所述混合維生素可包括維生素B12、生物素、維生 素&、泛酸鈣等。
[0011] 在步驟2)中，所述培養(yǎng)的方法可與步驟1)中的培養(yǎng)方法相同；所述玉米漿和酵母 粉的質(zhì)量比可為3 : 8。
[0012] 在步驟3)中，所述混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基的加入量可為1. 5L;所述混合氮源優(yōu)化培 養(yǎng)基中葡萄糖的初始濃度為60g/L，接種量10%，初始pH用25%氨水控制在6. 0?6. 5,溫 度28°C、轉(zhuǎn)速250rpm;所述干菌體可得36g/L，油脂可得16g/L，ARA可得6. 5g/L。
[0013] 所述高山被孢霉可以接種適量的被孢霉至載有培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床上培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100?300rpm，較好的為150?200rpm。
[0014] 本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基的組成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麥芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是較適宜的碳源，來源簡單，價(jià)格低廉，使用量為30? 80g/L。對(duì)于搖瓶種子培養(yǎng)，一般將使用量降低至10?30g/L，可根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間及所要求 的生物量密度來選擇用量。具體合適的用量選擇，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)操作確 定碳源的種類及合適用量。同時(shí)，可視微生物的生長情況，選擇一次性加入全部碳源或者分 批補(bǔ)入。氮源可以選擇酵母粉、玉米漿、蛋白胨、大豆粉等中的至少一種，酵母粉或者玉米漿 被認(rèn)為是比較好的氮源，添加濃度在5?15g/L，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作 確定氮源的種類及用量。
[0015] 可選擇使用單一氮源或混合氮源，更好的結(jié)果是使用混合氮源（玉米漿、酵母粉） 為發(fā)酵罐培養(yǎng)的適宜氮源，且二者的質(zhì)量比例對(duì)于油脂的積累影響較大，可利用響應(yīng)面分 析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步優(yōu)化碳氮源的組合，較好的兩種氮源比例為3:8 (w/w)。
[0016] 溫度低于20°C高山被孢霉將會(huì)開始大量產(chǎn)生EPA，而培養(yǎng)要求得到較高含量的 ARA，同時(shí)盡量減低或避免產(chǎn)生EPA，培養(yǎng)溫度通常保持在25?30°C。微生物發(fā)酵生產(chǎn) PUFAs，其最高產(chǎn)量一般是在對(duì)數(shù)期后期或穩(wěn)定期前期，因此要在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最大可 能的生物量及總脂肪酸的含量，一般來說，最適收獲ARA的時(shí)間是在第5?6天。
[0017] 真菌生長的pH范圍較廣，更偏好于在偏酸環(huán)境中生長，pH在4. 0至8. 0之間均可 以正常生長，本發(fā)明的實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)，初始pH6. 0?6. 5,培養(yǎng)過程中pH在7?8之間有 利于ARA的積累；pH4?5之間有利于生物量的積累，在培養(yǎng)過程中可分階段的調(diào)節(jié)pH水 平以適應(yīng)所要求的生長環(huán)境。
[0018] 接種量可以在2%至14% (V/V)，接種量低，生物量達(dá)不到所要求的水平，接種量 高，在生物量積累到一定程度將會(huì)抑制菌體的繼續(xù)生長，在搖瓶培養(yǎng)中，接種控制在3%? 5% (V/V)，而在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，接種量控制在8%?10% (V/V)能得到較好的結(jié)果。
[0019] 培養(yǎng)基中碳氮比影響真菌油脂的積累，碳氮比在10 : 1至