維氏氣單胞菌快速檢測(cè)引物、試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)引物、試劑盒及應(yīng)用，屬于水產(chǎn)病原菌快 速檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 維氏氣單胞菌（Aeromonasveronii)也稱為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維 隆氣單胞菌，是一類革蘭氏陰性桿菌。是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和鑒定的一種氣單胞菌。維氏氣單胞 菌是一種人畜共患的條件致病菌，近年來(lái)在淡水養(yǎng)殖魚類中，如鯰、鯉、錦鯉、中華鱉、河蟹 等有受維氏氣單胞菌感染的報(bào)道，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于魚類維氏氣 單胞菌的檢測(cè)，主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定，血清學(xué)反應(yīng)及PCR檢測(cè)技術(shù)，細(xì)菌分離鑒定 耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，多以殺死水產(chǎn)動(dòng)物為前提，操作復(fù)雜，需要專業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，養(yǎng) 殖生產(chǎn)中急需一種能夠應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的、快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的維氏氣單胞菌檢測(cè)技術(shù) 及其產(chǎn)品。
[0003] LAMP技術(shù)是由Notomi等于2000年首次建立的體外鏈置換核酸擴(kuò)增的方法，近年 來(lái)被廣泛研宄、應(yīng)用。它利用靶序列上6個(gè)關(guān)聯(lián)區(qū)域設(shè)計(jì)的4條特異引物和1種高活性鏈 置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase)，在等溫條件（60?65°C)放置30?60min即可完 成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)液中加入核酸染料SYBRGreenI或鈣黃綠素，若有核酸擴(kuò)增即可顯 示顏色反應(yīng)，即時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)具有快速高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)、 操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前尚未有關(guān)于維氏氣單胞菌LAMP檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)引物。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試 劑盒。
[0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供檢測(cè)過程能夠快速有序進(jìn)行，2h內(nèi)即可完成所有檢測(cè) 操作，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作規(guī)范，對(duì)魚體損傷小的、操作簡(jiǎn)便不易出錯(cuò) 的一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 維氏氣單胞菌快速檢測(cè)引物，其特征是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQ IDNO. 1所示的外引物上游引物和SEQIDNO. 2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物 由SEQIDNO. 3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQIDNO. 4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0009] 一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒，包括：
[0010] (1)TE緩沖液，其組成為 20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶齊IJ是蒸餾水，pH= 8. 0 ；
[0011] (2)BstDNA聚合酶：濃度為8U/y1的BstDNA聚合酶；
[0012] (3)LAMP反應(yīng)液，24y1LAMP反應(yīng)液的組成為：2. 5y1 10X反應(yīng)緩沖液；3y1濃 度為2. 5mmol/L的dNTP;lyl濃度為5ymol/L的由SEQIDNO. 1所示的外引物上游引物，lul濃度為5ymol/L的由SEQID勵(lì).2所示的外引物下游引物，1^1濃度為40錢〇1/1 的由SEQIDNO. 3所示的內(nèi)引物上游引物，lyl濃度為40ymol/L的由SEQIDNO. 4所示 的內(nèi)引物下游引物；1u1鈣黃綠素與錳離子形成的配合物、13. 5y1DEPC水；
[0013] (4)陽(yáng)性對(duì)照膜片，用下述方法制成：吸取維氏氣單胞菌培養(yǎng)液將FTA膜片充分潤(rùn) 濕后室溫干燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管中震蕩洗滌2次，每次3?5min，充分干 燥；
[0014] (5)陰性對(duì)照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水將FTA膜片充分潤(rùn)濕后室溫干 燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管震蕩洗滌2次，每次3?5min，充分干燥；
[0015] (6)無(wú)菌封裝的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗滌管，檢測(cè)管。
[0016] 上述一種維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0017] (1)取待檢魚脾、魚腎或魚肝加入盛有200y1TE緩沖液的采集管中，研磨棒研磨 至漿狀；
[0018] (2)用吸管吸取步驟（1)獲得的漿狀物或魚血液或維氏氣單胞菌液，將FTA膜片充 分潤(rùn)濕后室溫干燥；放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管中震蕩洗滌2次，每次3?5min， 充分干燥；
[0019] (3)將步驟⑵獲得的膜片和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照膜片、一個(gè)陰性對(duì)照膜片分別放入盛 有24ylLAMP反應(yīng)液的檢測(cè)管中，每個(gè)檢測(cè)管中分別加入lylBstDNA聚合酶，混勾，置于 60-65°C條件下保溫40?60min，得到檢測(cè)液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；
[0020] (4)陰性對(duì)照呈橙色，陽(yáng)性對(duì)照呈綠色，根據(jù)檢測(cè)液顏色判斷是否含有維氏氣單胞 菌。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (1)本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)維氏氣單胞菌周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn) 場(chǎng)檢測(cè)等問題，使檢測(cè)過程能夠快速有序進(jìn)行，2h內(nèi)即可完成所有檢測(cè)操作，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過 程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作規(guī)范，不易出錯(cuò)。
[0023] (2)本發(fā)明依據(jù)維氏氣單胞菌基因所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物能有效檢測(cè)維氏氣單胞菌， 具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0024] (3)采用內(nèi)置染料的方法，反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管，取出后直接肉眼觀察結(jié) 果，避免了被擴(kuò)增產(chǎn)物污染后續(xù)待檢樣品，提高了該試劑盒的應(yīng)用可靠性。
[0025] (4)基于對(duì)取樣方法的改進(jìn)，不經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)，僅需取少量魚類血液等樣品即可進(jìn) 行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了微創(chuàng)取樣，尤其適用于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚類。
【附圖說明】
[0026] 圖1為維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0027] 圖2為維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果圖。
[0028] 圖3為維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029] 圖4為維氏氣單胞菌快速檢測(cè)試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下面的實(shí)施例并不限制本發(fā)明，本 領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng) 視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明所用儀器及試劑：
[0032] 電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京三二八科學(xué)儀器有限公司；BstDNA聚合酶、10X反應(yīng)緩 沖液、dNTP購(gòu)自NEB公司；引物SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 均 由上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；鈣黃 綠素購(gòu)自SIGMA公司；FTA膜片購(gòu)自通用電氣醫(yī)療公司（GEhealthcare) ;EDTA、硫酸錳為國(guó) 產(chǎn)分析純。
[0033] 媽黃綠素與猛離子形成的配合物配比為〇. 〇5mmol/L媽黃綠素和0. 6mmol/L猛離 子。
[0034] 維氏氣單胞菌基因組DNA采用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒（天根的快速DNA提取檢 測(cè)試劑盒KG203)從純培養(yǎng)的維氏氣單胞菌菌液中提取。（維氏氣單胞菌是從患病劍尾魚脾 臟、腎臟中提取，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化特性分析及以16SrDNA為遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為 維氏氣單胞菌）
[0035] 本發(fā)明可用于檢測(cè)魚血液、魚肝臟、魚腎臟組織是否感染維氏氣單胞菌，也可用于 檢測(cè)水體中是否含有維氏氣單胞菌或某菌液是否為維氏氣單胞菌。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 維氏氣單胞菌快速檢測(cè)引物，是由外引物和內(nèi)引物組成，外引