一種MyD88基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種采用熒光定量PCR檢測(cè)基因突變的方 法，特別涉及一種MyD88基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可在突變含量只有 0. 1 %的臨床樣本中檢測(cè)出低至5個(gè)拷貝的突變DNA。
【背景技術(shù)】
[0002] MyD88 (髓樣分化因子88，myeloiddifferentiationfactor88)的相對(duì)分子量為 35kDa，包含2個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域。其C端帶有與TLR分子胞內(nèi)段相同的TIR結(jié)構(gòu)域，通過(guò)同 型相互作用與TLR/IL-1R相接，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；N端是死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD)，帶有 死亡結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子，參與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，通過(guò)DD招募、結(jié)合并活化其他帶有DD 的分子，如蛋白激酶IRAK，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)。MyD88作為一種銜接蛋白，可向細(xì)胞內(nèi) 傳遞信號(hào)，激活核因子-kB(NF-kB)等轉(zhuǎn)錄因子，引起多種炎性細(xì)胞因子以及抗凋亡分子 的釋放，從而參與人體固有免疫。目前一般認(rèn)為該通路的過(guò)度激活與自身免疫疾病相關(guān)，近 年來(lái)隨著研宄的深入，發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細(xì)胞也表達(dá)有該信號(hào)分子，參與多種腫瘤的發(fā)病。
[0003] 多項(xiàng)研宄已在數(shù)種B細(xì)胞腫瘤中發(fā)現(xiàn)了MyD88第265位氨基酸由亮氨酸變成苯丙 氨酸的突變（L265P)。此突變位點(diǎn)正好處于TLR結(jié)構(gòu)域，可導(dǎo)致NF-kB信號(hào)通路的異常激 活。Ngo等[1]通過(guò)RNA干擾、高通量mRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)29%的ABC分子亞型彌漫性大B細(xì)胞 淋巴瘤存在MyD88L265P突變，而在其他類型的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤中極 少或者沒(méi)有。有研宄認(rèn)為NF-kB信號(hào)途徑的持續(xù)激活可促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，途徑的持續(xù)過(guò) 度激活是ABC型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的特征[2]。Treon等[3]發(fā)現(xiàn)超過(guò)90%的華氏巨 球蛋白血癥具有MyD88L265P，這種突變體可以引發(fā)白介素-1受體相關(guān)激酶（interleuki n-lreceptor-associatedkinase，IRAK)介導(dǎo)的NF-kB信號(hào)的激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖。近年 來(lái)的研宄證實(shí)MyD88L265P是IgMMGUS、華氏巨球蛋白血癥常見的較為特異的基因突變，在 疾病的診斷、病理機(jī)制及療效評(píng)估方面均具有重要意義。
[0004] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是成年人中最為常見的非霍奇金淋巴瘤，通過(guò)分子表型， 可分為激活型（ABC)、生發(fā)中心型（GCB)、原發(fā)縱膈型（PMBL)等。其中ABC型預(yù)后最差，臨 床治療有效率不到40 %。上述研宄提示MyD88信號(hào)通路異常激活參與了B細(xì)胞腫瘤的發(fā) 生，以MyD88信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抑制劑可能成為治療B胞腫瘤的新手段。應(yīng)用分子診斷技 術(shù)準(zhǔn)確地檢測(cè)病人腫瘤細(xì)胞中MyD88基因突變狀態(tài)，從而選擇合適的靶向治療藥物，不僅 可對(duì)患者實(shí)行個(gè)性化治療，同時(shí)亦可為臨床評(píng)判病人的預(yù)后提供幫助。
[0005] 目前在臨床上檢測(cè)MyD88基因突變的通用方法為傳統(tǒng)的DNA直接測(cè)序法。DNA直 接測(cè)序法檢測(cè)靈敏度只有20?30%，即腫瘤組織樣本中必須要含有20?30%的突變陽(yáng)性 細(xì)胞才能被檢測(cè)出來(lái)；對(duì)于小樣本病理組織的檢測(cè)，直接測(cè)序法的檢測(cè)精度有限，難以滿足 實(shí)際應(yīng)用的需求。同時(shí)，該方法容易造成污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性；操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)（通常需要 2?3天才能出檢測(cè)結(jié)果）。針對(duì)此類問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速、高效、高靈敏度、操作 簡(jiǎn)便的MyD88基因突變檢測(cè)方法和試劑盒，僅需90分鐘即可完成MyD88基因L265P突變的 檢測(cè)，為臨床個(gè)體化用藥提供準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0006]參考文獻(xiàn)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)MyD88基因突變的特異性引物和探針，見本發(fā)明說(shuō)明書表1，P-SEQ-I? P-SEQ-22。
2. -種檢測(cè)MyD88基因突變的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物和 探針。
3. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)MyD88基因突變的檢測(cè)試劑盒，包括以下熒光定量PCR反 應(yīng)體系：
4. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)MyD88基因突變的檢測(cè)試劑盒，熒光定量PCR反應(yīng)條件 為：95°C預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入以下循環(huán)：72°C 20秒，95°C 15秒，65°C 20秒，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)； 72°C 20秒，95°C 15秒，60°C 20秒，共35個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集溫度設(shè)定在退火溫度。
5. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)MyD88基因突變的檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果判定方法為：以 HEX的信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值（Ct〈32)時(shí)表明樣品DNA中包含MyD88基因，且上樣量在允許范圍 內(nèi)，說(shuō)明FAM的信號(hào)可信、有效；以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng) 性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Ct值等于0或多35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果判定為陰性，Ct值< 32時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為 陽(yáng)性，Ct值介于32至35之間為臨界值，需重新檢測(cè)。
6. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)MyD88基因突變的檢測(cè)試劑盒，待檢測(cè)樣品包括新鮮病理 組織、石蠟包埋病理組織、石蠟切片和血液。
7. -種用于檢測(cè)MyD88基因突變的引物和探針，其特征在于，由P-SEQ-I?P-SEQ-22 的寡核苷酸引物和探針或序列與其有至少70%同一性的寡核苷酸組成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種采用熒光定量PCR檢測(cè)基因突變的方法，特別涉及一種MyD88基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可在突變含量只有0.1％的臨床樣本中檢測(cè)出低至5個(gè)拷貝的突變DNA。本發(fā)明的方法包括：設(shè)計(jì)特異性引物和探針；配制熒光定量PCR反應(yīng)體系和設(shè)計(jì)反應(yīng)條件；利用特異性引物擴(kuò)增樣品中的突變基因靶序列；利用探針和擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，檢測(cè)反應(yīng)體系中FAM和HEX熒光信號(hào)強(qiáng)度作為結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本試劑盒檢測(cè)速度快，只需90分鐘即可完成檢測(cè)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104531875
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410849417
【發(fā)明人】邱英華, 周細(xì)武
【申請(qǐng)人】寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日