用于乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子檢測的熒光生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于傳感器領域，具體涉及用于乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子檢測的熒光生物傳感器。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著分子生物學等新技術的發(fā)展，在腫瘤疾病的研宄中，腫瘤標記物的檢測已受到許多學者的關注。腫瘤標記物是指腫瘤發(fā)生及其增殖過程中由腫瘤細胞合成的、釋放或宿主細胞對腫瘤反應而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，常以抗原、酶、激素等代謝產(chǎn)物的形式存在。已有研宄發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生和進展過程與血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)有著密切的聯(lián)系，通過檢測它的水平對乳腺癌的監(jiān)測、判斷預后、治療等有重要的意義。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種重要的調(diào)節(jié)血管生成的因子，由于腫瘤在生長增殖過程中，促進大量新生血管的形成，由于這些新生血管具有管壁薄和基底膜不完整等生理特點，為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移提供了基礎條件，因此VEGF在腫瘤血管的形成、生長、轉(zhuǎn)移過程中有著重要的作用，是重要的乳腺癌腫瘤標記物之一。常用的檢測方法是酶聯(lián)免疫法，但是這種方法存在著具有成本高，操作繁瑣等缺點，因此有必要尋找一種更加準確、靈敏、經(jīng)濟、簡便、無創(chuàng)的檢測新技術來檢測這一腫瘤標記物。
[0003]核酸適體(aptamer)是通過一種指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)經(jīng)體外篩選所到的寡聚核苷酸，它是一種單鏈的DNA或RNA，具有類似于抗體的功能，能識別特異性的靶分子，例如蛋白質(zhì)、小分子、甚至整個細胞等。由于核酸適體具有分子量小、易于修飾和標記、化學穩(wěn)定性、靶標分子范圍廣好等優(yōu)點，科研工作者們開始對基于核酸適體的生物傳感器進行了大量的研宄，發(fā)現(xiàn)它在生物醫(yī)學領域的研宄和臨床診斷顯示出很好的應用前景。特別是Ronit Freemand等人篩選出VEGF的核酸適體并將其應用在生物傳感器的研制上，為腫癌標記物VEGF高靈敏度檢測提供了一種新的思路。
[0004]下面所述的為本發(fā)明人率先將具有簡便、靈敏、經(jīng)濟等優(yōu)點的熒光生物傳感器用于快速檢測乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子，并設計出一種測定乳腺癌蛋白的熒光生物傳感器:當靶分子VEGF不存在時，DNA探針與銀離子結合形成發(fā)夾結構，碳化氮納米材料的熒光信號不受影響；當靶分子VEGF存在時，DNA探針與VEGF結合形成G-四鏈體結構，探針的發(fā)夾結構被打開，銀離子釋放出來，猝滅碳化氮納米材料的熒光信號。通過DNA探針對VEGF的識別作用，從而建立了高靈敏度、高特異性的乳腺癌蛋白檢測方法，有望應用于乳腺癌的早期診斷及篩選抗腫瘤新藥工作中，因而本發(fā)明具有巨大的潛在應用價值和深遠的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子檢測的熒光生物傳感器。該熒光生物傳感器制備方法簡單，所制得的傳感器用于乳腺癌的檢測時，靈敏度高。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案: 一種用于乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子檢測的熒光生物傳感器，包括碳化氮納米材料、銀離子、DNA 探針，所述的 DNA 探針基因為:5’ -CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3’ ；其中基因片段5’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3’是VEGF的核酸適體部分，可在VEGF存在時折疊成G-四鏈體結構；銀離子、DNA探針混合反應形成發(fā)夾結構，加入到碳化氮納米材料溶液中，測其熒光；然后該體系在靶分子血管內(nèi)皮生長因子的誘導下，DNA探針與革巴分子結合形成G-四鏈體結構，發(fā)夾結構打開，銀離子被釋放出來，猝滅碳化氮納米材料的焚光信號。
[0007]一種制備如上所述的用于乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子檢測的熒光生物傳感器的方法，包括以下步驟:
1)碳化氮納米材料的制備:將2mL甲酰胺置于微波管中，160~180°C下反應30 min，用雙蒸水洗3~4遍，真空干燥8 h后，用去離子水溶解，超聲剝離24 h;將得到的液體以15000r/min離心I h，取上清液得碳化氮納米片混懸液；
2)將10yL 10 mmol/L的硝酸銀溶液和50 yL I μ mol/L的探針基因混合，并加入3-嗎啉丙磺酸緩沖液稀釋至100 μ L，混勻，反應I h ；
3)將步驟2)的混合體系加入到900UL的碳化氮納米片溶液中，混勻，檢測其熒光強度，即得熒光傳感器。
[0008]所制得的熒光生物傳感器，用于乳腺癌的早期診斷時，對血管內(nèi)皮生長因子的檢測限為 3.5 pmol/Lo
[0009]本發(fā)明通過對探針基因的設計，將3’末端和5’末端含有胞嘧啶(C)和能在VEGF誘導下折疊成G-四鏈體結構的特殊序列的探針基因與硝酸銀溶液混合，通過C-Ag+-C的共價結合方式將探針基因折疊成發(fā)夾結構；當靶分子存在時，探針基因與靶蛋白結合形成G-四鏈體結構，發(fā)夾結構打開并釋放出銀離子，銀離子與碳化氮納米材料結合猝滅其熒光，實現(xiàn)了對乳腺癌的早期診斷。該方法對VEGF的檢測限為3.5 pmol/Lo
[0010]本發(fā)明的有益效果在于:
1)本發(fā)明的熒光傳感器不含對人體有毒、污染環(huán)境的材料，穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，抗環(huán)境中其它常見離子干擾的能力強，而且傳感器易于制備；
2)本發(fā)明利用碳化氮納米材料在銀離子、探針基因和VEGF存在下的熒光猝滅-恢復的性質(zhì)，制得熒光生物傳感器；該傳感器實現(xiàn)了對VEGF的靈敏特異性檢測，提供了一種更加準確、靈敏、經(jīng)濟、簡便、無創(chuàng)的檢測新技術，具有巨大的應用前景。
【附圖說明】
[0011]圖1是碳化氮納米材料的光譜圖，㈧為紫外光譜，(B)為熒光光譜；
圖2是碳化氮納米材料的激發(fā)發(fā)射光譜；
圖3為加入銀離子或不同的VEGF后碳化氮納米材料熒光信號的變化；圖中:(a)碳化氮納米材料的熒光信號，Cd)碳化氮納米材料中加入銀離子的熒光信號，(b)碳化氮中加入銀離子和探針基因后的熒光信號，(c)碳化氮中加入銀離子和探針基因后再加入靶標蛋白的焚光信號；
圖4為本發(fā)明的熒光信號檢測圖。
【具體實施方式】