一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及提高淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 t/ias)合成四稀大環(huán)內(nèi)醋類抗生素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前許多自主開(kāi)發(fā)的新型農(nóng)用抗生素只是停留在實(shí)驗(yàn)室階段，其中關(guān)鍵的原因就 是生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平未達(dá)到工業(yè)化要求。所以，當(dāng)前擺在研宄工作者面前一個(gè)主要的問(wèn)題 就是提高現(xiàn)有和正在開(kāi)發(fā)的農(nóng)用抗生素生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平，加快農(nóng)用抗生素的產(chǎn)業(yè)化進(jìn) 程。常規(guī)的微生物誘變育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力、隨機(jī)性高，通過(guò)基因工程手段已可實(shí)現(xiàn)單基因編碼的 酶類的定向進(jìn)化并進(jìn)行超量表達(dá)，但對(duì)需要成簇基因編碼的抗生素等天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提高 則困難重重。大量研宄表明，利用核糖體工程技術(shù)就是向微生物核糖體或RNA聚合酶中引 入特定的突變，有助于次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，還可能誘發(fā)或激活野生菌株產(chǎn)生原本不 產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物生物合成途徑。通常所采用的方法是使用能夠作用于核糖體或RNA聚合酶 的抗生素(如鏈霉素、利福平、慶大霉素等）處理微生物，獲得高抗性菌株。核糖體工程技術(shù) 簡(jiǎn)單易行、組合方便，在工業(yè)微生物育種及微生物資源潛力挖掘等方面都有良好的應(yīng)用前 景。利用核糖體工程技術(shù)改良淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌使其提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（四霉素 P，四烯菌素B和四霉素A)合成能力的研宄未見(jiàn)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（51 的固體培養(yǎng)基 上添加高濃度的巴龍霉素，獲得對(duì)巴龍霉素具有較強(qiáng)抗性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，該 突變株產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D高。該發(fā)明為提高淀粉酶產(chǎn) 色鏈霉菌合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力提供了一種可靠的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)野生型菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D產(chǎn)素水平低的不足，提供一 種提高其產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了一株高產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株P(guān)31。
[0005] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法按以下步驟進(jìn)行： (1)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株的獲得 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（^ (ocAroffiogefles)，定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（51 從浙江臨安天目山采集的土壤中分離得到。該菌株已在中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 保藏日期2007年5月25日，保藏登記號(hào)CGMCCNo. 2060。前期研宄表明用GYM固體培養(yǎng) 基培養(yǎng)，巴龍霉素抑制淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的MIC值為50yg/mL。
[0006] 制備GYM固體平板，本發(fā)明中所述的GYM固體平板除特殊說(shuō)明外均含有100yg/ mL的巴龍霉素；GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度為葡萄糖4g/L，Driedyeastextract4g/ L，DriedMaltextract-S10g/L，N-Z-AmineA1g/L，NaCl2g/L，OB溶液 600yL， 定容后用2mol/LNaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3,瓊脂20g/L;其中OB溶液配置方法：稱取 MgS04 ? 7H20 25g，CuS04 ? 5H20 2. 5g，F(xiàn)eS04 ? 7H20 3. 75g，MnS04 ? 5H20 1. 8g，CaCl2 ? 2H20 17. 5g，ZnS04 ? 7H20 4. 5g，加500mL水，用前搖勻；用移液槍吸取100yL淀粉酶產(chǎn)色鏈霉 菌D孢子懸液（1X106個(gè)/mL)于GYM固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勾，置28°C培養(yǎng)箱 培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C培養(yǎng)箱培 養(yǎng)5天，能再次在新的GYM固體平板上長(zhǎng)出的菌株即為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株。
[0007] (2)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株液體發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)液為GYM液體培養(yǎng)基，組分與濃度為葡萄糖4g/L，Driedyeast extract4g/L，DriedMaltextract-S10g/L，N-Z-AmineA1g/L，NaCl2g/L,OB 溶液600yL，定容后用2mol/LNaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：稱取 MgS04 ? 7H20 25g，CuS04 ? 5H20 2. 5g，F(xiàn)eS04 ? 7H20 3. 75g，MnS04 ? 5H20 1. 8g，CaCl2 ? 2H20 17. 5g，ZnS04 ? 7H20 4. 5g，加500mL水，用前搖勻；每300mL三角瓶裝60mL發(fā)酵培養(yǎng)液， 配制后121°C滅菌20min，待冷卻至50 °C，無(wú)菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉 菌D和突變株孢子接種，28°C± 1°C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，上 清液用于四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量的測(cè)定； (3)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè) 方法：采用SHIMADZUC18色譜柱（150mmX4. 6mm，5ym)，甲醇為流動(dòng)相A，水為流 動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0-30min，65%-80%A;30-50min，80%-100%A;50-60min， 100%-65%A;流速 1. 0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 305nm，柱溫 30 °C。
[0008] 本發(fā)明的有益效果： 一是本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的固體培養(yǎng)基上添加高濃度的巴龍霉素， 獲得對(duì)巴龍霉素具有較強(qiáng)抗性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，該突變株產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗 生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D高，這為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的產(chǎn)素水平提高提供了一 種可靠的方法； 二是本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株P(guān)31， 為今后四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法做進(jìn)一步 描述。
[0010] 實(shí)施例1 :淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株的獲得 制備GYM固體平板，本發(fā)明中所述的GYM固體平板除特殊說(shuō)明外均含有100yg/mL的 巴龍霉素，用移液槍吸取100UL淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子懸液（1X106個(gè)/mL)于GYM固 體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的GYM固 體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，能再次在新的GYM固體平板上長(zhǎng) 出的菌株即為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，總共獲得5株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，編號(hào)分 別為P31，P32,P33,P34,P35 ; 實(shí)施例2 :淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株液體發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)液為GYM液體培養(yǎng)基，組分與濃度為葡萄糖4g/L，Driedyeast extract4g/L，DriedMaltextract-S10g/L，N-Z-AmineA1g/L，NaCl2g/L，OB溶 液600yL，定容后用2mol/LNaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：稱取 MgS04*7H20 25g,CuS04*5H20 2.5g,FeS04*7H20 3.75g,MnS04*5H20 1. 8g,CaC12*2H20 17. 5g，ZnS04*7H20 4. 5g，加500mL水，用前搖勻；每300mL三角瓶裝60mL發(fā)酵培養(yǎng)液， 配制后121°C滅菌20min，待冷卻至50 °C，無(wú)菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉 菌〇、突變株？31、？32、？33、？34、？35孢子接種，28°0±11：，發(fā)酵培養(yǎng)6天 ；發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心10min，上清液用于四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量的測(cè)定； 實(shí)施例3 :四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè) 方法：采用SHIMADZUC18色譜柱（150mmX4. 6mm，5ym)，甲醇為流動(dòng)相A，水為流 動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0-30min，65%-80%A;30-50min，80%-100%A;50-60min， 100%-65%A;流速 1. 0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 305nm，柱溫 30 °C。
[0011] 表1淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，其特征在于通過(guò)在培養(yǎng)淀粉酶產(chǎn)色鏈 霉菌D的固體培養(yǎng)基上添加巴龍霉素，獲得對(duì)巴龍霉素具有較強(qiáng)抗性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 突變株，對(duì)突變株進(jìn)行液體培養(yǎng)發(fā)酵，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行尚心。
2. 權(quán)利要求1所述的提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的液體 培養(yǎng)基中含有葡萄糖，Dried yeast extract，Dried Malt extract-S，N-Z_Amine A，NaCl， MgS04 ? 7H20, CuS04 ? 5H20, FeS04 ? 7H20, MnS04 ? 5H20, CaCl2 ? 2H20, ZnS04 ? 7H20。
3. 權(quán)利要求1所述的提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的巴龍 霉素的濃度為100 yg/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法通過(guò)在培養(yǎng)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）D的固體培養(yǎng)基上添加100 μg/mL的巴龍霉素，獲得對(duì)巴龍霉素具有較強(qiáng)抗性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D強(qiáng)。CGMCC No. 206020070525
【IPC分類】C12R1-525, C12P17-08
【公開(kāi)號(hào)】CN104531798
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410785270
【發(fā)明人】申屠旭萍, 俞曉平, 湯谷, 劉楠楠, 郝培應(yīng), 許益鵬, 王正亮, 劉光富
【申請(qǐng)人】中國(guó)計(jì)量學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日