一種afg2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基及寄生曲霉的afg2產(chǎn)毒發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基及寄生曲霉的 AFG2產(chǎn)毒發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs)是由寄生曲霉、黃曲霉和集峰曲霉等其中的一 些產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸和致突變等三致作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已 鑒定出的AFs多達(dá)20余種，其中最為常見(jiàn)的是AFs是黃曲霉毒素Bl(AFBl)、黃曲霉毒素 B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1 (AFG2)、黃曲霉毒素G2(AFG2)。AFs可污染玉米、小麥、大豆和棉 籽等谷物及油料農(nóng)產(chǎn)品，亦可殘留在一些DDGS、小麥麩、大豆柏和棉籽柏等農(nóng)副產(chǎn)品中。當(dāng) AFs污染的農(nóng)產(chǎn)品作為人的食品時(shí)，會(huì)危害人的健康，輕度的可致亞健康狀況，嚴(yán)重可引起 肝臟病變，導(dǎo)致死亡；而AFs污染的農(nóng)副產(chǎn)品飼喂動(dòng)物時(shí)，常引起動(dòng)物生產(chǎn)性能下降、抗病 力降低，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡等。因此，食品和飼料中AFs的污染問(wèn)題引起了世界許多國(guó)家政 府和食品安全監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)的重視，設(shè)定了食品和飼料中的AFs限量標(biāo)準(zhǔn)。AFs的科學(xué)研宄也備 受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，在豬、奶牛和禽類(lèi)等動(dòng)物中開(kāi)展了相應(yīng)試驗(yàn)。
[0003] 然而，國(guó)內(nèi)報(bào)道的發(fā)酵培養(yǎng)基中AFG2最高濃度僅為46ppb(馮建蕾，2004)，因此在 開(kāi)展AFG2相關(guān)科學(xué)研宄時(shí)，均需從國(guó)外進(jìn)口價(jià)格昂貴（930RMB/mg)的AFG2樣品，試驗(yàn)成本 高，或需要進(jìn)行商品預(yù)訂，給相關(guān)科學(xué)研宄帶來(lái)不便。綜上所述，開(kāi)發(fā)出AFG2的發(fā)酵培養(yǎng)基 及應(yīng)用方法，可為動(dòng)物的AFG2毒理試驗(yàn)和AFs的食品安全研宄提供試驗(yàn)素材。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，用于解決目前自然感染霉菌的谷物中 AFG2濃度低、不均勻、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明還提供了一種寄生曲霉的AFG2產(chǎn)毒發(fā)酵方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量3-5%的酵母浸 膏，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為增菌培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的增菌培養(yǎng)基各組分按重量百分比計(jì)包括：25-30 %馬鈴薯， 10-15 %葡萄糖，1-3 %瓊脂，3-5%酵母浸膏，0. 4%復(fù)合礦物鹽，0. 3g/L青霉素，0. 3g/L鏈 霉素，余量為水。發(fā)明人經(jīng)大量的試驗(yàn)顯示證明，利用本發(fā)明增菌培養(yǎng)基，在相同培養(yǎng)條件 下，寄生曲霉孢子復(fù)蘇所需的時(shí)間僅需2天，比傳統(tǒng)培養(yǎng)基的復(fù)蘇時(shí)間縮短4天，且孢子密 度提高10倍。目前，在進(jìn)行寄生曲霉增菌培養(yǎng)時(shí)，常規(guī)的培養(yǎng)基成分為：馬鈴薯、葡萄糖、瓊 脂和水，該培養(yǎng)基促寄生曲霉生長(zhǎng)效率低，耗時(shí)長(zhǎng)，易受雜菌污染，而本發(fā)明提供的增菌培 養(yǎng)基效率明顯提尚。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基各組分按重量百分比計(jì)包括：40-70%早秈米， 20-45 %棉籽柏，6-12 %蔗糖，0. 2-0. 5 %復(fù)合礦物鹽，3-5 %酵母浸膏，按比例配制完后，調(diào) 節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為15-20%。優(yōu)選的方案是，41. 6-51. 6 %早秈米，37. 9-44 %棉籽 柏，6-10. 9%蔗糖，0.5%復(fù)合礦物鹽，3-4%酵母浸膏。進(jìn)一步的，所述的早秈米和棉籽柏經(jīng) 粉碎，粒度達(dá)到20-40目標(biāo)準(zhǔn)。該固體發(fā)酵培養(yǎng)基所含碳水化合物（早秈米）、蛋白質(zhì)（棉 籽柏）、礦物質(zhì)（復(fù)合礦物鹽）和促生長(zhǎng)因子（酵母浸膏）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)恰好滿足寄生曲霉 高效產(chǎn)毒的條件，且比例適當(dāng)，可實(shí)現(xiàn)寄生曲霉高效產(chǎn)AFG2。在進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，現(xiàn) 有技術(shù)所用的培養(yǎng)基僅為調(diào)節(jié)了水分的粉碎玉米，即普通的玉米，成分單一，營(yíng)養(yǎng)成分不平 衡，所需的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，本發(fā)明人也曾嘗試采用單一的粉碎玉米培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，效 果也很差?，F(xiàn)有技術(shù)采用的培養(yǎng)基中AFG2濃度顯著低于本發(fā)明的固體發(fā)酵培養(yǎng)基AFG2濃 度。
[0010] 作為優(yōu)選，復(fù)合礦物鹽的制備方法如下：所述復(fù)合礦物鹽的組分以質(zhì)量百分比計(jì) 為：42-48%硝酸鈉，10-16%硫酸鎂，10-15%氯化鉀，18-24%磷酸氫二鉀，2. 7-5. 7%硫酸 鋅，2-5 %硫酸錳，0. 2-0. 8 %五水硫酸亞鐵；將上述各礦物鹽原料混合均勻，粉碎過(guò)80目分 樣篩后再次混合，得到復(fù)合礦物鹽。
[0011] 培養(yǎng)基的滅菌要求：所述的增菌培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別按比例配制好 (其中，增菌培養(yǎng)基中的青霉素和鏈霉素成分在滅菌結(jié)束后，待增菌培養(yǎng)基冷卻至40°C左 右加入混勻），用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5. 5-7. 0后，置于2L錐形瓶中，蓋上棉塞，在 121-123°C，0. 12MPa，滅菌20min，各培養(yǎng)基配制工作結(jié)束。
[0012] 增菌培養(yǎng)基平板制作：在生物安全柜中，將滅菌好的增菌培養(yǎng)基倒置在經(jīng)過(guò)滅菌 的直徑l〇cm培養(yǎng)皿中，自然冷卻。然后，將增菌培養(yǎng)基放在37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h，無(wú)菌生 長(zhǎng)者方可使用。
[0013] 一種AFG2發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用方法，包括菌種復(fù)活增殖和固體發(fā)酵培養(yǎng)兩個(gè)步驟，采 用寄生曲霉菌種進(jìn)行發(fā)酵，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行菌種復(fù)活增殖和固體發(fā)酵培 養(yǎng)。該方法采用上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵選用的菌種為寄生曲霉菌（來(lái)自中國(guó)普通微生 物菌種保藏管理中心，CGMCCNO. 3. 0124)，發(fā)酵工藝采用常規(guī)的固體發(fā)酵工藝。按照本發(fā)明 提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，AFG2在產(chǎn)毒培養(yǎng)基的固體風(fēng)干物中濃度可達(dá)914ppb，相比現(xiàn)有 技術(shù)的發(fā)酵效價(jià)，具有顯著的進(jìn)步。而且該方法發(fā)酵效率高，生產(chǎn)費(fèi)用低，填補(bǔ)了我國(guó)AFG2 的生產(chǎn)領(lǐng)域的空白，并可極大降低AFG2的毒理研宄領(lǐng)域的研宄成本。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明研制的增菌培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)菌污染干擾，霉菌復(fù)活增殖 快，孢子活力高，提高了工作效率。本發(fā)明研制的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)均衡，霉菌生長(zhǎng)旺 盛，培養(yǎng)周期短，僅需12-13天，相對(duì)普通大米培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間縮短5-7天，且AFG2濃度顯 著提高。本發(fā)明提供的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，主要采用早秈米、棉籽柏、蔗糖、復(fù)合礦物鹽和酵母 浸膏，原料易得、廉價(jià)。相對(duì)從國(guó)外進(jìn)口的AFG2,本發(fā)明提供的培養(yǎng)基生產(chǎn)出的AFG2價(jià)格可 降低80%以上。本發(fā)明提供的發(fā)酵方法，簡(jiǎn)單易行，可操作性強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0016] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均 可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。
[0017] 本發(fā)明的各實(shí)施例，以中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)提供的寄生曲 霉菌（Aspergillusparasiticus)CGMCCNO. :3. 0124,進(jìn)行闡述。
[0018] 實(shí)施例1-4增菌培養(yǎng)基的配制
[0019] 一種用于寄生曲霉菌菌種的增菌培養(yǎng)基，將表1所示的各組份混合后，用鹽酸和 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)增菌培養(yǎng)基pH值為5. 5-7. 0。
[0020] 表 1
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于：該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量3-5% 的酵母浸膏，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為增菌培養(yǎng)基或固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于：所述的增菌培養(yǎng)基各組分 按重量百分比計(jì)包括：25-30%馬鈴薯，10-15%葡萄糖，1-3%瓊脂，3-5%酵母浸膏，0. 4%復(fù)合 礦物鹽，0. 3g/L青霉素，0. 3g/L鏈霉素，余量為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于：所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基各 組分按重量百分比計(jì)包括：40-70%早秈米，20-45%棉籽柏，6-12%蔗糖，0. 2-0. 5%復(fù)合礦物 鹽，3-5%酵母浸膏，按比例配制完后，調(diào)節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為15-20%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于：所述的早秈米和棉籽柏預(yù) 先粉碎至粒度達(dá)到20-40目。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于：所述復(fù)合礦物鹽的組 分以質(zhì)量百分比計(jì)為：42-48%硝酸鈉，10-16%硫酸鎂，10-15%氯化鉀，18-24%磷酸氫二鉀， 2. 7-5. 7%硫酸鋅，2-5%硫酸錳，0. 2-0. 8%五水硫酸亞鐵；將上述各礦物鹽原料混合均勻，粉 碎過(guò)80目分樣篩后再次混合，得到復(fù)合礦物鹽。
6. -種寄生曲霉的AFG2產(chǎn)毒發(fā)酵方法，包括菌種復(fù)活增殖和固體發(fā)酵培養(yǎng)兩個(gè)步驟， 采用寄生曲霉菌種進(jìn)行發(fā)酵，其特征在于：采用權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行菌種復(fù) 活增殖和固體發(fā)酵培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的寄生曲霉的AFG2產(chǎn)毒發(fā)酵方法，其特征在于該方法包括如下 步驟： a、 采用增菌培養(yǎng)基進(jìn)行寄生曲霉孢子的復(fù)活增殖； b、 采用固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基及寄生曲霉的AFG2產(chǎn)毒發(fā)酵方法。該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量3-5%的酵母浸膏，發(fā)酵培養(yǎng)基為增菌培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明AFG2的產(chǎn)毒培養(yǎng)基解決了目前自然感染霉菌的谷物中AFG2濃度低、不均勻、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。
【IPC分類(lèi)】C12P17-18, C12N1-14, C12R1-66
【公開(kāi)號(hào)】CN104531800
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410733768
【發(fā)明人】熊江林, 侯永清, 丁斌鷹, 劉玉蘭, 邱銀生, 吳靈英
【申請(qǐng)人】武漢輕工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月4日