一種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21、18和13三體綜合征的陽性質(zhì)控品及其制備方法
【專利說明】一種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21、18和13三體綜合征的陽性質(zhì)控 品及其制備方法
[0001] 所屬領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，屬于胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測范疇， 涉及21、18、13三體綜合征檢測的陽性質(zhì)控品及其制備方法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 染色體非整倍體是指相對于人的正常的46條染色體而言，細(xì)胞中的某一條或幾 條染色體數(shù)目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切關(guān)系。該類疾病的 發(fā)病率隨著孕婦年齡的增高而增高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道我國每年出生染色體異常的新生兒約10 萬人，在活嬰兒中染色體異常者占0. 3%，而其中21三體、18三體、13三體綜合征是臨床最 常見和最易出現(xiàn)的染色體異常疾病。新生兒中染色體異常的發(fā)病率為1/160,其中21三體 綜合征（唐氏綜合征，DS)、18三體綜合征（愛德華氏綜合征）和13三體綜合征（帕陶氏 綜合征）是三種最主要常染色體非整倍體疾病，在新生兒中發(fā)病率分別為1/800?1/600、 1/7000?1/3500和1/6000?1/5000。目前對21三體、18三體、13三體綜合征的治療缺 乏有效方法，因此普及染色體疾病的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，對降低出生缺陷的發(fā)生有著非 常重要的意義。這有利于提高人口質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，尤其對高齡孕婦（大于35歲）的 胎兒進(jìn)行產(chǎn)前篩查，以防止染色體異?；純旱某錾?。
[0005] 在現(xiàn)有染色體異常檢測方法中，染色體核型分析技術(shù)是檢測染色體異常的"金標(biāo) 準(zhǔn)"，但核型分析在很大程度上又要依賴于細(xì)胞樣品的質(zhì)量。如果樣本細(xì)胞量小或被污染， 則很難或不能檢測出結(jié)果。目前，國內(nèi)外廣泛采用孕婦血清標(biāo)記物來大面積篩查DS胎兒。 由于DS胎兒的孕婦血清甲胎蛋白（AFP)和雌三醇（uE3)低于平均水平，而絨毛膜促性腺激 素（HCG)高于平均水平，因此，利用"三聯(lián)篩查"方法對妊娠期（孕15?21周）孕婦進(jìn)行 這三項(xiàng)指標(biāo)的檢測。該方法檢出率為48%?83%，假陽性率約為5%。這些檢測偏差的結(jié) 果將會(huì)給染色體異常新生兒家庭帶來痛苦，增加社會(huì)的負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確性、靈敏 度和可靠性都很高的染色體疾病的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的方法就會(huì)顯得尤為重要和迫在 眉睫。
[0006] 那么，利用高通量測序技術(shù)對胎兒染色體非整倍體進(jìn)行檢測的方法相比傳統(tǒng)方法 具有明顯優(yōu)勢。該方法只需抽取母體外周血進(jìn)行檢測，可避免傳統(tǒng)的侵入性方法可能給孕 婦和胎兒帶來的危害；另外直接檢測母親和胎兒的DNA序列，相比于檢測血清蛋白標(biāo)志物 和超聲波檢測，準(zhǔn)確性、靈敏度及可靠性都大大提高。因此，通過深度測序，能夠?qū)υ袐D血漿 微量胎兒游離DNA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，可以克服傳統(tǒng)檢測方法因胎兒游離DNA含量過低而導(dǎo)致 檢測結(jié)果假陰性過高的缺點(diǎn)。
[0007] 目前，市場上基于高通量基因測序法檢測21、18和13三體綜合征的診斷產(chǎn)品非 常少，且基本沒有提供配套的陽性質(zhì)控品，這嚴(yán)重影響染色體疾病的產(chǎn)前篩查和診斷的準(zhǔn) 確性和可靠性。本發(fā)明以高通量測序技術(shù)用于孕婦血漿游離胎兒DNA的染色體非整倍體 (T21、T18和T13)國家標(biāo)準(zhǔn)品為溯源，然后將患有21三體、18三體、13三體綜合征胎兒流產(chǎn) 組織的DNA都打斷成長度為160?200bp的DNA片段，按照特定比例將上述打斷的DNA片 段加入到正常未孕女性血漿中并混勻，最后提取混勻血漿游離DNA，制備陽性質(zhì)控品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21、18、13三體綜合征的陽性質(zhì)控品及 其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，發(fā)明了一種基于高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體 非整倍體21、18和13三體綜合征的陽性質(zhì)控品。
[0009] 本發(fā)明的陽性質(zhì)控品制備方法如下：
[0010] (1)取5?10例正常未孕女性血漿混合，抽提血漿游離DNA后測定DNA濃度；
[0011] (2)分別提取21、18和13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA，超聲波打斷成片段后 E-gel電泳回收160?200bp的片段并測DNA濃度；
[0012] (3)將各回收的流產(chǎn)組織DNA片段分別按下列公式加入混合血漿中；
[0013]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21、18和13三體綜合征的陽性質(zhì)控品及其制備方法，其特 征在于陽性質(zhì)控品由四種DNA和超純水組成，分別為正常未孕女性血漿游離DNA、21三體綜 合征胎兒流產(chǎn)組織DNA、18三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA、13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA 片段；且陽性質(zhì)控品的其制備方法為： (1) 取5?10例正常未孕女性血漿混合，抽提血漿游離DNA后測定DNA濃度； (2) 分別提取21、18和13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA，超聲波打斷成片段后E-gel 回收160?200bp的片段并測DNA濃度； (3) 將各回收的流產(chǎn)組織DNA片段分別按比例加入混合血漿中； (4) 提?。?)中血漿游離總DNA，溶解入超純水后制備成不同濃度的陽性質(zhì)控品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽性質(zhì)控品，其特征還在于所述"正常未孕女性血漿"為20? 40周歲的染色體結(jié)構(gòu)正常未孕女性的外周靜脈血漿。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽性質(zhì)控品，其特征還在于制備方法步驟（3)中所述"混合 血漿"為5?10例正常未孕女性血漿混合后的總血漿，步驟（4)中所述"血漿游離總DNA" 為分別將21、18、13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA片段按比例加入到混合血漿后所得血漿 中的所有DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的陽性質(zhì)控品，其特征還在于將回收的各流產(chǎn)組織DNA片 段分別按下列公式加入混合血漿中：
(其中：DNAT21、DNAT18、DNAn3分別為21、18、13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織DNA打斷回收 后加入混合血漿中的DNA量，DNAMix為正常未孕女性混合血漿中游離的DNA量）。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21、18和13三體綜合征的陽性質(zhì)控品及其制備方法，屬于胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測范疇。本發(fā)明的制備步驟包括：將患有21、18、13三體綜合征胎兒流產(chǎn)組織的DNA均打斷成長度為160～200bp的DNA片段；按比例分別將打斷后回收的流產(chǎn)組織DNA片段加入到混合血漿中；最后提取血漿游離總DNA，超純水稀釋后制備成不同濃度的陽性質(zhì)控品。本發(fā)明為一種白色透明DNA溶液，具有穩(wěn)定、易保存、便捷、無毒等優(yōu)點(diǎn)，且能夠有效的避免同一批次其它樣本的檢測結(jié)果的偏差，增加21、18和13三體綜合征無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104531842
【申請?zhí)枴緾N201410712021
【發(fā)明人】李明, 高旭年, 楊學(xué)習(xí), 雷孝鋒, 朱安娜, 楊旭, 李爾華
【申請人】中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年11月27日