一種人k-ras基因突變熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明提供一種人K-RAS基因突變熒光PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 臨床上革E1向藥物愛必妥（Erbitux，西妥昔單抗）和帕尼單抗（Panitumumab)僅 適用于無突變的K-RAS基因野生型患者，對K-RAS突變患者無效。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡 (NCCN)將K-RAS檢測列入《結(jié)腸癌臨床治療指南》。
[0003] K-RAS基因是公認的癌基因，最早2008年6月在美國臨床腫瘤學會（ASCO)年會 上發(fā)布了臨床研宄結(jié)果，即K-RAS突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良 反應的危險和治療費用；而K-RAS野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益。同年10 月，K-RAS基因突變檢測被寫入最新版（2008年第3版）《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡（NCCN) 結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。該指南明確指出兩點，一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應檢測 K-RAS基因狀態(tài)，二是只有K-RAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑（如西妥昔單抗和帕 尼單抗）治療。另外，《09年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：當K-RAS基因如 果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)進行分子靶向 治療。
[0004] K-RAS基因的點突變（pointmutation)通常導致K-RAS從原癌基因 (proto-oncogene)向癌基因（oncogene)的轉(zhuǎn)化。這樣的功能改變對細胞的影響是多方面 的，因為K-RAS參與了許多控制細胞分裂與死亡的信號傳導路徑。目前研制的抗腫瘤藥物 正是針對這樣的K-RAS依賴性路徑。然而，此類藥物要應用于臨床還得進行許多研宄才能 實現(xiàn)。具有突變的K-RAS在如下器官的惡性腫瘤中已得到鑒定：胰腺（90% )、結(jié)腸（50% )、 肺（30%)、甲狀腺（50%)、膀胱（6%)、卵巢（15%)、乳腺、皮膚、肝臟、腎臟、某些類型的 白血病（leukemias)。在將來，有可能使用K-RAS來鑒定某些惡性腫瘤。胰腺腫瘤一直難于 診斷，但是在隨糞便排出的胰腺細胞的DNA里，將K-RAS基因突變鑒定出來，則可幫助臨床 醫(yī)師鑒別胰腺炎與胰腺癌。
[0005] 隨著人類醫(yī)學和藥物研宄水平的提高，藥理遺傳學（Pharmacogenetics)日漸興 起。研宄表明，藥物在體內(nèi)的代謝、藥物治療的有效性以及副反應、甚至患者的預后都存在 個體差異，受患者基因背景的影響。因此，應用藥理遺傳學，在基因水平上研宄藥物作用的 個體差異，使得個性化治療這一新一代醫(yī)學概念成為可能。對藥物作用相關(guān)基因的檢測，可 指導醫(yī)生對患者準確施藥，規(guī)避藥物副作用，同時提高病人乃至社會的醫(yī)療費用效率。
[0006] 隨著分子生物學的飛速發(fā)展，越來越多的分子生物學方法應用于檢測人K-RAS基 因突變，主要包括測序、基因芯片、探針雜交技術(shù)等。而隨著FQ-PCR技術(shù)的發(fā)展，其在人 K-RAS基因突變診斷領域的應用已越來越廣泛，也越來越為人所重視，人K-RAS基因突變的 實驗診斷中，實時熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu)點顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越 性。
[0007] 而基于熒光PCR技術(shù)與等位基因特異性PCR技術(shù)（ARMS-PCR)結(jié)合檢測人K-RAS 基因突變的方法被越來越多的研發(fā)人員嘗試使用。實時熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅 速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按 照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的 動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平，試驗結(jié)束后可通過軟件自動分析獲得擴增 曲線，根據(jù)擴增曲線與熒光閾值線的交點（即Ct值）以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽 性結(jié)果。等位基因特異PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活 性，在一定條件下PCR引物3末端的錯配導致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設計 適當?shù)囊锟梢酝ㄟ^PCR方法直接達到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。
[0008] 國內(nèi)已有多種基于實時熒光定量PCR技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)檢測人K-RAS基因突 變的試劑盒應用于臨床檢測中，然而此方法有很多不足之處：1)對于野生型背景的耐受能 力差，例如僅能耐受l〇ng野生型核酸的干擾，且經(jīng)常出現(xiàn)假陽性；2)沒有設置陽性內(nèi)對照 (即內(nèi)標），無法監(jiān)控假陰性；3) -般沒有預防PCR產(chǎn)物污染的措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有人K-RAS基因突變熒光PCR檢測試劑盒的缺陷，提供 一種操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬的人K-RAS基因突變熒光PCR檢測試 劑盒。應用該試劑盒，可以對臨床石蠟切片等樣本中的人K-RAS基因突變進行快速檢測，為 診斷相關(guān)腫瘤治療提供可靠的實驗依據(jù)。
[0010] 因此，本發(fā)明提供一種人K-RAS基因突變熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包 含檢測其第12位和第13位密碼子上的Glyl2Asp突變、Glyl2Val突變、Glyl2Ser突變、 Glyl2Cys突變、Glyl2Ala突變、Glyl2Arg突變和Glyl3Asp突變的上游引物序列K-M1、 K-M2、K-M3、K-M4、K-M5、K-M6 和K-M7 的七種PCR反應液，
【主權(quán)項】
1. 一種人K-RAS基因突變巧光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含檢測 其第12位和第13位密碼子上的Glyl2Asp突變、Glyl2Val突變、Glyl2Ser突變、Glyl2切S 突變、Glyl2Ala突變、Glyl2Arg突變和Glyl3Asp突變的上游引物序列K-M1、K-M2、K-M3、 K-M4、K-M5、K-M6 和 K-M7 的^;：種 PCR 反應液， K-M1 為；5, -ATAAACTTGTGGTAGTTGGACCAGA-3，， K-M2 為；5, -AAACTTGTGGTAGTTGGACCAGC-3，， K-M3 為；5, -AATATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATA-3，， K-M4 為；5, -AATATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATT-3，， K-M5 為；5, -ATATAAACTTGTGGTAGTTGGATCAGT-3，， K-M6 為；5, -TATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATC-3，， K-M7 為；5, -TTGTGGTAGTTGGAGCTTGAGT-3,。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，每種PCR反應液中還均包含檢測人 K-RAS基因突變的下游引物序列K-R和探針序列K-P， K-R 為；TATCTGTATCAAAGAATGGTCCTGC， K-P 為；CCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含內(nèi)標序列，且在 每種PCR反應液中還包含檢測內(nèi)標的上游引物序列GB-F、下游引物序列GB-R和探針序列 GB-P， 內(nèi)標序列為；5 ' -AAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTT GCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGAC-3^ ； GB-F ;5> -AAGTGCTCGGTGCCTTTAGTG-3>， GB-R ;5> -GTCCCATAGACTCACCCTGAAGT-3， GB-P ;5'-肥X-CCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAG-B冊1-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括預防PCR產(chǎn)物 污染的酶混合液，所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶1U/ y 1?抓/ y 1和尿喀晚DNA糖 基化酶0. 05U/ y 1?0. 2U/ y 1 ;且在所述PCR反應液中還包含加TP。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括K-RAS陽性對 照和K-RAS陰性對照。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人K-RAS基因突變熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包含檢測其第12位和第13位密碼子上的Gly12Asp突變、Gly12Val突變、Gly12Ser突變、Gly12Cys突變、Gly12Ala突變、Gly12Arg突變和Gly13Asp突變的上游引物序列K-M1、K-M2、K-M3、K-M4、K-M5、K-M6和K-M7的七種PCR反應液。本發(fā)明提供的試劑盒在100ng/反應的野生型人DNA背景下無擴增信號，不出現(xiàn)假陽性情況，說明本發(fā)明試劑盒的特異性好、抗干擾能力強。應用該試劑盒，可以對臨床石蠟切片等樣本中的人K-RAS基因突變進行快速檢測，為診斷相關(guān)腫瘤治療提供可靠的實驗依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104531881
【申請?zhí)枴緾N201510011444
【發(fā)明人】戴立忠, 吳康, 龍鳳英, 高堂杰
【申請人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月9日